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Artículo de método

Evaluación de la fracción perdida: diversidad, abundancia y masa de microplásticos (1-300 μm) en sistemas acuáticos

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DOI:

10.3791/68148

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22 de agosto de 2025

 ,  , 
1School of Marine and Atmospheric Science, Stony Brook University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una metodología que se aplicará a las muestras acuáticas recogidas en filtros para detectar, identificar y cuantificar MP de tamaño micrométrico (1-300 μm). La microespectroscopia Raman puede identificar la estructura química polimérica de las partículas de MP y cuantificar su abundancia en términos del número de partículas y su masa en las muestras de agua.

Resumen

El protocolo presentado aquí permite la cuantificación de microplásticos (MPs) tan pequeños como ~1 μm de diámetro, la identificación precisa de los tipos de polímeros y la estimación del volumen de partículas, lo que permite fundamentalmente el cálculo de la masa de MP. Los resultados representativos de las muestras recogidas en Great South Bay (GSB), Nueva York, mostraron que las partículas dentro del rango de diámetro esférico equivalente (ESD) de 1 a 6 μm eran las más abundantes, con aproximadamente el 75% de las partículas que medían menos de 5 μm. En particular, el paso previo al tamizado no produjo partículas mayores de 60 μm, lo que sugiere que los MP grandes eran raros en los sitios costeros muestreados. Antes de la filtración, se utilizó un paso de oxidación química para eliminar los desechos orgánicos, lo que facilitó la filtración de volúmenes de agua más grandes (>1 L) de muestras discretas recolectadas en botellas y redujo la obstrucción del filtro. Si bien este enfoque mejoró significativamente la eficiencia de filtración, los aspectos de la metodología aún requieren refinamiento para reducir el tiempo total requerido para la preparación de muestras y el análisis de datos. La microespectroscopia Raman y el procesamiento de datos asociado siguen requiriendo mucho tiempo, especialmente para analizar con precisión partículas de menos de 10 μm en matrices ambientales complejas. Los esfuerzos continuos se centran en minimizar las incertidumbres analíticas, optimizar el equilibrio entre la precisión del recuento de partículas y el tiempo de procesamiento, y reducir los artefactos en el flujo de trabajo de detección.

Introducción

Los microplásticos (MP) son un grupo muy heterogéneo de partículas que varían ampliamente en tamaño, forma, color, densidad, composición química y otras propiedades físicas, lo que hace que su identificación y cuantificación seanparticularmente desafiantes. Se han empleado una variedad de métodos analíticos en los estudios de MP, desde técnicas visuales como la microscopía óptica2 hasta enfoques químicos más avanzados como la pirólisis-cromatografía de gases3. La microscopía óptica es un método comúnmente utilizado para caracterizar MP más grandes (típicamente 0.5-5 mm) debido a su simplicidad, velocidad y rentabilidad1. Permite la identificación visual y la cuantificación de partículas similares al plástico al tiempo que proporciona información sobre la morfología y estructura de la superficie2. Sin embargo, esta técnica no proporciona información química sobre la composición química y se basa en la experiencia del analista. La identificación errónea es una limitación bien documentada del análisis visual, con tasas de error informadas que oscilan entre el 20% y el 70%, particularmente para partículas pequeñas y transparentes. Tales errores pueden sobrestimar significativamente las concentraciones de MP en muestras ambientales4.

Por otro lado, la cromatografía de gases por pirólisis (GC) combinada con la espectrometría de masas (MS) puede proporcionar información detallada sobre la composición química de los MP mediante el análisis de los productos de degradación térmica3. Cuando se combina con un paso de desorción térmica, también puede detectar aditivos plásticos durante el mismo análisis5. Sin embargo, este método requiere la preselección manual de partículas similares al plástico y su colocación cuidadosa en el sistema de pirólisis, lo que da como resultado un bajo rendimiento de la muestra1.

Para superar las limitaciones de los métodos tradicionales, las técnicas automatizadas que permiten tanto la identificación como la cuantificación de los MP son cada vez más esenciales. La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) y Raman proporciona una identificación precisa de polímeros a través de sus huellas dactilares espectrales únicas 6,7,8. Estos métodos de espectroscopia vibracional detectan vibraciones moleculares inducidas por la luz, el láser para Raman y el infrarrojo para FTIR, produciendo espectros que reflejan estructuras moleculares específicas7. Ambas técnicas han avanzado significativamente en la detección y caracterización de pequeñas partículas de MP (<300 μm) en diversas matrices ambientales8. Reducen los falsos positivos al confirmar químicamente las partículas similares al plástico, minimizan los falsos negativos y no son destructivos. Cuando se combinan con microscopía (microespectroscopía), estas técnicas permiten la identificación y cuantificación de partículas poliméricas menores de 0,3 mm (con detección de μFTIR de hasta ~10 μm y μRaman de ~0,3 μm)8. Sin embargo, cada método tiene limitaciones: Raman ofrece una mayor resolución espacial y una detección mejorada para ciertos polímeros (por ejemplo, poliestireno), pero es más susceptible a la interferencia de fluorescencia y, por lo general, requiere tiempos de adquisición más largos. Sin embargo, la microespectroscopia Raman puede detectar partículas menores de 0,3 μm, cubriendo un rango de tamaño de microplástico más amplio que las imágenes FTIR 8,9.

La herramienta principal para el trabajo descrito aquí es un microespectrofotómetro Raman confocal disponible en el Laboratorio de Imágenes Moleculares NAno-Raman (NARMIL) de SoMAS. El protocolo se ha optimizado para detectar, identificar y cuantificar MP de tamaño micro (<300 μm) en filtros de muestras de agua que generalmente se excluyen cuando se utilizan redes de plancton o manta para muestrear plásticos marinos. Además, es necesario un proceso de quimiooxidación para reducir la presencia de residuos no plásticos (desechos orgánicos). Esto minimiza la interferencia analítica antes del análisis microespectroscópico Raman y, lo que es más importante, evita la obstrucción de los poros del filtro, lo que permite la filtración de mayores volúmenes de agua. Con esta tecnología, es posible detectar partículas de MP en la fracción de tamaño submicrónico a milimétrico recolectada en filtros de muestras de agua, y permite el cálculo de concentraciones específicas de MP, tamaños de partículas y masas.

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Protocolo

Este protocolo se ha modificado con respecto a la versiónoriginal 9. El protocolo es una guía para el análisis de muestras acuáticas (agua potable, río, lago, costa u océano abierto) para extraer, detectar y cuantificar MPs (<300 μm) en filtros. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Control de calidad

  1. Asegúrese de filtrar todos los reactivos a través de un filtro de membrana de 0,22 μm antes de su uso.
  2. Asegúrese de que el personal use batas de laboratorio de algodón (sin materiales sintéticos) y se lave las manos antes y entre la manipulación de muestras.
  3. Enjuague el equipo de filtración con agua destilada filtrada a 0,22 μm antes y entre filtraciones. Cubra con papel de aluminio limpio cuando no esté en uso.
  4. Espacios en blanco de campo: llene botellas de muestra enjuagadas con agua destilada filtrada de 0,22 μm y procese como muestras ambientales.
  5. Espacios en blanco de laboratorio: Procese 1 L de agua destilada filtrada de 0,22 μm a través de filtros Al2O3 junto con cada lote de muestra.

2. Recolección y preparación de muestras de agua natural para la cuantificación de MP

  1. Enjuague previamente todas las botellas de muestra (incluidos Niskin y recipientes de vidrio) con agua destilada filtrada a 0,22 μm para minimizar la contaminación.
  2. Las muestras discretas de columna de agua (>1 L) de los sistemas acuáticos se pueden recolectar utilizando métodos de muestreo estándar, por ejemplo, botellas de vidrio (agua superficial) o botellas de Niskin de cloruro de polivinilo (PVC) montadas en roseta (columna de agua) y transferirse directamente a botellas de vidrio.
  3. Prefiltrar el agua recolectada utilizando tamices metálicos de 200 μm y 60 μm para eliminar los desechos orgánicos y separar los MPs en fracciones de tamaño.
    NOTA: Las partículas retenidas se pueden identificar directamente bajo el microscopio.
  4. Almacene el agua que pasa a través del tamiz metálico de 60 μm en botellas de vidrio. Más tarde, filtre esta fracción en filtros de membrana de óxido de aluminio (Al2O3) (25 mm de diámetro, tamaño de poro de 0,2 μm).

3. Quimio-oxidación de muestras de agua

NOTA: Para minimizar la interferencia analítica de abundantes partículas biogénicas, las muestras se limpian mediante quimio-oxidación antes del análisis microespectroscópico Raman.

  1. Combine 100 ml de peróxido de hidrógeno al 30% (v/v) con 1 l de muestra en un recipiente de vidrio y mezcle bien.
    PRECAUCIÓN: Manipule H2O2 con cuidado: oxidante fuerte, puede causar irritación en la piel y los ojos. Use guantes y gafas protectoras, y siga los procedimientos de seguridad del laboratorio.
  2. Cubra el recipiente con una tapa o papel de aluminio y colóquelo en un horno a 60 °C durante ~10 h.
  3. Deje que la muestra se enfríe durante 10 min, luego proceda a la filtración mientras aún está caliente.

4. Filtración de muestras de agua

NOTA: Debido a la fragilidad inherente del filtro, se debe tener cuidado de no doblar los filtros de membrana Al2O3 durante el montaje y la extracción manipulando exclusivamente el filtro por el anillo anular de polipropileno adherido a la membrana.

  1. En una campana de flujo laminar, filtre muestras y espacios en blanco de 1 L utilizando un sistema de filtración de vidrio con una base de vidrio sinterizado y una abrazadera de metal.
  2. Después de la filtración, enjuague los filtros con agua destilada filtrada a 0,22 μm.
  3. Monte el filtro en un portaobjetos de microscopio sin cubreobjetos para el análisis Raman.

5. Análisis microespectroscópico Raman de partículas MP filtradas

NOTA: Un microespectrofotómetro Raman confocal y su software se utilizan como método analítico para identificar y cuantificar partículas de MP. El instrumento está configurado con un microscopio de epifluorescencia vertical modificado, una platina x-y-z motorizada controlada por ordenador con un tamaño de paso de 0,1 μm en todas las dimensiones, cuatro líneas láser (láser de iones Ar+ de 457/514 nm, láser He/Ne de 633 nm, láser de diodo de 785 nm) y un detector CCD refrigerado por peltier de 1.040 × 256.

  1. Utilizando la función de adquisición de imágenes en el software Raman, configure la configuración del instrumento para el análisis de muestras acuáticas por parte de MP.
    1. Láser: 633 nm He/Ne a ~9,3 mW de potencia láser (a través de un objetivo del 50×).
    2. Rejilla: 1200 líneas/mm.
    3. Rango espectral: 200-2500 cm-1.
    4. Tiempo de exposición: 0,7 s/espectro.
  2. Configure una cuadrícula dentro de una región de interés (ROI) tomando espectros cada 1 μm en las dimensiones x e y.
  3. Defina cada ROI como una cuadrícula de 100 μm x 100 μm en la imagen de la cámara (10,000 μm2).
    NOTA: El área de ROI se puede modificar; Por ejemplo, las áreas más pequeñas reducirán el tiempo total de análisis.
  4. Analice ~40 ROI por filtro, seleccionados aleatoriamente utilizando un modelo de patrón cruzado para representar la distribución espacial de MP en toda el área de filtro expuesta.
  5. Después de la recopilación automatizada de datos, utilice la función de adquisición de imágenes en el software para producir mapas químicos 2D detallados de cada ROI.
  6. A partir de cada mapa químico, identifique y cuantifique las partículas de MP utilizando el análisis de componentes (método de correlación de mínimos cuadrados no negativos) de acuerdo con las capacidades del software.
  7. Compare espectros con bibliotecas de referencia. Aceptar coincidencias con puntuación >60 (puntuación de biblioteca interna 0-100) como MP confirmados10.

6. Enumeración cuantitativa basada en filtros de partículas MP

  1. Después de sumar el número de partículas de ~40 ROI, calcule el número de partículas MP por litro de muestra (N), de acuerdo con la ecuación 111.
    figure-protocol-1(1)
    donde Af es el área total expuesta del filtro (mm2), n es el número total de partículas MP contadas sumadas en todo el ROI examinado, b el número de ROI examinadas, M el tamaño del área de un ROI (mm2) y V el volumen (l) del agua filtrada de la muestra.
  2. Establezca la incertidumbre analítica del número total de partículas (N) en cada muestra calculando el error estándar de todo el ROI contado por muestra.
  3. Indique el número total de partículas por L como N ± 1S.E.

7. Cálculos de tamaño, volumen y masa de partículas

NOTA: Determine las dimensiones, el área y el diámetro esférico equivalente (ESD) de cada partícula con la ayuda de un software de análisis de imágenes.

  1. Determine el área contando el total de píxeles positivos para plástico asignados a cada imagen de partícula.
  2. Utilice esta área de partícula (Ap) para calcular la ESD aplicando la ecuación 211:
    figure-protocol-2(2)
  3. Calcule una estimación idealizada del volumen elipsoide para cada partícula usando la ecuación 312.
    figure-protocol-3(3)
  4. Calcule las masas (M) de cada polímero plástico en el conjunto de MP utilizando estimaciones de volumen y densidades específicas publicadas (ρ; g cm3) de cada polímero plástico (es decir, M = ρV). La masa generalmente se informa en μg / L
    NOTA: Para estimar la incertidumbre propagada en el cálculo de la masa (error relativo de masa, RE = DE/media) para cada partícula, se considera la incertidumbre analítica tanto en el algoritmo de volumen como en la densidad media aplicando la siguiente ecuación13:
    figure-protocol-4(4)
    Donde R.E. vol es el error relativo (S.E. de la pendiente/pendiente) de la pendiente de regresión lineal (3-D y "volumen 2-D")9. R.E. den son las variaciones relativas (S.E. / media) en el rango de valores de densidad informados para cada polímero contenido en una partícula específica.

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Resultados

A continuación, se presentan los resultados obtenidos utilizando la versión más reciente de la metodología. El método ha sido modificado de su aplicación original 9,14. Las muestras utilizadas en este artículo son parte de un proyecto para evaluar la contaminación por MP en tres cuerpos de agua costeros principales de Long Island, Nueva York: Great South Bay, Peconic Estuary y Shinnecock Bay. Los resultados presentados aquí sirven como una prueba de concepto para...

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Discusión

Esta metodología permite la cuantificación de partículas microplásticas (MP) tan pequeñas como 1 μm de muestras de agua recolectadas en filtros, lo que permite mediciones detalladas de la abundancia de partículas, la composición química, el tamaño y la masa. Sin embargo, es esencial reconocer y abordar las fuentes de incertidumbre inherentes a este enfoque, particularmente cuando se analizan partículas menores de 10 μm en matrices ambientales complejas.

La fal...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Larissa Chraim, Anthony Hill, Alanna Chen, Maya Butkevich y Leslie Mejia por su ayuda en el laboratorio y el análisis de datos. Todos los datos espectrales Raman se produjeron en el Laboratorio de Imágenes Moleculares NAno Raman (NARMIL) de la Facultad de Ciencias Marinas y Atmosféricas de SBU, un recurso comunitario dedicado a aplicaciones de ciencias ambientales y fundado con la subvención NSF-MRI OCE-1336724. La investigación fue parcialmente apoyada por una subvención inicial de la Universidad de Stony Brook (SBU) y la Beca de Finalización de Disertación Presidencial de SBU CF21.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Papel de aluminio cualquier marca comercial
Tamices analíticos de acero inoxidableRetsch GmbH, AlemaniaDIN 4188
Filtros AnodiscWhatman
PortafiltroFisherBrand-Millipore SigmaXX1012542
Botellas de vidrioFisherBrand-Millipore Sigma02-912-313Cualquier recipiente de vidrio funciona para el proceso de muestreo
Embudo de cristaleríaFisherBrand-Millipore SigmaXX1012514
Peróxido de hidrógeno 30 %Ciencias innovadoras7722-84-1
Microespectrofotómetro Raman confocal inViaRenishaw
Campana de flujo laminarLabconco o cualquier otra campana laminar para uso de laboratorio
Abrazadera de metalFisherBrand-Millipore SigmaXX1012503
Pinzas metálicasFisherBrand-Millipore Sigma13-820-061
Portaobjetos de microscopioTermo Fisherhttps://www.thermofisher.com/
Guantes de nitriloKimtech55080-54
Membrana de nitrocelulosa flitros 0.22Tecnología de filtrado GVS 1214898
Horno de calor radialInstrumentos de línea de laboratorio 3609
Bomba de vacíoWelch25468-01 A
Cableado 5.2Renishaw

Referencias

  1. Shim, W. J., Hong, S. H., Eo, S. E. Identification methods in microplastic analysis: A review. Anal Methods. 9 (9), 1384-1391 (2017).
  2. Song, Y. K., et al. A comparison of microscopic and spectroscopic identification methods for analysis of microplastics in environmental samples. Mar Pollut Bull. 93 (1-2), 202-209 (2015).
  3. Fries, E., et al. Identification of polymer types and additives in marine microplastic particles using pyrolysis-GC/MS and scanning electron microscopy. Environ Sci Process Impacts. 15 (10), 1949-1956 (2013).
  4. Löder, M. G. J., Gerdts, G. Marine Anthropogenic Litter. Marine Anthropogenic Litter. Bergmann, M., Gustow, M., Klages, L. , 201-228 (2015).
  5. Dekiff, J. H., Remy, D., Klasmeier, J., Fries, E. Occurrence and spatial distribution of microplastics in sediments from Norderney. Environ Pollut. 186, 248-256 (2014).
  6. Käppler, A., et al. Identification of microplastics by FTIR and Raman microscopy: a novel silicon filter substrate opens the important spectral range below 1300 cm(-1) for FTIR transmission measurements. Anal Bioanal Chem. 407, 6791-6801 (2015).
  7. Araujo, C. F., Nolasco, M. M., Ribeiro, A. M. P., Ribeiro-Claro, P. J. A. Identification of microplastics using Raman spectroscopy: latest developments and future prospects. Water Res. 142, 426-440 (2018).
  8. Primpke, S., Lorenz, C., Gerdts, G. An automated approach for microplastics analysis using focal plane array (FPA) FTIR microscopy and image analysis. Anal Methods. 9, 1499-1511 (2017).
  9. Medina Faull, L. E., Zaliznyak, T., Taylor, G. T. Assessing diversity, abundance, and mass of microplastics (~1-300 µm) in aquatic systems. Limnol Oceanogr Methods. 19, 369-384 (2021).
  10. Woodall, L. C., et al. The deep sea is a major sink for microplastic debris. J Soc Open Sci. 1, 140317(2014).
  11. Engel, A. Determination of marine gel particles. Practical Guidelines for the Analysis of Seawater. Wurl, O. , CRC Press. 139-150 (2009).
  12. Hillebrand, H., Dürselen, C. D., Kirschtel, D., Pollingher, U., Zohary, T. Biovolume calculation for pelagic and benthic microalgae. J Phycol. 35 (2), 403-424 (1999).
  13. Harris, D. Quantitative Chemical Analysis. 13, W.H. Freeman and Company. New York. (2007).
  14. Medina Faull, L. E., Zaliznyak, T., Taylor, G. T. From the Caribbean to the Arctic, the most abundant microplastic particles in the ocean have escaped detection. Mar Pollut Bull. 202, 116338(2024).
  15. Munno, K., et al. Patterns of microparticles in blank samples: a study to inform best practices for microplastic analysis. Chemosphere. , (2023).
  16. Lao, W., Wong, C. S. How to establish detection limits for environmental microplastics analysis. Chemosphere. 333, 138883(2023).
  17. Dawson, A., Santana, J., Nelis, M., Cherie, D., Motti, A. Taking control of microplastics data: a comparison of control and blank data correction methods. J Hazard Mater. 443 (Part A), 130218(2023).
  18. Prata, J. C., Manana, M. J., da Costa, J. P., Duarte, A. C., Rocha-Santos, T. What is the minimum volume of sample to find small microplastics: Laboratory experiments and sampling of Aveiro Lagoon and Vouga River, Portugal. Water. 12 (4), 1219(2020).
  19. Cowger, W., et al. Reporting guidelines to increase the reproducibility and comparability of research on microplastics. Appl Spectrosc. 74 (9), 1066-1077 (2020).
  20. Schymanski, D., Goldbeck, C., Humpf, H. U., Fürst, P. Analysis of microplastics in water by micro-Raman spectroscopy: release of plastic particles from different packaging into mineral water. Water Res. 129, 154-162 (2018).
  21. Erni-Cassola, G., Gibson, M. I., Thompson, R. C., Christie-Oleza, J. A. Lost, but found with Nile Red: A novel method for detecting and quantifying small microplastics (1 mm to 20 µm) in environmental samples. Environ Sci Technol. 51 (23), 13641-13648 (2017).
  22. Tamminga, M. Nile Red staining as a subsidiary method for microplastic quantification: A comparison of three solvents and factors influencing application reliability. SDRP J Earth Sci Environ Stud. 2 (2), 165-172 (2017).
  23. Klein, M., Fischer, E. K. Microplastic abundance in atmospheric deposition within the metropolitan area of Hamburg, Germany. Sci Total Environ. 685, 96-103 (2019).

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