Una tarea de motricidad fina para estudiar la cinemática articular en un modelo preclínico de enfermedad neurodegenerativa

Resumen

El estudio actual describe una prueba de comportamiento motor fino para examinar los déficits motores en modelos de roedores, incluida la rata TgF344-AD, utilizando el aprendizaje automático.

Resumen

La disfunción motora es un componente crítico, aunque a menudo subestimado, de las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA) y las demencias relacionadas. Una nueva investigación ha demostrado que las tareas que involucran el comportamiento motor fino, la capacidad visoespacial y la función ejecutiva en humanos pueden tener potencial en la detección temprana de enfermedades. Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos exactos por los cuales estas tareas predicen el deterioro cognitivo y funcional asociado con la EA. En el método actual, se creó una tarea de motricidad fina, la Tarea de Capacidad Motora Cinemática (KINEMAT), para examinar los cambios en la capacidad motora a lo largo de la progresión de la enfermedad en modelos preclínicos de EA en relación con otras enfermedades neurodegenerativas y el envejecimiento normal utilizando un software de aprendizaje automático gratuito y de código abierto. Aquí, se estableció la prueba de concepto con el diseño, la prueba y la implementación de la tarea de motricidad fina en un estudio piloto de 344 ratas Fisher CDF con y sin discapacidades motoras inducidas por Harmaline. La validación adicional, con un modelo de rata con enfermedad de Alzheimer (TgF344-AD), demostró aún más la viabilidad del modelo y la sensibilidad de la tarea. Las ratas fueron entrenadas para alcanzar a través de una pequeña ranura en la parte delantera de la cámara para recuperar una bolita de azúcar de uno de los tres tazones con diferente dificultad. La recuperación de perdigones se puntuó utilizando una de tres clasificaciones: éxito (agarrar y comer con éxito la bolita de azúcar), caída (agarra pero deja caer la golosina al agarrarla) o fracaso (alcance en el que no se obtiene ninguna bolita, o las bolitas se sacan del recipiente al intentar agarrar). Se observaron diferencias significativas en la capacidad motora entre las ratas control y las tratadas con harmalina, demostradas por la reducción de los alcances totales y el aumento de la variabilidad de la postura de las patas. Las ratas TgF344-AD también mostraron alcances totales reducidos, así como éxitos reducidos en todos los tazones. Al validar esto como una tarea de motricidad fina en roedores, tiene potencial futuro para estudiar el envejecimiento normal y los modelos preclínicos de enfermedades neurodegenerativas, incluida la EA, a medida que la patología y los síntomas surgen con el tiempo.

Introducción

Se ha demostrado que la función motora está deteriorada en personas con demencia debido a la enfermedad de Alzheimer (EA) u otros subtipos (por ejemplo, demencia con cuerpos de Lewy). La fuerza de agarre y la velocidad de la marcha pueden distinguir entre adultos mayores con deterioro cognitivo y no con deterioro^{cognitivo 1,2}, pero no necesariamente pueden diferenciar entre diferentes subtipos de demencias (es decir, baja especificidad)^1,2. Por lo tanto, sigue siendo necesario contar con nuevas herramientas diagnósticas para la demencia temprana, posiblemente combinadas con el aprendizaje automático, para evaluar patrones complejos y relaciones entre el comportamiento y el estado de la enfermedad ^3,4. Los modelos animales son valiosos para investigar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas y ofrecer información sobre el inicio temprano de la enfermedad, las correlaciones conductuales y la integración del aprendizaje automático en los canales de análisis para distinguir entre la gravedad y la presentación ^5,6,7.

Los nuevos métodos conductuales en humanos han identificado tareas que involucran la habilidad motora fina junto con el procesamiento cognitivo, como la capacidad visoespacial y la función ejecutiva ^8,9,10. Por ejemplo, una tarea funcional de la extremidad superior puede rastrear patrones de neurodegeneración y puede distinguir el deterioro cognitivo leve (DCL) de la EA. En esta tarea, los humanos mueven frijoles rojos crudos (dos a la vez) de una taza central de casa a una taza objetivo con una cuchara. La fase de la tarea en la que se adquieren los frijoles con la cuchara muestra asociaciones más fuertes con la cognición (específicamente, la memoria visoespacial) que la fase en la que los frijoles son transportados a la taza objetivo^11,12. A medida que la cuchara entra en la taza, puede perturbar los frijoles en la taza, lo que significa que los movimientos del participante pueden dificultar la tarea. Además, a medida que avanza el ensayo y disminuye el número de frijoles en la taza de casa, la tarea se vuelve más difícil (es decir, aumenta el tiempo para adquirir los frijoles con la cuchara)¹³. Se ha demostrado que esta tarea se correlaciona con la patología específica de la EA (amiloide)^9,14 y la neurodegeneración (atrofia del hipocampo)^10,15, lo que sugiere que su rendimiento puede depender de los circuitos neuronales y los procesos conductuales que se ven afectados en las primeras etapas del proceso de la enfermedad. Se sabe que la iniciación, planificación, ejecución y corrección del movimiento están controladas por una red diversa que atraviesa el cerebro, incluida la corteza motora, con cuerpos celulares de neuronas motoras superiores ubicadas en la corteza cerebral haciendo sinapsis con las neuronas motoras inferiores en la médula espinal^. Estas neuronas motoras inferiores se comunican directamente con los músculos para controlar el movimiento en la unión neuromuscular. Los tractos ascendentes transportan información sensorial desde la periferia hasta la médula espinal, mientras que los tractos descendentes dentro del cerebro comunican información direccional sobre cómo y dónde regresar a los músculos^17,18. Comprender cómo estas vías se ven afectadas selectivamente por la patología de la EA es fundamental para comprender la progresión de la enfermedad, particularmente porque los modelos genéticos animales, incluidos el ratón 3xTg-AD y la rata TgF344-AD, se han utilizado previamente para estudiar cómo los genes de la EA afectan la locomoción, la coordinación y otras deficiencias motoras 19,20,21. Por lo general, estas tareas se centran en las deficiencias motoras gruesas relacionadas con el movimiento de todo el cuerpo, pero los déficits motores en los humanos son mucho más variables, lo que puede ser difícil de identificar en los roedores²². Por lo tanto, se necesitan nuevas tareas para cerrar la brecha entre los modelos humanos y animales para capturar esta variabilidad.

Una región del cerebro que está comúnmente implicada en deficiencias motoras y temblores es el cerebelo²³. El cerebelo es un importante regulador de los movimientos precisos y coordinados y actúa como procesador de información sensorial para proporcionar retroalimentación a través de vías descendentes para corregir y adaptar este movimiento voluntario ^24,25. Es importante señalar que la atrofia cerebelosa ha sido reconocida en individuos con EA, pero, a diferencia de otras regiones como el hipocampo, el aumento de la deposición de amiloide en el cerebelo no se correlaciona con un aumento de la atrofia²⁶. Si bien la progresión de la patología de la EA es diferente en el cerebelo, existen conexiones bidireccionales multisinápticas entre el cerebelo y el hipocampo que probablemente se interrumpan en la E.C. 27,28,29. En particular, existen conexiones funcionales entre el cerebelo y el hipocampo, ya que se ha documentado que ocurren déficits de memoria después de la resección de tumores cerebelosos 30,31,32,33,34,35,36,37. En los roedores, las células del hipocampo se alteran con una perturbación cerebelosa³⁸. Estos déficits superpuestos en la memoria, la sociabilidad y el control motor resaltan la importancia de descubrir posibles cambios tempranos en las vías motoras que ocurren antes del deterioro cognitivo 30,31,38,39. Con la implementación de tareas motoras finas en la investigación temprana de la EA, podemos comenzar a remodelar la comprensión tradicional de la EA como un simple trastorno cognitivo y redirigir los esfuerzos de diagnóstico a cambios motores tempranos que pueden predecir la progresión de la enfermedad y pueden ser más distinguibles entre individuos de edad cognitivamente deteriorados y no deteriorados.

Para comprender cómo el comportamiento motor fino puede ser indicativo de cambios en la estructura del cerebro, se creó y probó una versión en roedores de la tarea humana descrita anteriormente. Esta tarea de roedores ha sido denominada KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task), y se desvía de las tareas anteriores de alcance que requieren la recuperación de un solo pellet de un pedestal o escalera y la puntuación más simplista como resultado de la colocación constante de pellets en todas las etapas de la tarea 40,41,42,43,44,45,46^{, 47,48}. Esta tarea de alcance de la motricidad fina incluye nuevos métodos de puntuación, cuencos con diversas dificultades y características autoperturbables para imitar a la contraparte humana, con el movimiento de los perdigones y los posteriores ajustes de la estrategia de los participantes en el diseño. Esta tarea emplea las herramientas de aprendizaje automático, Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) y keypoint-MoSeq^49,50, lo que permite una medición imparcial y cuantitativa de la capacidad motora fina y los comportamientos de alcance. Mientras que otros modelos computacionales notables han sido desarrollados para tareas de alcance hábil en roedores ^44,45,51, keypoint-MoSeq elimina el ruido para permitir una cuantificación precisa del movimiento y las posturas de agarre⁵⁰. El rendimiento de las tareas y la estrategia de aprendizaje motor se reconstruyeron utilizando una cámara de visión artificial de alto rendimiento en ratas típicas y con perturbaciones motoras utilizando Harmaline⁵². La harmalina hiperactiva el núcleo olivar inferior y altera la función cerebelosa a través de las fibras trepadoras glutamatérgicas^53,54. Además, se examinó la capacidad motora fina en un subconjunto de ratas TgF344-AD. Por lo tanto, se esperaba que la tarea de motricidad fina encontrara deficiencias medibles en ratas tratadas con Harmalain y TgF344-AD en relación con sus contrapartes típicas como prueba de concepto. Este protocolo describe la construcción de la tarea de motricidad fina, el entrenamiento y la prueba de los animales, y la cuantificación del comportamiento de alcance utilizando SLEAP y keypoint-MoSeq.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Arizona.

1. Diseño y construcción de la cámara

1. Prepara los paneles acrílicos transparentes. Los esquemas de la caja se encuentran en https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask. Corte paneles acrílicos transparentes a las siguientes dimensiones (todos los paneles tienen 1 cm de grosor):
   1. Recorta dos paneles laterales: 26 cm × 22 cm.
   2. Recorte un panel superior: 27 cm × 12 cm.
   3. Recorte del primer panel inferior: 26 cm x 10 cm
   4. Recorta el segundo panel inferior: 26 cm x 11 cm
   5. Corte de un panel frontal: 20 cm × 11 cm.
   6. Un panel trasero recortado: 20 cm x 12 cm
   7. Corta una ranura para el panel frontal (140 mm x 12 mm). Coloque la ranura en el centro, con su borde inferior alineado con la parte inferior del panel.
   8. Corta una ranura interior: 1 cm. En los bordes interiores de los paneles laterales, cree una hendidura o ranura para permitir que el panel frontal se deslice hacia adentro y hacia afuera de forma segura.
      NOTA: Si la función de deslizamiento no es necesaria, el panel frontal puede estar pegado permanentemente para simplificar la construcción.
   9. Taladre orificios espaciados uniformemente (5 mm de diámetro) en el segundo panel inferior para permitir que los gránulos caigan si se caen. Separe los agujeros a 1 cm de distancia en un patrón de cuadrícula.
2. Ensamble la cámara con adhesivo (Figura 1A).
   NOTA: Utilice un adhesivo fuerte y transparente diseñado explícitamente para materiales acrílicos.
   1. Paneles laterales: Aplique una línea continua de adhesivo a lo largo de los bordes del panel inferior. Coloque los paneles laterales verticalmente y presione firmemente. Deje que el adhesivo se cure según las instrucciones de fabricación.
   2. Panel trasero: Aplique adhesivo en los bordes traseros de los paneles laterales e inferiores. Coloque el panel trasero y presiónelo en su lugar.
   3. Panel superior: Aplique adhesivo en los bordes superiores de los paneles laterales y traseros. Coloque el panel superior y presione firmemente.
   4. Panel frontal: Deslice con cuidado el panel frontal en las ranuras de los paneles laterales, asegurando un ajuste ceñido pero suave, o aplique adhesivo a lo largo de los bordes del panel frontal y asegúrelo a los paneles laterales, superior e inferior.
      1. Pruebe el movimiento del panel y confirme que se alinea exactamente con el resto de la cámara.
3. Iluminación de montaje
   1. Coloque la luz infrarroja (IR) en el extremo opuesto de la cámara de prueba, apuntando hacia la cámara. Coloca una hoja de cartulina blanca en la parte superior de la cámara para reflejar la luz hacia abajo.
      NOTA: La iluminación es fundamental para un seguimiento adecuado, y todas las grabaciones deben realizarse con luz infrarroja en una habitación oscura.
4. Prepara el tazón de entrenamiento.
   1. Fabrica el cuenco de entrenamiento con un radio de 31 mm y una extensión de 32 mm utilizando una impresora 3D. Archivo STL disponible en https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask (Figura 1B: arriba)
   2. Coloque el tazón de entrenamiento en la parte inferior de la cámara directamente frente a la ranura. Coloca el tazón de manera que su borde superior esté aproximadamente por encima del nivel de los ojos de la rata dentro de la cámara, usando un soporte de apoyo, como un bloque de madera.
5. Prepare los tazones de prueba (Figura 1B: medio e inferior).
   1. Imprima los cuencos utilizando los archivos STL proporcionados. Se proporcionan dos diseños de cuencos distintos: "Plain-Less" y "Plinko". (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. Inspeccione la precisión dimensional y la durabilidad (dimensiones: 50 mm de profundidad x 40 mm de ancho).

2. Hardware de computadora y cámara

1. Utilice un trípode para montar la cámara de forma segura.
2. Coloque la cámara a unos 15-20 cm del panel frontal de la cámara.
   1. Ajuste la altura y el ángulo del trípode para que la cámara capture una vista isométrica de 45° tanto de la ranura como de la cazoleta.
      NOTA: Asegúrese de que el campo de visión de la cámara abarque la pata de la rata y el alcance completo, la ranura y el tazón de entrenamiento o prueba. Pruebe diferentes ángulos y distancias si es necesario para lograr una visibilidad óptima.
3. Descargue el software para emparejarlo con la cámara para realizar grabaciones de comportamiento (https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk) y abra el software para usar la cámara para registrar el comportamiento.
   1. Utilice los siguientes ajustes de la cámara: modo de adquisición: continuo, velocidad de fotogramas: 216 Hz, modo de exposición: temporizado, exposición automática: desactivado, tiempo de exposición: 4430 μs, ganancia automática: desactivada, ganancia: 16,85 dB, gamma: 0,8.
   2. La configuración de grabación es la siguiente: tipo de archivo H264, tasa de bits de 5 millones (5.000.000).
   3. Para grabar durante 10 minutos, introduzca 130.000 fotogramas y utilice el modo de transmisión para guardar.
      NOTA: Se recomienda el uso de una máquina dedicada con un mínimo de 16 GB de RAM y un disco duro interno de estado sólido de 1 TB para almacenar datos.

Figura 1: Esquema de la tarea de motricidad fina. (A) Representación caricaturesca de la tarea de motricidad fina en la que una rata mete la mano a través de una ranura para obtener una bolita de azúcar. Las coberturas se registran para el análisis de aprendizaje automático. Se utilizan tres tazones separados: un tazón de entrenamiento (abajo a la izquierda), (abajo en el medio) un tazón Simple/Menos y el tazón Plinko (abajo a la derecha) con obstrucciones marcadas en rojo. (B) Esquemas del diseño de cada tazón, incluyendo el tazón de entrenamiento (superior), el tazón (medio) Simple/Menos y el tazón Plinko (inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación animal

1. Empareje (como mínimo) ratas Fisher 344 CDF (macho y hembra, de >3 meses de edad) en un ciclo inverso de luz/oscuridad para permitir las pruebas cuando los animales están más activos.
2. Pesar a todos los roedores 1 semana antes del comienzo de la habituación y proporcionar ~30 g de alimento para un roedor que pese más de 300 g y ~15 g para un roedor 100-300 g para mantener a los animales al 90% del peso corporal.
   1. Pesar diariamente a las ratas y ajustar la comida en consecuencia, reduciendo la cantidad de comida proporcionada en 1-2 g por día hasta que el roedor alcance el 90% del peso corporal. El manejo diario también ayudará a habituar a los animales al experimentador.
   2. A lo largo de la habituación y las pruebas, continúe con este procedimiento, ajustando los alimentos en +/- 0,5 g cuando el peso caiga por debajo o supere el umbral.
   3. Durante la prueba, pese a los animales antes de iniciar la tarea, luego proporcione la comida asignada inmediatamente después de regresar a la jaula después de completar la tarea.
      NOTA: Cualquier pérdida repentina de peso (>15%) durante 1-2 días podría indicar un problema subyacente, y se debe consultar a un veterinario.

4. Habituación (2 días)

1. Encienda la luz infrarroja, la cámara y la computadora.
2. Coloque la cazoleta de entrenamiento con gránulos en la ranura de apertura, asegurándose de que la punta de la cazoleta se extienda ligeramente dentro del aparato (aproximadamente 2 cm inicialmente).
3. Transfiera las jaulas a la sala de pruebas y permita que las ratas se aclimaten durante 5 minutos.
4. Día 1: Agregue ratas alojadas en pares a la cámara y déjelas explorar durante 20 minutos. Coloque de 3 a 5 gránulos de azúcar en la jaula casera después de la prueba para permitir que las ratas se familiaricen con los gránulos.
   NOTA: El tamaño del pellet de 45 mg permite la extracción de un solo pellet.
5. Limpie la cámara con una toallita desinfectante entre ratas. Al final del día, rocíe con etanol para desinfectar.
6. Día 2: Habituar a los roedores individualmente al aparato utilizando el mismo procedimiento (20 min). Si los roedores parecen temerosos o evitan la parte delantera del aparato y el tazón, continúe habituándose hasta que este comportamiento se resuelva. Continúe dando gránulos como golosinas en la jaula de casa (3-5 gránulos).
   1. Para fomentar la familiaridad y el acercamiento al recipiente, mueva el tubo alargado más adentro del obturador del aparato progresivamente a lo largo de la habituación, moviendo la punta 0,5 cm a la vez más cerca del roedor para facilitar el alcance.
      NOTA: La habituación, las pruebas y el entrenamiento deben realizarse en el mismo lugar bajo luz roja para eliminar el impacto de un entorno nuevo.

5. Modelado (10 días)

1. Encienda la luz infrarroja, la cámara y la computadora.
2. Transfiera las jaulas a la habitación y permita que las ratas se aclimaten durante 5 minutos.
3. Usando el tazón de entrenamiento, proporcione de 1 a 5 gránulos a lo largo de la extensión, con la extensión colocada completamente dentro del aparato el primer día. Entrena a los animales en sesiones de 10 minutos. La grabación durante el modelado es opcional.
   NOTA: Para que los roedores se familiaricen con los gránulos, es importante proporcionar algunos gránulos de azúcar dentro del propio aparato para reducir la aversión a los gránulos en el recipiente. Es probable que los roedores se coman los gránulos dentro del aparato porque son fáciles de obtener y reconocerán estos gránulos en el tazón. Es importante que se acostumbren a mirar en la dirección correcta del aparato y que se acostumbren a tocar la cazoleta.
4. En los días siguientes de entrenamiento, comience a retraer la extensión del tazón del aparato. Esto requerirá que los roedores se acerquen a la abertura del aparato en la parte delantera y fomenten la interacción con la extensión justo fuera del aparato.
   1. El diseño permite la colocación específica de los pellets. Por ejemplo, coloque los gránulos en el extremo del recipiente más cercano al roedor y aléjese gradualmente para alentar al roedor a salir del aparato.
5. A medida que los roedores se sientan más cómodos tomando gránulos del borde de las extensiones, incluso si solo es por vía oral, comience a introducir gránulos a través de las pinzas para fomentar el comportamiento de alcance.
   1. Sostenga una bolita en las pinzas justo fuera del aparato, permitiendo que los roedores simplemente toquen las pinzas. Recompense inmediatamente este comportamiento para fomentar un mayor alcance.
   2. A medida que los roedores se sientan más cómodos tocando las pinzas, permita que se alejen un poco más del aparato para tocar o agarrar el perdigón sosteniendo las pinzas un poco más lejos de la abertura del aparato.
      NOTA: Tome notas de todos los comportamientos de los animales, en particular si los animales le tienen miedo al tazón o no lo alcanzan. Estos animales pueden necesitar días de modelado adicionales.
6. Una vez que los roedores alcanzan de manera continua e independiente durante un mínimo de 3 días (Figura 2A), se hace la transición al tazón llano hasta que se establezca el comportamiento de alcance (alcance continuo durante 3 días con al menos 10 alcances independientes por día).
   1. Al introducir los roedores en el recipiente liso, asegúrese de que el recipiente esté lleno tanto como sea posible con gránulos para que los roedores puedan visualizar los gránulos por el costado del recipiente.
      NOTA: Es posible que en esta etapa sea necesario alentar los alcances con pinzas.
7. Limpie la cámara con una toallita desinfectante entre ratas. Al final del día, rocíe con etanol para desinfectar.

6. Prepárese para la prueba:

1. Las pruebas se completan a lo largo de 9 días (Figura 2A), y cada roedor realiza 3 pruebas por tazón, y cada prueba de 10 minutos ocurre en días consecutivos.
   NOTA: Las pruebas se realizan mejor por la mañana.
2. En cada día de prueba, pesa las ratas. Una vez completado, las ratas se dejan en jaulas domésticas durante 30-60 minutos antes de la prueba, ya que el pesaje puede inducir estrés e inhibir el comportamiento de alcance.
3. Encienda la computadora y configure el tazón. Enchufa la cámara y la luz. Abra el software de grabación y ajuste la configuración de la cámara como se describe en la sección 2 del protocolo.
   NOTA: Se recomienda grabar al menos 200 fotogramas por segundo (fps) para capturar todos los movimientos de las patas.
4. Alinea el cuenco en el marco de la cámara y visualízalo en el software de grabación pulsando el botón de reproducción. Coloque el recipiente al ras del aparato y de la cámara en un ángulo de 45° con respecto al lateral del recipiente.
   1. Mueva la cámara para capturar el alcance directamente de frente para estudiar el movimiento individual de los dedos y la palma, así como el movimiento relacionado con la altura de la palma sobre el tazón durante el alcance.
   2. Coloque la cámara directamente perpendicular al tazón para capturar el movimiento del brazo y la mano hacia y desde el tazón, pero no la ubicación de los dedos ni los detalles sobre el comportamiento de agarre.
      NOTA: Aunque se recomienda un ángulo de 45° para capturar el movimiento a lo largo de los planos x, y y z, otras configuraciones pueden capturar más fácilmente la información para el estudio deseado.

7. Pruebas (9 días)

1. Coloque las ratas en la habitación para que se habitúen durante 1 h.
2. Coloque el primer tazón en la plataforma del tazón, asegurándolo con cera dental. Asegúrese de que la parte delantera del recipiente esté al ras y centrada con la abertura del aparato.
3. Asigne un nombre al archivo de video dentro de Spinview con el número de identificación de la rata, la fecha de grabación y la hora de la grabación.
4. Coloque la rata en el aparato. Cierra la tapa y coloca la cartulina blanca encima para desviar la luz.
5. En este punto, verifique dos veces el ángulo de la cámara para asegurarse de que se capture la escena adecuada y ajuste el tazón si no está centrado.
6. Vierta la cantidad correcta de gránulos en el recipiente y presione Iniciar grabación.
   Día 1-3 Tazón simple: ~ 100 pellets
   Día 4-6 Menos tazón: ~50 pellets
   Día 7-9 Tazón de Plinko: ~50 pellets
7. Permanezca en la habitación durante las pruebas para monitorear continuamente a la rata, tomar notas sobre cómo alcanzar el rendimiento y el comportamiento, y agregar gránulos según sea necesario para mantener la cantidad correcta.
   1. Para el recipiente liso, asegúrese de que los roedores puedan ver los gránulos por encima del borde del recipiente y que siempre se puedan obtener gránulos (es decir, llenando el recipiente durante todo el ensayo a medida que los gránulos disminuyen, los gránulos se colocan en capas).
   2. Para el recipiente Less: compruebe que los pellets no estén apilados unos sobre otros y que haya algo de espacio entre los pellets, lo que permite que se dispersen cuando la rata intente alcanzarlos.
   3. Para la cazoleta Plinko: asegúrese de que haya suficientes pellets para que sean accesibles entre las obstrucciones.
8. Regrese al animal a su jaula de origen y proporciónele la comida asignada. Limpie la cámara con una toallita desinfectante entre ratas.
9. Al final del día, rocíe con etanol para desinfectar toda la cámara y prepararse para el día siguiente.
   NOTA: Si realiza pruebas con roedores machos y hembras, asegúrese de contrarrestar los sexos con algunas hembras y algunos machos probados más temprano en la mañana, y una mezcla similar probada más tarde. Mantenga el orden de los probadores durante todo el experimento.

Figura 2: Entrenamiento y pruebas de ratas que realizan la tarea de motricidad fina. (A) Cronología del experimento. Las ratas se habituaron al aparato durante dos días y luego se sometieron a procedimientos de modelado durante 10 días. Se evaluó la capacidad motora fina de los animales en los tres tazones durante tres días cada tazón. Luego, los animales fueron inyectados con harmalina y se volvieron a probar en cada tazón durante tres días. (B) Las ratas (n = 6) se sometieron a dos tazones diferentes (tazón de entrenamiento y Plain) durante los procedimientos de conformado, y el tipo de tazón se cambió el día 5 para mejorar los alcances. Hubo un aumento significativo en la conformación a lo largo de 10 días para alcanzar los criterios (F(9, 45) = 13,5, p < 0,001). La barra gris designa el cambio entre la cazoleta de entrenamiento de tubo alargada original y la actual. (C) Para probar los tres tazones, hubo una diferencia significativa en los alcances totales a lo largo de los 9 días de prueba (F(8, 32) = 3.74, p = 0.003). Nota: La rata 2 se eliminó después de darle forma. El cuenco Plinko resultó en diferencias significativas entre el cuenco Menor (p = 0,001) y el Cuenco Liso (p = 0,027). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Modelado de la interrupción de la motricidad fina con Harmaline

NOTA: Para identificar los efectos de las alteraciones motoras sobre la capacidad motora fina y el rendimiento en la tarea de motricidad fina, se inyectó a las ratas harmalina (10 mg/kg), un alcaloide β-carbolino que es un inhibidor reversible de la monoaminooxidasa-A y se dirige a la aceituna inferior 52,55,56,57. La harmalina en modelos de roedores afecta la postura y el equilibrio, limita la coordinación motora fina e induce la interrupción motora en las extremidades superiores.

1. Pesa las ratas para calcular la dosis adecuada de harmalina.
2. Permita que las ratas se habitúen a la sala de pruebas durante 1 hora.
3. Encienda la computadora y configure el tazón. Enchufa la cámara y la luz. Abra el software de grabación y ajuste la configuración de la cámara como se describe en la sección 2 del protocolo.
4. Inyectar Harmalina a los roedores (10 mg/kg, i.p.).
5. Después de 15 minutos, vierta los gránulos en el recipiente adecuado y comience a grabar. Pruebe la rata en cada tazón durante 3 días.
   Día 1 Tazón simple: ~ 100 pellets
   Día 2 Menos tazón: ~50 pellets
   Día 3 Tazón Plinko: ~50 pellets
   NOTA: Vigile el lugar de la inyección para detectar anomalías, como irritación de la piel, comportamientos dolorosos, ataxia, hipotermia y cambios posturales hasta 3 horas después de la inyección. Después de las ventanas de 3 h, continúe monitoreando cualquier cambio en el comportamiento, incluidas las latencias para comer o beber, o cualquier temblor residual.

9. Análisis de vídeo mediante aprendizaje automático

NOTA: Después de la recopilación de datos y la grabación de video, los alcances se contaron a mano y se puntuaron de la siguiente manera: Éxito (recuperar y consumir pellet), Gotas (recupera el pellet pero deja caer el pellet antes de consumirlo), Fracaso (no se puede recuperar el pellet). Estos datos puntuados a mano se utilizaron como datos reales para el análisis de aprendizaje automático.

1. Utilizando código Python personalizado en https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask, se realizaron comparaciones entre los animales tratados con Baseline y los tratados con Harmalaline para identificar cambios en el rendimiento del alcance (Figura 3, Figura 4, Figura 5 y Figura 6).
2. Para analizar la cinemática conjunta del comportamiento de alcance, incluida la trayectoria de alcance, la conformación y posición de las patas, y los cambios en la estrategia de alcance en los diferentes tipos de tazones, utilice el software de aprendizaje automático gratuito y de código abierto Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) (consulte https://sleap.ai/ para obtener una explicación más extensa y una guía paso a paso para usar el programa de código abierto⁴⁹).
   NOTA: SLEAP⁴⁹ se puede descargar en https://github.com/talmolab/sleap.
3. Abra un nuevo proyecto y agregue 3 videos de la tarea de alcance.
4. Crea un esqueleto que consta de 15 nodos: 1 brazo superior, 1 muñeca, 1 centro de la palma, 4 nodos de base, 4 nudillos y 4 nodos de la punta de los dedos (descargar esqueleto en https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask).
5. Agregue bordes entre los nódulos de manera que la parte superior del brazo se conecte con la muñeca y luego con el centro de la palma. Desde el centro de la palma, conecte los nodos de la base, el nudillo y la punta de los dedos de manera que el centro de la palma sea siempre el nodo inicial (Figura 7A).
6. Etiqueta un mínimo de 50 fotogramas antes del entrenamiento de carrera. Aquí se puede entrenar un nuevo modelo o usar los modelos para centered y centroid en el github: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.
7. Una vez entrenado el modelo, abra un nuevo vídeo y ejecute la inferencia: trackin.match: greedy, n_instances:1, tracking.clean_instance_count: 1, tracking.target_instance_count: 1, tracking.pre_cull_to_target: 1.
   NOTA: La inferencia se puede ejecutar como un script bash en un clúster local. Es posible que los videos rastreados requieran revisión (consulte https://sleap.ai/ para obtener instrucciones de corrección).
8. Para analizar más a fondo los nodos y comprender las diferencias entre los grupos en la cinemática de las articulaciones, utilice el keypoint-MoSeq⁵⁰ gratuito y de código abierto (consulte el https://github.com/dattalab/keypoint-moseq para obtener detalles sobre la descarga y las instrucciones de uso).
9. Cree sílabas discretas de comportamiento utilizando keypoint-MoSeq⁵⁰ (Figura 7B). Realice análisis adicionales para mapear la frecuencia de transición, la probabilidad y los cambios en la frecuencia de las transiciones entre las condiciones de harmalina y línea de base por tazón (Figura 7C, D). Consulte https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask para ver el código de análisis.

Figura 3: Cambios en el alcance a través de los tazones y el tratamiento. (A) Para la prueba basal (n = 5), en los 3 tazones, hubo una diferencia significativa en los alcances totales (H(df) = 8.48, p = 0.014, Kruskal-Wallis), y se ocurrieron más alcances con el tipo de tazón Plinko (p = 0.011, prueba de Dunn post-hoc con corrección de Bonferroni). (B) La perturbación de harmalina (n = 5) no dio lugar a diferencias entre los tipos de tazón. Los errores se notifican como S.E.M. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación del rendimiento entre condiciones y entre tipos de tazón. (A) Hubo una diferencia significativa (F(2) = 5,78, p = 0,007) y de resultados (F(2) = 3,92, p = 0,029) durante la prueba inicial. Los intentos de alcance aumentaron a medida que el tipo de tazón se volvió más difícil, aunque los alcances se redujeron desde el inicio en todos los tazones en la condición harmalina. (B) No se encontraron diferencias en las ratas tratadas con Harmalain para los recuentos de alcance entre los tazones. (C) Hubo una diferencia de resultado significativa (F(2) = 2,07, p < 0,001) durante las pruebas de referencia cuando se analizó por rendimiento. (D) No se encontraron diferencias en las ratas tratadas con Harmalain para el rendimiento del tazón o del resultado. Los errores se informan como S.E.M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comparación de las condiciones basales y de Harmalina. (A) No hubo diferencias en el éxito del rendimiento entre las condiciones. (B) Para los recuentos de fallas, hubo una diferencia significativa entre las condiciones basales y las de Harmalina (H(df) = 4.85, p = 0.028, Kruskal-Wallis) con un efecto significativo encontrado en la condición de Harmalina (p = 0.028, prueba de Dunn post-hoc con corrección de Bonferroni). Los errores se informan como S.E.M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Tasas de aprendizaje y alcance. (A) Los animales Harmaline tuvieron una tasa de aprendizaje perturbada en comparación con la condición basal (t-stat = 2.833, p = 0.022). (B) Para el total de alcances por minuto, hubo una interacción significativa entre el tazón (menos) y la condición (harmalina) (F(1,5) = 9.83, p = 0.002, modelo lineal mixto) y el tazón (plinko) y la condición (harmalina) (F(1,5) = 22.67, p < 0.001, modelo lineal mixto). Harmaline redujo el total de alcances por minuto en todos los tipos de tazones (Less: p = 0.01, Plinko: p < 0.001) en comparación con la línea de base. Los errores se notifican como S.E.M. *p < 0,05, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: El aprendizaje automático identifica poses únicas y estrategia de tareas. (A) Ubicaciones de los nodos en la pata de la rata etiquetadas con SLEAP. (B) Ejemplos de sílabas identificadas por keypoint-MoSeq durante el alcance. (C) Matriz de frecuencias de transición de bigram entre sílabas consecutivas. Las probabilidades de transición se normalizan mediante el recuento total de bigram. (D) Un gráfico de transición que compara las diferencias de transición de sílabas entre Harmaline y Baseline. Los nodos del grafo representan sílabas y los bordes indican transiciones entre ellas. Los bordes más prominentes indican transiciones de sílabas con frecuencias más altas. Las conexiones rojas indican una transición regulada al alza, mientras que una conexión azul indica una transición regulada a la baja en los animales tratados con harmalina. Los círculos rojos indican un uso regulado al alza, mientras que un círculo azul indica un uso regulado a la baja de la sílaba indicada en animales tratados con Harmalano. Se excluyeron los pares de sílabas con frecuencias inferiores a 0,005. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Después de que las ratas alcanzaron una restricción de alimento del 90% del peso corporal, se habituaron a la cámara durante 2 días, luego se sometieron a procedimientos de modelado durante 1-2 semanas. El número de alcances exitosos, abandonados y fallidos fue calificado por un observador entrenado ciego a cada condición. En el transcurso de 9 días (línea de base), se evaluó la capacidad motora fina de las ratas en 3 configuraciones de tazón diferentes (Plain, Less y Plinko). Luego, las...

Discusión

Las tareas de alcance para los roedores generalmente se restringen a gránulos individuales y no incluyen obstrucciones o características autoperturbantes, que son luchas comunes para los pacientes con patología neurodegenerativa. El método presentado aquí, que utiliza tanto una tarea reimaginada de alcance de perdigones como el aprendizaje automático, puede detectar tanto la coordinación como la estrategia a través del análisis de las características de la pose y las transiciones, además...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material para impresión 3D	Amazon (Obertura)	B07PGY2JP1	Filamento PLA 1,75 mm Filamento para impresora 3D PLA, precisión dimensional +/- 0,03 mm
Cámara	Edmond Optics	BFS-U3-13Y3M-C	1,3 MP, mono, 170 fps, ON Semi PYTHON 1300 x2
Cables de cámara	Edmond Optics	ACC-01-2300	USB 3.1, 3 m, Tipo A a Micro-B (Bloqueo)
Lente de cámara	Thor Labs	MVL5WA	Lente de visión por máquina EFL, F/1.4, formato 1/2" de 4,5 mm
Conexión cámara a trípode	Edmond Optics	88-210	Conexión de la cámara al trípode
Toallitas limpiadoras	Amazon (Sani-Cloth)	B00KMZ7KMO	Limpiador de desinfectante de superficie AF3 Recipiente de toallita con aroma suave 160 Ct P13872
Ordenador	Dell	Precisión	Intel Core i7-13700 @ 2,1 GHz, NVIDIA T1000 8 GB, RAM 16 GB
Luz IR	Amazonas (Serlium)	B0BJFDBT44	Cámara Luz IR 48 LED Iluminadores IR Luces Impermeable Infrarrojo Luz nocturna para seguridad Cámara CCTV
Pegamento para paneles	Amazon (Sdintar)	B0B1DLRPNZ	Pegamento de vidrio
Plexiglás	Amazon (TOOLINHAND  EE. UU.)	B0BRJ1L8TR	12 y más veces; Láminas transparentes de acrílico/plexiglás fundido de 12" - transparentes de 1/8" Grueso (3 mm) y nobsp;
Python	Fundación de Software Python	Python 3.7
Spinview	Teledyne Technologies	Versión 3.1.0.79
Pellets de azúcar (45 mg)	Bioserv	F0023	45 mg, sin saborizar 50.000/caja; Ingredientes: Sacarosa, Dextrosa, Estearato de Magnesio, Silicato de Calcio, Aceite Mineral
Trípode	Amazon (YOUYI)	B086PYJF9D	Trípode de escritorio flexible de Amazon para cámara web
Pinzas	Herramientas Científicas Fines	11064-07	Pinzas de iris
Cera	Amazon (Ortomecánica)	B00FKDC0UU	Orthowax genuino