Method Article

Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Summary

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Aquí, presentamos métodos para preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales (2D) entrelazados, reticulados y de cristal líquido a partir de proteínas purificadas.

Abstract

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Los materiales basados en el citoesqueleto de actina se investigan ampliamente como materiales celulares modelo para dilucidar los mecanismos físicos de la mecánica celular, como la regulación de la forma y la producción de fuerza, así como materiales poliméricos blandos intrigantes. En este método, detallamos la creación de ensamblajes basados en actina in vitro utilizando proteína purificada para estudios de microscopía de fluorescencia. Polimerizamos filamentos largos de actina en una cámara de muestra y utilizamos un depletante de polímero para agrupar los filamentos en una red bidimensional (2D) entrelazada contra una superficie pasivada con una capa de surfactante. La adición de filamentos de miosina II del músculo esquelético en presencia de trifosfato de adenosina (ATP) induce la contracción de la red de actina. Al agrupar los filamentos de actina con un reticulante, ajustamos la contractilidad del ensamblaje, pasando de un material que se dobla a un material que se desliza a microescala. Al reducir la longitud de los filamentos de actina a través de la copolimerización de la actina en presencia de la proteína de recubrimiento, ajustamos el material de ser una red 2D a un cristal líquido. La reticulación de filamentos cortos de actina dispersos da como resultado la formación de gotas de cristal líquido tridimensional (3D).

Introduction

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Los materiales biológicos activos subyacen a los procesos mecánicos en una variedad de procesos fisiológicos, incluido el transporte intracelular, la migración celular, la regulación de la forma celular y la generación de fuerza biológica 1,2,3. Los ensamblajes in vitro de sistemas de citoesqueletos, construidos a partir de componentes proteicos purificados y modificados para ensamblarse en tampón, son una herramienta establecida para caracterizar procesos biofísicos y bioquímicos fundamentales 4,5,....

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Protocol

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NOTA: Proteínas y etiquetado: A los efectos de este protocolo, se supone que el investigador comienza con existencias de proteínas purificadas, que se marcan con fluorescencia cuando es apropiado para la investigación de microscopía de fluorescencia. Estas proteínas pueden comprarse o purificarse y marcarse con fluorescencia en el laboratorio 31,32,33,34,35,36,37. En este protocolo, se utilizaron stocks d....

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Results

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Se puede formar una amplia gama de ensamblajes de actina en sistemas modelo utilizando proteínas purificadas siguiendo la estrategia general descrita en estos métodos, donde la actina se polimeriza en filamentos en presencia de proteínas accesorias que modifican la arquitectura del ensamblaje (Figura 1). Cuando la actina se polimeriza en filamentos sin reticulantes ni proteínas de recubrimiento, forma redes de filamentos entrelazadas (Figura 1A). La adición de r.......

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Discussion

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Hay muchas consideraciones para producir ensamblajes de actina reproducibles. Uno de los aspectos más críticos para producir datos reproducibles y analizables es la superficie del cubreobjetos de la cámara de muestras. Las proteínas en las muestras de actina in vitro, particularmente la miosina, son extremadamente pegajosas y se adhieren a las superficies de vidrio sin tratar o mal tratadas, lo que hace que la muestra sea inutilizable (Figura 5A). H.......

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Disclosures

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Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgements

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Agradecemos a Todd Thorenson, Mike Murrell, Jennifer Ross, Patrick McCall y otros miembros de los laboratorios de Gardel y Kovar (Universidad de Chicago) por sus útiles discusiones durante el desarrollo de los métodos. M.A.C. y S.R. fueron parcialmente apoyados por la Facultad de Ingeniería, Computación y Ciencias Aplicadas de la Universidad de Clemson, y V.J.A. fue apoyado por Clemson Biophysics REU bajo el Premio NSF # 2349368 con fondos de los programas DBI y EPSCoR. Este trabajo también fue apoyado en parte por el Programa EPSCoR de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el Premio NSF #OIA-1655740, en parte por y en parte por el p....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubo de microcentrífuga de 0,6 mlFisher Scientific05-408-123
008-FluorosurfactanteRAN Biotechnologies00115081361-6525Solución alternativa a premezclada
008-FluoroSurfactante en HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfactante-2wtH-50GSolución premezclada
2-mercaptoetanol (β-mercaptoetanol)Sigma Aldrich63689Número CAS: 60-24-2
Solución madre: 25 mM en agua MilliQ, almacenada a 4 &°; C
4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etano-sulfónico (HEPES)Sigma AldrichH3375Número CAS: 7365-45-9
5 min EpoxiDevcon14250
ActinCytoskeleton, Inc.AKL99-A>99% puro de músculo esquelético de conejo
(alternativo a la purificación)
Actina (marcada con rodamina)Cytoskeleton, Inc.AR05-AMúsculo esquelético de conejo
(Alternativo a la purificación)
Adenosina 5′-trifosfato (ATP)Sigma AldrichA6419Número CAS: 34369-07-8
Solución madre: 25 mM en agua MilliQ, almacenar a -20 ° C
Mantener congelado para evitar la hidrólisis
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma AldrichC5670Número CAS: 10043-52-4
Proteína de recubrimiento (ratón)Purificado de la sobreexpresión en E.coli con un HisTag
Solución madre: 20 mM en tampón de proteína de tapado a -80 ° C
Catalasa de hígado bovinoSigma AldrichC9322Número CAS: 9001-05-2
Solución madre: 85 ku/mL, almacenar alícuota con glucosa oxidasa a -20° C
Cubierta de vidrioFisherbrand12544CBorosilicato, #1.5, 24 mm x 40 mm
Fisherbrand no Fisher Finest
D-(+)-GlucosaSigma AldrichG8270Número CAS: 50-99-7
Solución madre: 225 mg/mL en agua MilliQ, almacenar a -20 °
C Ditiotreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPNúmero CAS: 3483-12-3
Solución madre: 1 M en agua MilliQ, almacenar a -20 &grados; Cinta de
doble cara3M3136
Alcohol de etilo a prueba de 200 PHARMCO111000200Número CAS: 64-17-5
Prueba de 200
Etilenglicol-bis(2-aminoetileéter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)Sigma AldrichE3889Número CAS: 67-42-5
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma AldrichE9884Número CAS: 60-00-4
Glucosa OxidasaSigma Aldrich345386Número CAS: 9001-37-0
Solución madre: 135 mg/mL en agua MilliQ, almacenar alícuota con catalasa a -20 ° C
GlicerolSigma Aldrich356352MNúmero CAS: 56-81-5
ImidazolFisher Bioreactivos BP305-50Número CAS: 288-32-4
Cloruro de magnesio (MgCl2)Fisher Bioreagents BP214Número CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
MetilcelulosaSigma AldrichM0512Número CAS: 9004-67-5
15 centipoise
Portaobjetos de microscopio PlainElectron Microscopy Sciences/Gold Seal63710-05  3"x1", 1 mm de espesor
Agua MilliQMilliporeCUFBI001Agua ultrapura
Novec-7500 Fluido de ingeniería 3M7100134816Alternativa a la solución premezclada
Cloruro de potasio (KCl)Sigma AldrichP3911Número CAS: 7447-40-7
Fosfato de potasio (KPO4)Sigma AldrichP3786Número CAS: 7758-11-4
Polvo de acetona para el músculo esquelético del conejoPel-Freez Biologicals41995-1Se utiliza para purificar actina (alternativa a la compra)
Almacenar alrededor de 30 mM en actina Tampón G a -80 &grados; C
Azida de sodioSigma Aldrich71289Número CAS: 26626-22-8
Tetrametilrodamina-C6-maleimidaAnaSpecAS-81445Número CAS: 174568-68-4 Se utiliza para purificar actina (alternativa a la compra)
Almacenar alrededor de 30 mM en actina Tampón G a -80 °C. Se utiliza para etiquetar actina (alternativa a la compra)
Ácido clorhídrico Tris (Tris HCl)Sigma Aldrich648317Número CAS: 1185-53-1
Baño ultrasónicoEmerson Branson
C CPX2800H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. ....

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Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

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