Method Article

Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

DOI:

10.3791/68127

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July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

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Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos métodos para preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales (2D) entrelazados, reticulados y de cristal líquido a partir de proteínas purificadas.

Abstract

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Los materiales basados en el citoesqueleto de actina se investigan ampliamente como materiales celulares modelo para dilucidar los mecanismos físicos de la mecánica celular, como la regulación de la forma y la producción de fuerza, así como materiales poliméricos blandos intrigantes. En este método, detallamos la creación de ensamblajes basados en actina in vitro utilizando proteína purificada para estudios de microscopía de fluorescencia. Polimerizamos filamentos largos de actina en una cámara de muestra y utilizamos un depletante de polímero para agrupar los filamentos en una red bidimensional (2D) entrelazada contra una superficie pasivada con una capa de surfactante. La adición de filamentos de miosina II del músculo esquelético en presencia de trifosfato de adenosina (ATP) induce la contracción de la red de actina. Al agrupar los filamentos de actina con un reticulante, ajustamos la contractilidad del ensamblaje, pasando de un material que se dobla a un material que se desliza a microescala. Al reducir la longitud de los filamentos de actina a través de la copolimerización de la actina en presencia de la proteína de recubrimiento, ajustamos el material de ser una red 2D a un cristal líquido. La reticulación de filamentos cortos de actina dispersos da como resultado la formación de gotas de cristal líquido tridimensional (3D).

Introduction

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Los materiales biológicos activos subyacen a los procesos mecánicos en una variedad de procesos fisiológicos, incluido el transporte intracelular, la migración celular, la regulación de la forma celular y la generación de fuerza biológica 1,2,3. Los ensamblajes in vitro de sistemas de citoesqueletos, construidos a partir de componentes proteicos purificados y modificados para ensamblarse en tampón, son una herramienta establecida para caracterizar procesos biofísicos y bioquímicos fundamentales 4,5,6,7. Estos sistemas modelo simplificados permiten estudiar las proteínas sin la complejidad de los entornos celulares, lo que permite identificar las funciones de los componentes individuales. Además de apoyar los estudios biológicos fundamentales, los ensamblajes de citoesqueletos in vitro también se han desarrollado ampliamente como sistemas experimentales para investigar materiales cristalinos líquidos y activos o fuera de equilibrio 8,9,10,11,12,13,14,15.

La actina es un biopolímero clave en los ensamblajes del citoesqueleto que regulan la mecánica y la dinámica celular a través de las fuerzas motoras y de polimerización 3,16. Los experimentos de microscopía de fluorescencia permiten la visualización de los cambios estructurales de la red de actina durante procesos como la contracción impulsada por motor y la agrupación de actina mediante proteínas reticuladas. La obtención de imágenes de redes tridimensionales de actina a medida que son remodeladas por proteínas motoras incrustadas ha iluminado el papel de los reticulantes de actina para la contracción de la red y la formación de patrones 12,17,18,19. Sin embargo, las redes de actina cuasi-bidimensionales superan los desafíos de la obtención de imágenes con suficiente resolución espacio-temporal para capturar los cambios estructurales de la red. Además, las estructuras de actina cuasi-bidimensionales de alta densidad son un imitador más cercano de los ensamblajes celulares, como la corteza densa de actina de una célula20. Las estrategias para producir estructuras de actina cuasi-bidimensionales han incluido la unión de proteínas nucleantes de actina a un cubreobjetos21,22, el acoplamiento de actina a una superficie a través de moléculas enlazadoras 10,23,24, la formación de haces densos de actina unidos a perlas en una superficie de cubreobjetos25,26 y la concentración de filamentos de actina en una superficie de cubreobjetos con agentes de aglomeración molecular10,27.

Aquí, detallamos un método para crear ensamblajes basados en actina modelo reproducible y cómo modificarlo para preparar variaciones de redes activas a cristales líquidos cuasi-2D y gotas nemáticas. Hemos utilizado previamente métodos similares para estudiar la formación de gotas cristalinas líquidas separadas en fase de filamentos cortos de actina con adición de reticulante11, cambios en los modos de deformación de la red de actina generada por miosina II (por ejemplo, pandeo de filamentos o deslizamiento relativo) con reticulación de filamentos y conectividad28, diferencias en las fuerzas generadas por miosina II en haces de actina con espaciamiento y cumplimiento variables29, y el transporte de miosina II30. El uso de proteínas de reticulación y proteínas de recubrimiento de actina permite la variación sistemática de la longitud del filamento de actina y la arquitectura de ensamblaje.

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Protocol

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NOTA: Proteínas y etiquetado: A los efectos de este protocolo, se supone que el investigador comienza con existencias de proteínas purificadas, que se marcan con fluorescencia cuando es apropiado para la investigación de microscopía de fluorescencia. Estas proteínas pueden comprarse o purificarse y marcarse con fluorescencia en el laboratorio 31,32,33,34,35,36,37. En este protocolo, se utilizaron stocks de proteínas que han sido congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80 °C. Por lo general, las proteínas se pueden marcar a través de métodos similares. La proteína se puede etiquetar como un paso de purificación o a partir de un caldo congelado. Descongele las existencias de proteínas congeladas en hielo antes de proceder con el etiquetado. El siguiente es un método para marcar fluorescentemente la miosina II del músculo esquelético (miosina) con un fluoróforo funcionalizado con maleimida (adaptado de38).

1. Prepare miosina marcada con fluorescencia

  1. Comience con ~ 2 mL de miosina a una concentración de 5-10 mg / mL.
    NOTA: En este protocolo, se utilizó miosina II del músculo esquelético purificada a partir de músculo de pollo utilizando los métodos publicados35 . La miosina se almacena en el tampón de almacenamiento de miosina (25 mM de KPO4, 0,6 M de KCl, 10 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1 mM de ditiotreitol (DTT), pH 6,6), ya sea directamente después de la purificación o a partir de existencias congeladas. Es importante mantener la miosina fría en todo momento para evitar la pérdida de actividad motora.
  2. Añadir DTT a la solución de miosina descongelada hasta una concentración final de 10 mM. Utilice una solución madre de TDT de 1 M para limitar el volumen.
    NOTA: El DTT reduce el grupo tiol en las cisteínas en la proteína miosina, preparándolas para reaccionar con la maleimida para su marcaje.
  3. Para evitar interferencias con la reacción de etiquetado, retire el DTT mediante dialización durante la noche en 50 mM de HEPES, 500 mM de KCl, 1 mM de EDTA, pH 7,6, a 4 °C.
  4. Después de la diálisis, centrifugar la solución de miosina a 100.000 x g a 4 °C durante 15 min para granular los agregados. Recoge el sobrenadante.
  5. Determine la concentración de miosina en el sobrenadante utilizando un espectrofotómetro. Estime la concentración de miosina utilizando un coeficiente de extinción a 280 nm de ~148.000 M-1 cm-1 para la miosina del músculo esquelético38. Este coeficiente de extinción supone que un "monómero" consta de una cadena pesada, una cadena ligera esencial y una cadena ligera reguladora.
  6. Prepare el fluoróforo para la reacción de marcado resuspendiendo el fluoróforo en polvo en dimetilsulfóxido seco (DMSO) a una concentración de 5 mM de fluoróforo.
    NOTA: Cualquier fluoróforo con un grupo reactivo a la maleimida debería funcionar. Se utilizó maleimida Alexa 647. El DMSO es higroscópico y acumula agua. El DMSO "seco" se refiere al DMSO que se ha almacenado en un entorno para evitar la acumulación de agua. Para asegurarse de que el disolvente es DMSO seco, se utilizó una ampolla de DMSO recién abierta para este paso. No ponga soluciones de DMSO en hielo. El DMSO tiene un punto de fusión de 19 °C, por lo que debe estar a temperatura ambiente (o ligeramente más caliente) para pipetear39.
    PRECAUCIÓN: El DMSO puede penetrar los guantes, por lo que es una buena práctica usar guantes de nitrilo dobles y tener cuidado de evitar derrames.
  7. Para preparar la miosina para agregar fluoróforo, retire brevemente la solución de miosina del hielo y deje que se caliente a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: No deje la miosina en RT durante más tiempo del necesario. Realice este paso después de que el fluoróforo esté suspendido en DMSO.
  8. Tan pronto como la solución de miosina esté cerca de RT, agregue la solución de fluoróforo a la miosina y mezcle rápidamente de modo que haya una proporción molar de 5:1 de fluoróforo: miosina. Coloque la solución de miosina en hielo tan pronto como se mezcle con el fluoróforo.
  9. Incubar en hielo durante 1 h, protegido de la luz, y luego detener la reacción añadiendo DTT a una concentración de 1 mM. Utilice un stock de TDT de 1 M para minimizar el volumen añadido.
  10. Elimine los fluoróforos sin reaccionar. Utilice cualquiera de los dos métodos que se describen a continuación:
    1. Opción 1:
      1. Polimerizar la miosina diluyéndola lentamente en un tampón F (10 mM de Imidazol, 50 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de EGTA, 4 mM de ATP, pH 7,5). Esto es aproximadamente una dilución de 10x, dependiendo del volumen de tinte agregado en el paso 1.8.
      2. Incubar en hielo durante 20 min. Centrifugar a 8.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4 °C durante 10 min para pelletizar.
      3. Deseche el sobrenadante que contiene colorante libre y vuelva a suspender/despolimerizar la miosina con el tampón de almacenamiento de miosina (del paso 1). Para eliminar cualquier resto de colorante, dialice en 5 mM de ácido 2-[4-(2-sulfoetil)piperazina-1-il]etanosulfónico (PIPES), 0,45 M de KCl, pH 7,0 (>100 veces el exceso de volumen) tres veces durante 15 min cada una utilizando una copa de diálisis de corte de 10 kD.
    2. Opción 2:
      1. Utilice una columna de desalinización para el intercambio de tampón en tuberías de 5 mM, 0,45 M de KCl, pH 7,0, con el protocolo estándar del fabricante de la columna.
  11. Estime la relación fluoróforo-proteína midiendo la concentración de miosina y fluoróforo con un espectrofotómetro, utilizando los coeficientes de extinción para la miosina a 280 nm y para el fluoróforo según lo informado por el fabricante. Una proporción de 2-4 es típica.
    NOTA: La miosina marcada ahora está lista para alícuotas de congelación instantánea en nitrógeno líquido. Las alícuotas se almacenan a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.

2. Opcional: Procedimiento para eliminar la miosina inactiva

NOTA: La miosina se puede usar directamente de una alícuota descongelada en experimentos, pero una fracción de la miosina estará inactiva. El siguiente procedimiento describe cómo eliminar la miosina inactiva. Este es un paso opcional, pero puede ser crucial para la reproducibilidad. Las alícuotas de miosina se utilizan durante aproximadamente 3 días después de la descongelación, almacenadas a 4 °C o en hielo.

  1. Polimerizar actina no marcada, estabilizada con faloidina:
    1. Mezcle 10 μL de tampón F 10x, 1 μL de ATP 100 mM y ddH2O de modo que el volumen final (incluida la actina en el paso 2.1.2) sea de 100 μL en un tubo de microcentrífuga.
    2. Añadir monómero de actina hasta una concentración final de 20 μM y mezclar con pipeta.
    3. Para estabilizar los filamentos de actina, agregue faloidina hasta una concentración final de 6,7 μM utilizando un stock de 100 μM de faloidina en una mezcla de metanol y pipeta.
      PRECAUCIÓN: La faloidina es una toxina40. Evite derrames y contaminación.
    4. Incubar en hielo durante 20 minutos para permitir que la actina se polimerice. Después de la polimerización, almacene la actina a 4 °C para futuras centrifugaciones.
  2. Pipeta mezcle 10 μL de actina estabilizada con faloidina, 3 μL de tampón F 10x, 0,3 μL de ATP de 100 mM, 6 μL de KCl 2 M y ddH2O hasta un volumen final de 30 μL (incluido el volumen asociado con la adición de miosina en el siguiente paso) en un tubo de microcentrífuga sobre hielo.
  3. Agregue miosina marcada con dimérico del caldo preparado a la concentración deseada, manteniendo una proporción molar de miosina a actina de ≤ 1:6.
  4. Centrifugar la solución resultante en frío (4 °C) a 100.000 x g durante 30 min. La miosina inactiva se unirá a los filamentos de actina y permanecerá unida. Los filamentos inactivos de miosina y actina formarán una bolita durante la centrifugación.
  5. Retire el sobrenadante (que contiene miosina activa) y guárdelo a 4 °C para su uso en experimentos.
  6. Estimar la concentración de miosina utilizando el mismo método espectrofotométrico para medir la concentración de miosina después del etiquetado.
    NOTA: A las concentraciones de proteínas y ATP que permanecen en el sobrenadante, el pico de absorbancia de 280 nm queda oscurecido por el pico de absorbancia de ATP de 260 nm, por lo que es más preciso medir la concentración a través de la absorbancia asociada con el fluoróforo o una medición de fluorescencia relativa.

3. Prepare la solución de surfactante

NOTA: La solución de surfactante también se puede comprar premezclada y lista para usar.

  1. Comience con un frasco de vidrio limpio. Enjuague el vial con agua y etanol para eliminar los posibles contaminantes del aceite, que es un solvente para el surfactante. Use viales de vidrio de borosilicato con una tapa revestida de politetrafluoroetileno (PTFE).
  2. Recoja de 5 a 20 mg de fluorosurfactante con la punta de una pipeta y deposítelo cerca del fondo de un vial de vidrio. Mida la cantidad de surfactante por peso utilizando una balanza con una precisión de submiligramos.
  3. Pipetear el volumen adecuado de aceite fluorado para hacer una solución de 2% en peso y cerrar el vial.
    NOTA: El aceite es volátil, así que cierre el vial inmediatamente después de medir.
  4. Vórtice a baja velocidad para mezclar.
    NOTA: La solución ahora se puede almacenar a 4 °C durante unas semanas. La edad y la calidad del surfactante pueden influir tanto en el apiñamiento como en la aparición de la actina. La actina que aparece moteada, adherida a la superficie o que no se acumula en la superficie puede indicar que es necesaria una solución de surfactante fresca. El almacenamiento bajo gas nitrógeno puede mejorar la vida útil.

4. Prepare la cámara de muestra (tres opciones)

NOTA: Esta sección proporciona un procedimiento para construir tres cámaras de muestras estándar utilizadas para preparar muestras para microscopía. Las dos secciones siguientes cubren la preparación de la muestra real y la pasivación de la cámara de muestras para la carga de muestras.

  1. Opción 1: Celda de flujo
    NOTA: Una celda de flujo simple es una forma estándar de hacer muestras de microscopio en muchos laboratorios. Para este protocolo, es especialmente adecuado para las muestras encerradas en gotas de emulsión. Puede ser difícil lograr campos de visión grandes y planos con el recubrimiento de superficie surfactante descrito en este protocolo, por lo que para muestras 2D, las opciones 2 y 3 suelen ser más reproducibles. La geometría del canal también puede causar una mezcla desigual de los componentes agregados en momentos posteriores, como la miosina.
    1. Coloque 2 piezas de cinta adhesiva de doble cara paralelas entre sí a lo ancho del portaobjetos del microscopio para formar los límites del canal de la celda de flujo. El canal formado entre las dos piezas de cinta debe tener aproximadamente 2 mm de ancho.
      NOTA: Los canales más pequeños ayudan a evitar que las emulsiones se atasquen en la parte inicial del canal. Para hacer un buen sellado, use trozos de cinta adhesiva un poco más largos que el ancho del portaobjetos de vidrio y recorte después de construir la celda de flujo.
    2. Coloque el cubreobjetos sobre el canal de la cinta. Asegúrese de que el cubreobjetos esté perpendicular al portaobjetos del microscopio. Utilice un cubreobjetos de 30 mm x 40 mm para este propósito, ya que proporciona un pequeño voladizo cuando se coloca en un portaobjetos.
    3. Para crear un buen sellado y eliminar las bolsas de aire entre la cinta y el cubreobjetos, presione hacia abajo el área del cubreobjetos que está en contacto con la cinta adhesiva de doble cara.
      NOTA: Tenga cuidado de no romper el cubreobjetos mientras presiona alrededor de los bordes. Frotar el área con un objeto redondeado, como el extremo de un marcador tapado, funciona bien para presionar la cinta.
    4. Con una cuchilla de afeitar, recorte el exceso de cinta adhesiva del portaobjetos y el cubreobjetos del microscopio, de modo que la única cinta visible quede dentro del canal de muestra.
      NOTA: Tenga cuidado al completar este paso, ya que es fácil romper accidentalmente el cubreobjetos al intentar quitar la cinta.
  2. Opción 2: Cilindro en un cubreobjetos sin tratar
    NOTA: Esta opción es adecuada para muestras planas 2D. Es conveniente para agregar componentes en diferentes momentos durante los experimentos de microscopía. Esta cámara de muestra no debe usarse para emulsiones, que crean crema en lugar de sedimentar, lo que dificulta la obtención de imágenes.
    1. Enjuague el cubreobjetos y el cilindro de clonación de vidrio con agua, etanol y agua. Secar al aire.
    2. Con una capa delgada de epoxi de 5 minutos, adhiera el cilindro de clonación de vidrio al cubreobjetos.
      NOTA: Es útil aplicar fuerza al cilindro mientras el epoxi se seca colocando un objeto limpio encima del cilindro. Una pequeña tapa de placa de Petri o la caja de cubreobjetos pueden funcionar bien.
  3. Opción 3: Cilindro sobre cubreobjetos recubiertos de silano
    NOTA: Esta opción da como resultado reproducible una región plana grande en el centro de la cámara y reduce el flujo a granel de la muestra. Para lograr esto, se creó una región hidrofóbica que está rodeada por una región hidrofílica en el cubreobjetos, lo que da como resultado una muestra final que tiene una red de actina en una región pasivada y confinada donde la actina está anclada a las regiones hidrófilas en el borde de la cámara. Esta cámara de muestra no debe usarse para emulsiones, que crean crema en lugar de sedimentar en el tampón, lo que dificulta la obtención de imágenes.
    1. Prepare los cubreobjetos con un recubrimiento de silano para hacerlos hidrófobos.
      1. Cargue los cubreobjetos de vidrio limpios en un estante de acero inoxidable. Prelimpie el vidrio por sonicación en detergente o etanol si lo desea.
      2. En una placa de vidrio para teñir, diluya el trimetoxi(octil)silano hasta una solución al 2% en isopropanol.
      3. Sumerge los cubreobjetos en la solución durante 10 min.
      4. Para enjuagar, reemplace la solución con agua. Levante y vuelva a sumergir los bastidores de cubreobjetos seis veces. Repita el proceso cuatro veces más con intercambios de agua en el medio.
      5. Cubra las rejillas con papel de aluminio para proteger las fundas del polvo y séquelas a 25-30 °C.
    2. Coloque un cubreobjetos tratado con octilsilano en el fondo de una placa de Petri de vidrio o cualquier otro recipiente de vidrio abierto que quepa en el limpiador de ozono ultravioleta (UV).
    3. Con unas pinzas, coloque un cuadrado de PTFE de 2 mm x 2 mm (cortado de una hoja) sobre el cubreobjetos que actuará como mascarilla para el siguiente tratamiento con ozono UV.
    4. Trate el cubreobjetos con ozono UV durante 10 min. Este proceso hace que el vidrio sea hidrófilo en las regiones expuestas que no están cubiertas por la máscara de PTFE.
    5. Retire con cuidado el plato sin alterar el cubreobjetos o el cuadrado de PTFE. Adherir un cilindro de clonación de vidrio al cubreobjetos con epoxi de 5 minutos. Asegúrese de que el cilindro rodee el cuadrado de PTFE, que se puede quitar con pinzas después de que se seque el epoxi.
      NOTA: El cuadrado de PTFE puede ser reutilizado en futuros experimentos.

5. Montaje de la red de actina

NOTA: Lo siguiente es para la preparación de una muestra de 50 μL. En el caso de las muestras en cilindro, un volumen mayor puede reducir los efectos del menisco y aumentar la estabilidad de la muestra.

  1. A un tubo de microcentrífuga, añadir 5 μL de tampón 10x F, ddH2O necesarios para llevar el volumen final a 50 μL, 1 μL de beta-mercaptoetanol al 25 % en volumen, 1 μL de 225 mg/mL de glucosa, 1 μL de una mezcla de glucosa oxidasa (135 mg/mL) y catalasa (85.000 unidades/mL), 1 μL de 25 mM de ATP, y 10 μL de metilcelulosa con 2 % en peso de 15 centipoisa. Pipetear bien.
    NOTA: El beta mercaptoetanol es una toxina. Evite derrames y contaminación. Los reactivos glucosa oxidasa, catalasa, glucosa y beta-mercaptoetanol se encuentran en la muestra para crear un sistema de eliminación de oxígeno. La solución madre de metilcelulosa se prepara agitando a 4 °C y puede almacenarse a 4 °C durante varias semanas. La metilcelulosa puede precipitar fuera de la solución y debe reprepararse si hay precipitado visible o si el apiñamiento de actina es escaso.
  2. Opcional: Agregue proteína de reticulación (proteína de reticulación 0.1-1 por cada 1 monómero de actina). Mezcla de pipetas.
    NOTA: También se pueden agregar proteínas de reticulación después de la polimerización de actina y dejar que se unan durante 10-20 minutos antes de agregar miosina. Esto es preferible para concentraciones de reticulantes que son lo suficientemente altas como para agrupar filamentos de actina: los haces se distribuyen de manera más uniforme y reproducible en la interfaz surfactante-agua. La cámara de muestras del cilindro es susceptible de agregar un reticulante después de que la actina se polimerice.
  3. Agregue faloidina (1 faloidina por cada 1-3 monómeros de actina), si lo desea. Mezcla de pipetas.
  4. En un tubo separado, mezcle la actina no etiquetada y la marcada de modo que cuando se agregue toda la mezcla de actina a la muestra de 50 μL, la concentración total sea de 2.64 μM. Use una proporción de 1 monómero de actina marcado por cada 9 monómeros de actina no marcados. Mezcla de pipetas.
    NOTA: Los monómeros de actina comenzarán a polimerizarse al agregarlos a la solución de muestra. La adición de la actina marcada y la actina no marcada por separado puede dar como resultado una actina que aparece moteada con regiones oscuras y fluorescentes a lo largo del contorno de un solo filamento. Las existencias de monómero de actina se mezclan para garantizar filamentos de actina marcados uniformemente. La purificación y el etiquetado de actina se describen en31.
  5. Opcional: Para hacer cristales líquidos u otros experimentos con filamentos cortos de actina, agregue proteína de taponamiento a la mezcla de actina del paso 5.4. La cantidad exacta de proteína de recubrimiento depende de la fracción activa de la proteína y de la longitud de los filamentos de actina a los que se dirige, pero por lo general, alrededor de 1-10% molar de proteína de recubrimiento (con respecto a la actina) es suficiente para crear filamentos cortos para experimentos de cristal líquido. La purificación de proteínas con recubrimiento se describe en36.
  6. Para comenzar a polimerizar la actina, agregue la mezcla de actina a la solución tampón F y la mezcla de pipetas.
  7. Deje que la actina se polymerice en el tubo de microcentrífuga en RT y luego agréguela a la celda de muestra después de 10-30 minutos.
  8. Opcional: Si prepara una muestra de cilindro, extraiga toda la solución en una punta de pipeta para que esté lista para pipetear en el paso 7.4 de la carga de la cámara de muestras del cilindro.

6. Opcional: Preparar emulsiones

NOTA: A veces es conveniente preparar estas muestras en emulsiones, que proporcionan una cámara de muestras confinada. Las emulsiones se preparan utilizando reactivos similares a los de Chowdhury et al., lo que da como resultado una fase continua de aceite que tiene gotas de emulsión acuosa mediadas por surfactante41. En presencia de un agente de agotamiento, como la metilcelulosa, utilizado en este protocolo, las muestras de actina se amontonarán en la interfaz acuosa de esta emulsión. Para las muestras en las que se basa este protocolo, no se observa una diferencia entre polimerizar la actina antes o después de agregarla a las emulsiones; Sin embargo, se ha reportado que el paso de polimerización es importante de considerar en algunos experimentos de encapsulación42.

  1. Añadir 3,5 μL de oleo-surfactante a un tubo de microcentrífuga. Utilice un tubo de microcentrífuga transparente, de color claro o transparente para este paso.
  2. Sin mezclar, agregue 5 μL de la solución de actina en la parte superior de la capa de aceite y surfactante. Cierre el tubo de la microcentrífuga.
  3. Mientras sostiene la parte superior del tubo de microcentrífuga, golpee el borde inferior del tubo para crear una espuma con emulsiones visibles inicialmente. Continúe moviendo el tubo hasta que la espuma no muestre características distinguibles cuando se ilumina a contraluz, lo que indica microemulsiones.
    NOTA: Al preparar una muestra en emulsiones, se debe tener lista una celda de flujo u otra cámara de muestras antes de hacer la muestra de actina. La cámara de muestras del cilindro de vidrio no funciona bien para las emulsiones, ya que se unirán a la interfaz de aire en lugar de sedimentar la superficie del cubreobjetos.

7. Cargue la cámara de muestras (cámaras cilíndricas)

  1. Pipetear 5 μL de solución de surfactante de aceite en el fondo de la cámara del cilindro de vidrio
    NOTA: Alternativamente, las muestras se pueden hacer pasivando la superficie con una bicapa lipídica soportada 11,29,30.
  2. Incline el cubreobjetos y gírelo lentamente para que la superficie del cubreobjetos y el cilindro inferior queden recubiertos con la solución de tensioactivo.
  3. Retire el exceso de solución de surfactante de aceite con una pipeta para obtener una capa de aceite lo más delgada posible sin permitir que el aceite, que es volátil, se evapore por completo.
  4. Añada inmediatamente la solución de muestra del paso 5.7 a la cámara.
  5. Cubra la cámara con un pequeño trozo de cinta de PTFE para evitar la evaporación y el flujo.

8. Alternativa: Cargue la cámara de muestras (celda de flujo)

  1. Para prepararse para cargar la celda de flujo, mezcle una pequeña cantidad de epoxi de 5 minutos. Una caída con un área inferior a 0,5cm2 suele ser suficiente.
  2. Para colocar la muestra en la celda de flujo, primero pipetee 1-3 μL de solución de surfactante de aceite en el canal de muestra de la celda de flujo para crear un pequeño tapón de solución que humedezca el canal.
  3. Pipetee inmediatamente un volumen de solución de muestra o suspensión de emulsión lentamente en la entrada de la celda de flujo para llenar el canal. Normalmente, para un canal de unos 2 mm, el volumen es de unos 8 μL. La entrada es el lado al que se añadió la solución de surfactante de aceite.
    1. Si el volumen de la muestra excede el volumen de la celda de flujo, absorba la muestra a través de la celda de flujo colocando una toallita sin pelusa o papel de filtro en el otro extremo del canal.
    2. Si el menisco de la solución de surfactante de aceite ha retrocedido, lo que resulta en un espacio de aire, primero incline la celda de flujo para eliminar el espacio de aire en la entrada antes de agregar la muestra.
  4. Si es necesario, agregue una solución adicional de aceite y surfactante hasta que ya no sea visible aire en el canal o para empujar la muestra (especialmente para emulsiones) más adentro del canal.
  5. Selle cada lado del canal con epoxi de 5 minutos (mezclado justo antes de cargar la celda de flujo).

9. Imagen y adición de miosina

  1. Monte la muestra en el microscopio e inicie la obtención de imágenes de lapso de tiempo de actina utilizando un objetivo de 20x, 40x, 60x o 100x con inmersión en aceite o agua para proporcionar una apertura numérica lo suficientemente grande para imágenes de alta resolución. Si polimeriza en la cámara de muestra, permita la polimerización durante ~ 30 min o hasta que ya no haya alargamiento o movimiento de filamento visible.
  2. Opcional: Agregue reticulante.
  3. Agregue miosina a través de las opciones 1 o 2 a continuación.
    1. Agregue miosina como un dímero pipeteado en la parte superior de la muestra (no es necesario mezclar porque el dímero de miosina se difundirá).
    2. Agregue miosina como filamentos prepolimerizados. La pipeta mezcla aproximadamente la mitad del volumen total muy lentamente para evitar perturbar la actina abarrotada.
      NOTA: El método ideal para que la miosina obtenga la densidad o el tamaño de filamento deseado en la superficie del cubreobjetos puede variar para diferentes arquitecturas de actina y debe determinarse experimentalmente.
  4. Inicie la creación de imágenes de lapso de tiempo.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se puede formar una amplia gama de ensamblajes de actina en sistemas modelo utilizando proteínas purificadas siguiendo la estrategia general descrita en estos métodos, donde la actina se polimeriza en filamentos en presencia de proteínas accesorias que modifican la arquitectura del ensamblaje (Figura 1). Cuando la actina se polimeriza en filamentos sin reticulantes ni proteínas de recubrimiento, forma redes de filamentos entrelazadas (Figura 1A). La adición de r...

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Discussion

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Hay muchas consideraciones para producir ensamblajes de actina reproducibles. Uno de los aspectos más críticos para producir datos reproducibles y analizables es la superficie del cubreobjetos de la cámara de muestras. Las proteínas en las muestras de actina in vitro, particularmente la miosina, son extremadamente pegajosas y se adhieren a las superficies de vidrio sin tratar o mal tratadas, lo que hace que la muestra sea inutilizable (Figura 5A). H...

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Disclosures

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Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgements

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Agradecemos a Todd Thorenson, Mike Murrell, Jennifer Ross, Patrick McCall y otros miembros de los laboratorios de Gardel y Kovar (Universidad de Chicago) por sus útiles discusiones durante el desarrollo de los métodos. M.A.C. y S.R. fueron parcialmente apoyados por la Facultad de Ingeniería, Computación y Ciencias Aplicadas de la Universidad de Clemson, y V.J.A. fue apoyado por Clemson Biophysics REU bajo el Premio NSF # 2349368 con fondos de los programas DBI y EPSCoR. Este trabajo también fue apoyado en parte por el Programa EPSCoR de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el Premio NSF #OIA-1655740, en parte por y en parte por el programa Clemson Creative Inquiry + Undergraduate Research.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubo de microcentrífuga de 0,6 mlFisher Scientific05-408-123
008-FluorosurfactanteRAN Biotechnologies00115081361-6525Solución alternativa a premezclada
008-FluoroSurfactante en HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfactante-2wtH-50GSolución premezclada
2-mercaptoetanol (β-mercaptoetanol)Sigma Aldrich63689Número CAS: 60-24-2
Solución madre: 25 mM en agua MilliQ, almacenada a 4 &°; C
4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etano-sulfónico (HEPES)Sigma AldrichH3375Número CAS: 7365-45-9
5 min EpoxiDevcon14250
ActinCytoskeleton, Inc.AKL99-A>99% puro de músculo esquelético de conejo
(alternativo a la purificación)
Actina (marcada con rodamina)Cytoskeleton, Inc.AR05-AMúsculo esquelético de conejo
(Alternativo a la purificación)
Adenosina 5′-trifosfato (ATP)Sigma AldrichA6419Número CAS: 34369-07-8
Solución madre: 25 mM en agua MilliQ, almacenar a -20 ° C
Mantener congelado para evitar la hidrólisis
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma AldrichC5670Número CAS: 10043-52-4
Proteína de recubrimiento (ratón)Purificado de la sobreexpresión en E.coli con un HisTag
Solución madre: 20 mM en tampón de proteína de tapado a -80 ° C
Catalasa de hígado bovinoSigma AldrichC9322Número CAS: 9001-05-2
Solución madre: 85 ku/mL, almacenar alícuota con glucosa oxidasa a -20° C
Cubierta de vidrioFisherbrand12544CBorosilicato, #1.5, 24 mm x 40 mm
Fisherbrand no Fisher Finest
D-(+)-GlucosaSigma AldrichG8270Número CAS: 50-99-7
Solución madre: 225 mg/mL en agua MilliQ, almacenar a -20 °
C Ditiotreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPNúmero CAS: 3483-12-3
Solución madre: 1 M en agua MilliQ, almacenar a -20 &grados; Cinta de
doble cara3M3136
Alcohol de etilo a prueba de 200 PHARMCO111000200Número CAS: 64-17-5
Prueba de 200
Etilenglicol-bis(2-aminoetileéter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)Sigma AldrichE3889Número CAS: 67-42-5
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma AldrichE9884Número CAS: 60-00-4
Glucosa OxidasaSigma Aldrich345386Número CAS: 9001-37-0
Solución madre: 135 mg/mL en agua MilliQ, almacenar alícuota con catalasa a -20 ° C
GlicerolSigma Aldrich356352MNúmero CAS: 56-81-5
ImidazolFisher Bioreactivos BP305-50Número CAS: 288-32-4
Cloruro de magnesio (MgCl2)Fisher Bioreagents BP214Número CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
MetilcelulosaSigma AldrichM0512Número CAS: 9004-67-5
15 centipoise
Portaobjetos de microscopio PlainElectron Microscopy Sciences/Gold Seal63710-05  3"x1", 1 mm de espesor
Agua MilliQMilliporeCUFBI001Agua ultrapura
Novec-7500 Fluido de ingeniería 3M7100134816Alternativa a la solución premezclada
Cloruro de potasio (KCl)Sigma AldrichP3911Número CAS: 7447-40-7
Fosfato de potasio (KPO4)Sigma AldrichP3786Número CAS: 7758-11-4
Polvo de acetona para el músculo esquelético del conejoPel-Freez Biologicals41995-1Se utiliza para purificar actina (alternativa a la compra)
Almacenar alrededor de 30 mM en actina Tampón G a -80 &grados; C
Azida de sodioSigma Aldrich71289Número CAS: 26626-22-8
Tetrametilrodamina-C6-maleimidaAnaSpecAS-81445Número CAS: 174568-68-4 Se utiliza para purificar actina (alternativa a la compra)
Almacenar alrededor de 30 mM en actina Tampón G a -80 °C. Se utiliza para etiquetar actina (alternativa a la compra)
Ácido clorhídrico Tris (Tris HCl)Sigma Aldrich648317Número CAS: 1185-53-1
Baño ultrasónicoEmerson Branson
C CPX2800H

References

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

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