Aislamiento y cultivo de células primarias de Müller en la retina de ratas Sprague-Dawley (SD)

Las células gliales de Müller (RMC) retinianas, la macroglía predominante en la retina, forman el núcleo de la unidad neurovascular de la retina ^1,2. Abarcando casi todo el grosor de la retina, las RMC envuelven casi todas las neuronas de la retina y la microvasculatura. Sus procesos se extienden hacia arriba hasta la membrana limitante interna (ILM), formando los extremos apicales, y hacia abajo hasta la membrana limitante externa (OLM), donde desarrollan microvellosidades especializadas³. Esta arquitectura única permite que las RMC funcionen como el andamio estructural primario para la organización de la retina ^4,5.

Las RMC están enriquecidas con canales iónicos, ligandos, receptores, transportadores transmembrana y enzimas⁶, y participan en el metabolismo de la glucosa en la retina a través de la glucólisis⁷. Los canales iónicos de potasio (Kir2.1, Kir4.1) y las proteínas de los canales de agua (AQP4, AQP9, AQP11) regulan en colaboración la homeostasis de iones y agua a través de la membrana celular, manteniendo el equilibrio fisiológico de la retina⁷. Además, las RMC absorben y eliminan los neurotransmisores liberados por las neuronas, como el glutamato, el ácido γ-aminobutírico (GABA) y la glicina ^7,8.

Las condiciones patológicas como la retinopatía diabética⁷, el glaucoma⁹ y la retinitis pigmentosa¹⁰ pueden dañar las RMC, alterar la barrera hematorretiniana, desencadenar inflamación, aumentar la permeabilidad vascular y afectar la función de la retina. Las RMC también son reconocidas como fuentes intrínsecas latentes de células regenerativas de la retina^11,12. En los peces y en ciertos anfibios, las RMC pueden desdiferenciarse en células progenitoras de la retina que reemplazan a las neuronas perdidas por lesiones¹³. En las retinas de mamíferos adultos, las RMC expresan proteínas marcadoras relacionadas con las células madre^14,15, lo que les otorga el potencial de diferenciarse en neuronas de la retina y reemplazar las células dañadas en enfermedades degenerativas como la degeneración macular relacionada con la edad, el glaucoma y la retinopatía diabética¹⁶. Las RMC primarias imitan de cerca su estado in vivo y son de gran valor en el estudio y tratamiento de las enfermedades degenerativas de la retina. Sin embargo, la literatura contiene pocos métodos establecidos para aislar y cultivar RMC primarios, particularmente de ratas Sprague-Dawley (SD) neonatales.

Este protocolo utiliza ratas SD neonatales de 3 a 5 días de edad, sin preferencia de género. En condiciones estériles, los globos oculares se enuclean y el tejido de la retina se digiere con tripsina. A continuación, las RMC primarias se aíslan mediante centrifugación y purificación para su posterior cultivo y aprobación. El análisis morfológico mediante microscopía óptica invertida combinada con tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló que las células aisladas presentaban rasgos característicos de RMC. La tinción con inmunofluorescencia confirmó la expresión de marcadores proteicos específicos de RMC, como la glutamina sintetasa (GS), la proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), la vimentina, la acuaporina-4 (AQP4) y el canal de potasio rectificador interno 4.1 (Kir4.1). El análisis de citometría de flujo después del marcaje con anticuerpos GS y CRALBP demostró una pureza celular de ≥90%, lo que cumple con los criterios establecidos para los experimentos biológicos basados en RMC y garantiza la idoneidad para estudios funcionales posteriores. Durante el proceso experimental, las células del cuarto pasaje mostraron una adherencia reducida al matraz de cultivo, cambios morfológicos y signos de senescencia, lo que finalmente condujo a la muerte celular. Por lo tanto, solo las células de los tres primeros pasajes se utilizaron en experimentos posteriores.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de Ética: 2024069). En el estudio se utilizaron cincuenta ratas Sprague-Dawley libres de patógenos específicos (SPF) (de 3 a 5 días de edad, sexo no especificado, peso corporal de 7 a 10 g). Los animales se obtuvieron comercialmente y se alojaron en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (N.º de licencia de uso de instalaciones: SYXK [Sichuan] 2024-049) en condiciones estándar de laboratorio. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento y cultivo de RMCs primarias

1. Preparación de artículos experimentales
   1. Esterilice los siguientes artículos bajo luz ultravioleta durante al menos 30 minutos en el banco limpio antes de usarlos: matraces de cultivo T25, tubos y gradillas de centrífuga, pipetas y soportes, recipientes para desechos líquidos, encendedores de cigarrillos, lámparas de alcohol espirituoso y marcadores.
   2. Esterilice los siguientes artículos esterilizándolos en autoclave antes de usarlos: puntas de pipeta de 1 ml, placa de flexión, placas de Petri de vidrio con tapa, pinzas curvas, malla de nailon de 45 μm (malla 300), pinzas dentadas, pinzas desdentadas y tijeras microcórneas.
2. Preparación del entorno: Desinfectar el ambiente y la mesa de operaciones para la disección del globo ocular con luz ultravioleta durante más de 30 min. Rocíe alcohol en las manos del experimentador cada vez antes de entrar y después de salir del banco limpio. Ajuste la incubadora a 37 °C y 5% de_CO2. Rocíe las manos del experimentador con alcohol antes y después de abrir la incubadora.
3. Preparación de la solución: Prepare la solución de D-Hank, solución salina tamponada con fosfato (PBS), medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM de alta glucosa), suero fetal bovino (FBS, inactivado por calor), solución de penicilina/estreptomicina (100x) y solución de tripsina-EDTA al 0,25%.
   NOTA: Calentar DMEM y FBS en un baño de agua a 37 °C antes de usar.
   1. Prepare soluciones de D-Hank y PBS que contengan penicilina/estreptomicina al 1% añadiendo 100 μL de solución de penicilina/estreptomicina a 10 ml de solución de D-Hank o PBS, respectivamente.
   2. Prepare el medio de cultivo completo añadiendo 100 μL de solución de penicilina/estreptomicina y 2 mL de FBS a 10 mL de DMEM con alto contenido de glucosa.
      NOTA: Prepare las soluciones en un banco limpio de laboratorio y utilícelas inmediatamente cuando sea posible. Almacene el medio de cultivo completo a 4 °C y caliéntelo a 37 °C antes de cada uso. Deséchelo si se almacena durante más de una semana.
4. Extirpación de ojos
   1. Eutanasia de ratas SD neonatas por luxación cervical (sin asfixia por CO₂) en un banco de trabajo esterilizado siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente. Sumerja los cuerpos en alcohol al 75% durante 5 minutos para desinfectarlos, luego transfiéralos a un plato curvo estéril.
   2. Vierta la solución de D-Hank en dos platos de cultivo de vidrio de 10 cm.
   3. Use pinzas dentadas para abrir el párpado a lo largo de la fisura palpebral y exponer el globo ocular.
   4. Use pinzas desdentadas abiertas y paralelas a la fisura palpebral para presionar el orbital. Una vez que se alcanza el nervio óptico y se expone el globo ocular, cierre las pinzas para levantar y extraer el globo ocular.
   5. Coloque el globo ocular en una placa de cultivo de vidrio con la solución de D-Hank, enjuáguelo y transfiéralo a otra placa con la solución fresca de D-Hank.
      NOTA: Asegúrese de que el globo ocular permanezca intacto. Lo ideal es que una parte del nervio óptico permanezca unida para facilitar la separación del tejido de la retina.
5. Disección de retina
   1. Prepare una placa de cultivo vacía esterilizada con tapa y ajuste el microscopio.
   2. Coloque la placa de cultivo de vidrio del paso 1.4.5 bajo el microscopio. Use micropinzas oftálmicas curvas para fijar suavemente la región entre la córnea y el nervio óptico para exponer la córnea.
   3. Perforar la unión corneoescleral con unas microtijeras corneales. Corte a lo largo del limbo de forma circular, luego haga incisiones esclerales simétricas de aproximadamente 2 mm de longitud. Suelte las pinzas y vuelva a sujetarlas en la unión del nervio óptico y la esclerótica.
   4. Use una segunda pinza para presionar suavemente cerca de la raíz del nervio óptico, dirigiendo la presión hacia la interfaz corneal-nervio óptico. Cuando aparezca el tejido del cristalino, retírelo con cuidado y continúe presionando hasta que emerja el tejido de la retina.
      NOTA: Retire el cristalino con cuidado para evitar extraer inadvertidamente tejido de la retina.
   5. Transfiera el tejido de la retina separado a otra placa de cultivo estéril con pinzas. Cubra el plato, rocíelo con alcohol y colóquelo en el banco limpio.
6. Extracción de RMCs primarios
   1. Encienda el interruptor de ventilación del banco limpio.
   2. Abra la tapa de la placa de cultivo. Utilice una pipeta con una punta de 1 ml para pipetear el tejido de la retina hacia arriba y hacia abajo unas 15 veces para romperlo en pedazos pequeños. Añadir 1 mL de tripsina al 0,25% e incubar a 37 °C durante 5 min.
   3. Retire la placa de cultivo de la incubadora y colóquela en el banco limpio. Añadir 2 mL de medio completo y pipetear suavemente para detener la digestión.
      NOTA: Use el doble del volumen de tripsina para terminar la digestión. Por ejemplo, si se usó 1 mL de tripsina, terminar con 2 mL de medio completo.
   4. Filtre la suspensión de la celda a través de una pantalla de nailon de malla 300 en un tubo de centrífuga de 15 ml. Lave el plato con PBS preparado y recoja la suspensión restante.
   5. Centrifugar el tubo a 878 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Aspirar y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 2 mL de medio completo y vuelva a centrifugar a 878 x g durante 5 min para purificar las células.
   6. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 2 mL de medio completo. Añada previamente 3 mL de medio completo a cada matraz T25 y, a continuación, añada 1 mL de la suspensión de células. Agite el matraz en forma de cruz y colóquelo en la incubadora.
   7. Realizar el primer cambio de medio después de 48 h de incubación. Retire el matraz de la incubadora y colóquelo en el banco limpio. Deseche el medio gastado y lave la superficie adherida a la célula tres veces con 1 mL de PBS.
      1. Añadir 5 mL de medio completo fresco. Continúe cambiando el medio cada dos días hasta que la confluencia celular supere el 90%, luego proceda con el subcultivo.

2. Traspaso de RMC

NOTA: Pasar las celdas cuando la confluencia supere el 90%. En este protocolo, los cultivos primarios generalmente requieren el paso a los 5-6 días después del aislamiento. El momento del primer paso puede variar en función de la densidad del enchapado. Ajuste la densidad celular a 4 x 10³ células/mL y siembre las células en matraces de cultivo T25. Cuando la confluencia alcance el >90% después de 3-4 días, proceda con el paseo.

1. Retire el matraz de cultivo T25 de la incubadora. Deseche el medio de cultivo y lave las células tres veces con 1 mL de solución de PBS que contenga penicilina/estreptomicina al 1%.
2. Añadir 1 mL de solución de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz e incubar durante 1 min y 30 s.
3. Observe el matraz bajo un microscopio invertido. Cuando las celdas parezcan redondas, separadas y comiencen a flotar, retire el matraz de la incubadora. Transfiéralo al banco limpio y agregue 2 mL de medio de cultivo completo para terminar la digestión.
4. Utilice una pipeta para aspirar la suspensión celular. Pipetear suavemente contra la pared del matraz para desalojar las células adherentes restantes.
5. Transfiera toda la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga de 15 mL. Enjuague la pared del matraz con 2 mL de PBS que contenga penicilina/estreptomicina al 1% y añádalo al mismo tubo. Centrifugar el tubo a 878 x g durante 5 min a RT.
6. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet de celda en un volumen adecuado de medio completo. Pase las celdas en una proporción de 1:2 o 1:3 según sea necesario.
   NOTA: Utilice las celdas en el pasaje 2 (P2) para los experimentos posteriores (Figura 1).

3. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

1. Paso de semillas 2 (P2) células en una placa de 6 pocillos que contiene cubreobjetos estériles precolocados a una densidad de 2 x 10⁵ células por pocillo. Agregue 2 mL de medio de cultivo completo a cada pocillo. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, deseche el medio de cultivo y enjuague suavemente cada pocillo dos veces con 1 mL de PBS.
2. Agregue 1 mL de fijador de paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incube durante 30 min para fijar las celdas. Deseche el fijador y lave las células dos veces con 1 mL de PBS.
3. Agregue 1 mL de tinción de hematoxilina a cada pocillo e incube durante 15 min. Deseche la solución de tinción y enjuague los pocillos 2-3 veces con 1 ml de PBS.
4. Observa las células bajo un microscopio. Si la tinción de hematoxilina parece demasiado oscura, use alcohol de ácido clorhídrico al 1% para diferenciar y eliminar el exceso de tinción citoplasmática. Lavar 2-3 veces con 1 mL de PBS.
5. Agregue 1 mL de solución de tinción de eosina a cada pocillo. Observe la tinción bajo el microscopio durante aproximadamente 30 segundos o hasta que se logre la intensidad de color deseada. Enjuague los pocillos 2-3 veces con 1 mL de PBS. Monta los cubreobjetos en portaobjetos con resina neutra.

4. Tinción de inmunofluorescencia

1. Siembre las células P2 en una placa de 6 pocillos que contenga cubreobjetos estériles precolocados a una densidad de 2 x 10⁵ células por pocillo. Agregue 2 mL de medio de cultivo completo a cada pocillo.
   1. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, deseche el medio de cultivo. Retire el cubreobjetos y colóquelo en un frasco para teñir. Lave el cubreobjetos tres veces con 1 mL de PBS, 5 min cada vez.
2. Añadir aproximadamente 50 μL de solución de permeabilización (Triton X-100: PBS = 1:200) para cubrir las células. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, luego lavar tres veces con 1 ml de PBS, 5 minutos cada vez. Agregue aproximadamente 50 μL de solución de bloqueo de BSA al 3% e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos.
3. Deseche suavemente la solución de bloqueo. Agregue aproximadamente 200 μL de solución de anticuerpos primarios preparada en PBS para cubrir el portaobjetos: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) o Vimentin (1:200). Coloque el cubreobjetos en una cámara humidificada e incube durante la noche a 4 °C.
4. Lave el cubreobjetos tres veces con 1 mL de PBS, 5 min cada vez.
5. Añadir aproximadamente 200 μL de anticuerpo secundario IgG¹⁷ anti-conejo en cabra marcado por FITC. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 50 min. Lave el cubreobjetos tres veces con 1 mL de PBS, 5 min cada vez.
6. Teñir los núcleos con DAPI durante 10 min. Lavar tres veces con 1 mL de PBS, 5 min cada vez.
7. Agregue una gota de medio de montaje anti-decoloración a la guía. Monte el cubreobjetos con la celda hacia abajo. Selle y observe bajo un microscopio de fluorescencia.

5. Citometría de flujo

1. Ajuste la concentración de células a 1,0 x 10⁷ células/ml utilizando tampón de tinción por citometría de flujo.
2. Alícuota 100 μL de la suspensión unicelular en dos tubos de muestra separados por condición. Designe un tubo como el control negativo (sin manchar).
3. Añada 100 μL de medio de permeabilización A (del kit obtenido comercialmente, véase la Tabla de Materiales) a cada tubo. Mezcle suavemente e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Agregue 3 mL de tampón de tinción de citometría de flujo preenfriado a cada tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante.
5. Añada 100 μL de medio de permeabilización B (del kit obtenido comercialmente) a cada tubo y vórtice para mezclar. Añadir 0,1 μL de anticuerpo CRALBP a los tubos de muestra designados y 0,8 μL de anticuerpo GS a los tubos correspondientes. No agregue ningún anticuerpo al tubo de control negativo. Incubar a 4 °C en la oscuridad durante 30-60 min.
6. Agregue 3 mL de tampón de tinción para citometría de flujo a cada tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender cada tubo en 100 μL de tampón de tinción para citometría de flujo. Agregue 1 μL de IgG (H&L) anti-conejo de cabra conjugada con FITC a cada tubo teñido con CRALBP, y 1 μL de IgG (H&L) de cabra anti-conejo conjugado con PE a cada tubo teñido con GS. No agregue ningún anticuerpo al tubo de control negativo. Incubar a 4 °C en la oscuridad durante 30-60 min.
8. Agregue 3 mL de tampón de tinción para citometría de flujo a cada tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
9. Vuelva a suspender cada tubo en 300 μL de tampón de tinción para citometría de flujo. Proceda con el análisis de citometría de flujo de inmediato; alternativamente, vuelva a suspender en 500 μL de paraformaldehído al 1%-4%, almacene a 2-8 °C en la oscuridad y analice dentro de las 24 h.
10. Analice muestras negativas y positivas utilizando el software de citometría de flujo.

Después de que las células primarias se siembran en el matraz de cultivo, los cambios de medio y el paso posteriores ayudan a eliminar las RMC poco adherentes y eliminan los restos celulares generados durante el paso, enriqueciendo así la población de RMC en el cultivo. Las RMC se identificaron en función de su morfología utilizando un microscopio óptico invertido (Figura 1) y tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 2). La tinción por inmunofluorescencia se realizó utilizando anticuerpos específicos contra GS, Vimentina, CRALBP, AQP4 y Kir4.1 para observar la expresión de proteínas (Figura 3). Además, se realizó citometría de flujo utilizando el marcaje de anticuerpos GS y CRALBP para determinar la pureza de la población de RMC (Figura 4).

Como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2, las RMC de segundo paso (P2) observadas bajo un microscopio óptico invertido exhiben morfologías en forma de estrella o de huso con límites claros y abundante citoplasma. Sus núcleos son redondos u ovalados, de tamaño uniforme y rodeados por apófisis que se extienden radialmente. Algunas células progenitoras de la retina también son visibles; Estas células son redondas u ovaladas, contienen núcleos grandes y tienen relativamente menos citoplasma.

Para la identificación específica de las RMCs, en este estudio se utilizaron GS, vimentina, CRALBP, AQP4 y Kir4.1 como marcadores de inmunofluorescencia. La GS es una enzima clave que convierte el glutamato en glutamina. Se expresa exclusivamente en las RMC y se localiza principalmente en su citoplasma18,19. CRALBP, originalmente identificado en las retinas de los vertebrados, se expresa tanto en las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) como en las RMC20. La expresión de GS y CRALBP también se ha observado a lo largo de los procesos celulares en la retina humana21. Cabe destacar que el nivel de expresión específica de CRALBP en las RMC de mamíferos regula la eficiencia del ciclo visual de la retina y está estrechamente asociado con la función de los conos22,23. Por lo tanto, tanto GS como CRALBP sirven como marcadores inmunoespecíficos confiables para las RMC.

La vimentina, una proteína de filamento intermedio del citoesqueleto, es un sello distintivo de las células gliales en la retina de los mamíferos. Se expresa abundantemente en el citoplasma y en los procesos de las RMC y se utiliza habitualmente como marcador de células gliales de la retina24. AQP4 es una proteína bidireccional del canal de agua transmembrana que se colocaliza con Kir4.1 en la membrana limitante interna (ILM). Estas dos proteínas exhiben acoplamiento estructural y funcional, facilitando el transporte transmembrana coordinado del exceso de agua e iones K+ al espacio intersticial de la retina para mantener la homeostasis 7,25. NeuN, un antígeno nuclear neuronal y un marcador de diferenciación neuronal, se utilizó como control negativo en este estudio26.

En la Figura 3, la tinción por inmunofluorescencia de las RMC reveló una fluorescencia roja vívida para GS, AQP4, mientras que CRALBP, Kir4.1 y Vimentin mostraron fluorescencia verde brillante. Las RMC mostraron diversas morfologías, con cuerpos celulares circulares, ovalados o irregulares, y con límites claramente definidos. Los procesos dendríticos eran visibles, lo que indicaba conexiones intercelulares cercanas. No se detectó expresión de NeuN en las RMC, lo que confirma la ausencia de contaminación neuronal.

En la Figura 4, el análisis de citometría de flujo después del marcaje de anticuerpos GS y CRALBP demostró que la pureza de las RMC cultivadas superó el 90%. Este alto nivel de pureza cumple con los requisitos para estudios funcionales posteriores.

Figura 1: Morfología de las RMC en la etapa P2 observada bajo un microscopio invertido a diferentes aumentos. Las células aparecen en forma de estrella o fusiforme, muy dispuestas, con bordes lisos. Los núcleos son redondos u ovalados, y las sustancias granulares son visibles en el citoplasma. Las imágenes se capturan con aumentos de 40x, 100x y 200x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Morfología celular de las RMC después de la tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Las células tienen forma de huso o de estrella; algunos permanecen relativamente redondos, lo que indica una diferenciación incompleta. El citoplasma es abundante y de color rosa claro, con membranas celulares claras. Los núcleos son grandes, ovalados y ubicados en el centro, apareciendo más oscuros que el citoplasma en rosa o rojo claro. Las células exhiben bordes lisos y están interconectadas por estructuras filamentosas delgadas. Las imágenes se capturan con aumentos de 100x, 200x y 400x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 3: Tinción por inmunofluorescencia de RMCs. GS y AQP4 exhiben fluorescencia roja brillante, mientras que CRALBP, Kir4.1 y Vimentin muestran fluorescencia verde. Las RMC muestran cuerpos celulares circulares u ovalados, con núcleos simples o dobles y abundante citoplasma. Las membranas celulares tienen límites bien definidos y las protuberancias dendríticas son visibles. La cuantificación se realizó en cinco campos de visión seleccionados al azar, mostrando un 90% de células positivas (n = 3 experimentos independientes). Ampliación: 40x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis por citometría de flujo de RMCs. Se muestran los niveles de expresión de GS (izquierda) y CRALBP (derecha). El azul representa la población de control negativo y el rojo representa las células teñidas para la proteína objetivo. El eje horizontal indica la intensidad de fluorescencia (área FL2 para el área PE, área FL1 para el área FITC) y el eje vertical indica el recuento de células. Los valores etiquetados en los picos azul y rojo representan las proporciones de las celdas negativas y positivas, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Todos los autores no tienen ningún conflicto de intereses relacionado con el contenido de este artículo.