Innovador fraccionamiento de tejido adiposo para transformar la grasa en componentes especializados

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que puede transformar el tejido adiposo autólogo en varias sustancias componentes adiposas con diferentes propiedades y funciones fisicoquímicas.

Resumen

El injerto tradicional de tejido adiposo autólogo se usa comúnmente para el aumento de volumen y la regeneración de tejidos. Sin embargo, las propiedades físicas y biológicas uniformes de los injertos de grasa a menudo conducen a un rendimiento subóptimo en diversos escenarios de pacientes y requisitos multifacéticos. Ampliando los cimientos del trasplante de grasa autóloga, presentamos un enfoque pionero denominado trasplante autólogo de componentes adiposos. Este concepto innovador integra un protocolo meticulosamente diseñado destinado a convertir el tejido adiposo autólogo en una amplia gama de componentes adiposos, cada uno caracterizado por propiedades fisicoquímicas únicas diseñadas para abordar aplicaciones específicas en diversos contextos clínicos. A través de una serie de métodos físicos, el tejido adiposo puede transformarse en un complejo de matriz adiposa (AMC) que proporciona suficiente soporte rígido, grasa de alta densidad (HDF) para un mayor relleno, gel de fracción vascular estromal (SVF) para inyecciones pequeñas y / o precisas, y fragmento de colágeno adiposo (ACF) para arrugas finas y / o necesidades de rejuvenecimiento facial. Estos componentes adiposos distintivos poseen características inherentes que se prestan a estrategias de trasplante precisas y dirigidas, que satisfacen las demandas matizadas de las necesidades individuales de los pacientes. El novedoso protocolo de fraccionamiento de tejido adiposo muestra un gran potencial para revolucionar el injerto de tejido adiposo. Ofrece una nueva perspectiva y metodología para un trasplante más refinado y personalizado.

Introducción

El injerto de tejido adiposo autólogo es una técnica ampliamente utilizada para la mejora volumétrica y la regeneración de tejidos, impulsada por los avances en la preparación del sitio donante, la extracción de grasa, el procesamiento^{y la} implantación 1,2,3,4. Sin embargo, las propiedades físicas y biológicas uniformes de los injertos de grasa tradicionales a menudo limitan su eficacia para abordar diversas necesidades clínicas⁵. Para superar estas limitaciones, nuestro equipo de investigación ha desarrollado un innovador protocolo de fraccionamiento de tejido adiposo, transformando la grasa autóloga en componentes especializados con propiedades y funciones fisicoquímicas distintas.

El objetivo principal del protocolo es fraccionar el tejido adiposo autólogo en componentes especializados: el complejo de matriz adiposa (AMC), la fracción vascular estromal (SVF) en gel y el fragmento de colágeno adiposo (ACF), cada uno diseñado para abordar desafíos clínicos específicos. Al proporcionar componentes con propiedades únicas, como rigidez mejorada, alta densidad celular y formulaciones ricas en colágeno, el protocolo permite estrategias de trasplante precisas y dirigidas 6,7,8,9,10,11.

El injerto de grasa tradicional, si bien es efectivo para el aumento de volumen, a menudo no cumple con las demandas matizadas de escenarios clínicos complejos. Su absorción impredecible de grasa conduce a una restauración de volumen inestable. Además, debido a las propiedades físicas y biológicas uniformes de los injertos de grasa tradicionales, no pueden proporcionar un relleno específico para áreas con requisitos específicos de trasplante, como el soporte estructural, la realización de inyecciones precisas en áreas pequeñas y el logro de una estimulación específica del colágeno. Estos problemas frecuentemente requieren múltiples cirugías, lo que aumenta el dolor y la carga financiera de los pacientes ^1,2,5. Este protocolo de fraccionamiento aborda estas limitaciones enriqueciendo específicamente el tejido adiposo con un contenido de particular valor del tejido adiposo tradicional. A través de este proceso, formamos componentes de tejido adiposo con propiedades personalizadas, ofreciendo así a los médicos un conjunto de herramientas versátil para un tratamiento personalizado. En comparación con los rellenos sintéticos o el injerto de grasa tradicional, el enfoque utiliza tejido autólogo, lo que elimina el riesgo de rechazo inmunitario y garantiza la biocompatibilidad^. Además, el proceso de fraccionamiento crea componentes con propiedades únicas, como AMC, que proporciona soporte estructural y presenta una baja tasa de absorción; SVF-gel, que proporciona inyecciones precisas y se caracteriza por una alta densidad de células de la fracción vascular estromal; y ACF, un andamiaje de proteína de colágeno capaz de liberación controlada de factores grasos, que muestra potencial para aplicaciones clínicas en el rejuvenecimiento de la piel ^7,9,11. Este enfoque también reduce la necesidad de procedimientos repetidos al mejorar la retención del injerto y la satisfacción del paciente^10,12.

El concepto de fraccionamiento de tejidos biológicos para optimizar los resultados terapéuticos está bien establecido, como se ve en la separación de la sangre en plasma, glóbulos rojos y plaquetas para aplicaciones médicas específicas. En los últimos años, la investigación y las aplicaciones clínicas de los componentes del tejido adiposo también han avanzado gradualmente 13,14,15,16,17,18. Este protocolo de fraccionamiento adiposo se basa en este principio, aislando componentes con propiedades distintas para un uso clínico personalizado. Los médicos pueden determinar la idoneidad de este método teniendo en cuenta las necesidades anatómicas del paciente, los resultados deseados (por ejemplo, aumento de volumen, soporte estructural o rejuvenecimiento de la piel) y el equipo disponible. Este protocolo es particularmente efectivo para los casos que requieren un control preciso sobre las propiedades del injerto, como el rejuvenecimiento facial, la revisión de cicatrices o procedimientos reconstructivos complejos ^7,10,12.

Protocolo

Esta investigación fue aprobada por la Junta de Revisión Ética del Hospital de Nanfang, Guangzhou, China. El tejido adiposo se recolectó de donantes sanos que dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Nanfang y se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (China).

1. Preparación de la grasa

1. Anestesia general e infiltración de líquido tumescente
   1. Colocar al paciente bajo anestesia general. Durante la fase de inducción intravenosa, administrar una combinación de propofol (2 mg/kg), fentanilo (1,5 μg/kg) y rocuronio (0,6 mg/kg), seguido de mantenimiento de la profundidad de la anestesia con sevoflurano (1,5%) y remifentanilo (0,1 μg/kg/min). A lo largo del procedimiento, ajuste dinámicamente el plan de anestesia en función de la monitorización del BIS (valor objetivo 40-60), los parámetros circulatorios (MAP >65 mmHg) y el EtCO₂ (35-45 mmHg).
   2. Colocar al paciente en decúbito supino con almohadillas protectoras en los puntos de presión y desinfectar rigurosamente la zona quirúrgica con clorhexidina-alcohol. Siga los protocolos asépticos para minimizar el riesgo de infección.
   3. Infiltrar el tejido subcutáneo de la zona de liposucción (como el abdomen o el muslo) con líquido tumescente que contenga 0,06% de lidocaína y 0,001% de epinefrina utilizando una jeringa de 20 mL. Mantener una proporción de 2:1 de infiltrado con respecto al volumen previsto de extracción de grasa, ajustando el volumen total de inyección de acuerdo con las características anatómicas específicas del paciente y el tamaño del área de tratamiento.
   4. Verifique el efecto anestésico para confirmar la infiltración completa de líquido tumescente. Antes del siguiente paso, pinche o pellizque el área de la liposucción. Si el paciente siente solo una ligera presión, la infiltración es suficiente, lo que permite la recolección de grasa con menos molestias.
2. Recolección de grasa
   1. Utilice una cánula multipuerto de 3 mm con orificios laterales afilados de 1 mm de diámetro para la recolección de grasa. Realice la operación a -0,75 atm de presión de succión para minimizar el daño al tejido graso y garantizar la integridad y viabilidad de las células grasas recolectadas.
3. Preparación de grasa Coleman
   1. Deje que la grasa recolectada, que se coloca en una jeringa de 60 ml, se detenga durante 10 minutos para que los componentes líquidos se asienten en el fondo del recipiente.
   2. Deseche con cuidado la porción líquida en la parte inferior y recoja la capa superior de grasa relativamente pura para eliminar impurezas como la sangre y el líquido tumescente.
   3. Retenga la grasa recolectada en la jeringa de 60 mililitros y centrifugue a 1.200 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente para estratificar aún más los componentes.
   4. Después de la centrifugación, deseche nuevamente la porción líquida en el fondo. Retenga la capa superior de grasa, que se define como grasa de Coleman, en los 60-
      jeringa de mililitros.
4. Recolección de muestras de grasa de alta y baja densidad
   1. Transfiera los 2/3 superiores de la grasa Coleman a un tubo de ensayo de 20 ml, definiéndolo como grasa de baja densidad (LDF).
   2. Transfiera el 1/3 inferior restante de la grasa Coleman a otro tubo de ensayo de 20 ml, definiéndolo como grasa de alta densidad (HDF).

2. Extracción de componentes

1. Preparación del complejo de matriz adiposa (AMC)
   1. Pase el HDF a través de un dispositivo de filtrado con un manguito y tres tamices internos (espaciado de pantalla de filtro de 1,5 mm).
   2. Recoja el tejido adherido y deshidrételo en una bolsa de filtro de malla 100 rodeada de gasa. Determine el punto final observando el tejido a medida que se recoge con pinzas; Cuando no caen gotas de líquido evidentes sobre la recogida de las pinzas, indica que la deshidratación ha logrado el efecto deseado. El producto final se identificó como AMC. Guarde el disco duro restante para su uso futuro.
2. Extracción de gel de fracción vascular estromal (FSV)
   1. Emulsificación mecánica de LDF: Emulsionar mecánicamente el LDF pasándolo entre dos jeringas conectadas por un conector Luer-Lok hembra a hembra con un diámetro interno de 1,4 mm a una velocidad de 10 mL/s durante 1 min.
   2. Centrifugar el LDF emulsionado a 1.600 x g durante 3 min. Recoja la capa intermedia, que se asemeja a una sustancia similar a un gel, como SVF-gel.
3. Producción de fragmentos de colágeno adiposo (ACF)
   1. Pulverización de LDF: Pulverizar el LDF en un extractor especializado de ACF a 30.000 rpm durante 60 s para obtener una suspensión de grasa.
   2. Filtrado: Transfiera la suspensión de grasa a jeringas de 20 ml. Conéctelo a un filtro unidireccional de 0,25 mm, empuje el pistón y recoja el filtrado en otra jeringa de 20 mL. A continuación, conecte esta jeringa a un filtro unidireccional de 0,15 mm, vuelva a empujar el pistón y recoja el filtrado final en una tercera jeringa de 20 ml. A continuación, centrifugar la suspensión de grasa a 3.000 x g durante 3 min.
   3. Recoja la parte sólida en la parte inferior como ACF.

3. Pruebas de los componentes de la grasa

1. Ensayos de rigidez
   1. Utilice un dispositivo con un sensor de medición de fuerza que tenga un rango de 0 N a 225 N y un actuador electromagnético que permita un recorrido axial de 6 mm.
   2. Sujete cada muestra de tejido (AMC y grasa de Coleman) y aplique una precarga de 25 a 30 N para eliminar la holgura y provocar el alargamiento. Ajuste la carga de la rampa a 8 mm/s y registre electrónicamente la fuerza máxima lograda antes de que la muestra se rompiera. A continuación, el dispositivo calcula la rigidez del tejido.
2. Tinción de hematoxilina y eosina (HE) y Masson
   1. Fije las muestras en paraformaldehído al 4% para preservar su estructura. Deshidratar en gradiente de etanol para eliminar el agua, que es necesaria para el posterior proceso de incrustación.
   2. Incruste las muestras en parafina, un proceso que hace que las muestras sean más fáciles de cortar en secciones delgadas. A continuación, seccione las muestras incrustadas en parafina.
   3. Tiñe las secciones con las tinciones tricrómicas de HE y Masson. Examine las muestras mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).
3. Estudios de trasplante
   1. Seleccionamos 70 ratones desnudos de nivel Health SPF, con un peso de 15 a 18 g y una edad de 4 a 6 semanas (independientemente del sexo). Mantenga a los ratones de acuerdo con las pautas institucionales, alojados en jaulas individuales con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, y provistos de comida y agua estándar ad libitum.
   2. Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Verifique la profundidad de la anestesia con el reflejo de pellizco de los dedos del pie. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad.
   3. Inyecte 0,3 mL de AMC preparado o tejido adiposo (grasa de Coleman en el grupo de control) en los tejidos subcutáneos de cada ratón, sirviendo como línea de base del injerto de grasa. Monitoree a los animales hasta que recuperen la conciencia y luego transfiéralos a sus jaulas.
   4. En los días 7, 14, 30, 60 y 90 después del injerto, coseche los injertos separándolos cuidadosamente del tejido circundante. Mide sus volúmenes. La tasa de retención de los injertos se definió de la siguiente manera:
      tasa de retención (%) = volumen del injerto en el momento de la extracción/volumen de grasa de inyección (0,3 mL aquí) x 100%.

Resultados

A través de diversos procedimientos mecánicos realizados durante el proceso quirúrgico, transformamos con éxito el tejido adiposo en distintos componentes adiposos con diferentes características. Son, en secuencia, el AMC que proporciona un amplio soporte robusto (Figura 1A), el HDF para el relleno adicional (Figura 1B), el SVF-gel para inyecciones precisas en áreas pequeñas (Figura 1C) y el ACF para tratar las arrugas finas o las n...

Discusión

Este protocolo de fraccionamiento de tejido adiposo implica varios pasos críticos que garantizan el aislamiento exitoso de componentes especializados. En primer lugar, la centrifugación del tejido adiposo recolectado lo separa en grasa de alta densidad (HDF) y grasa de baja densidad (LDF), cada una con composiciones distintas de matriz celular y extracelular (MEC)^23,24. El HDF, rico en adipocitos viables y células de la fracción ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.001% Epinefrina	Sigma-Aldrich	E4375
0.06% Lidocaína	Sigma-Aldrich	L5647
Cánula multipuerto de 3 mm	Tulip Medical Products, San Diego, CA, EE. UU	. /
Tubos de centrífuga de 50 ml	Corning	430829
BOSE ElectroForce Dispositivo de prueba de carga	Bose Corporation	/
Colagenasa	Worthington Biochemical	LS004176
Conector Luer-Lok hembra a hembra	309628		BD Biosciences
con manguito y tamices	hecho a medida (Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.)	/
Gasa	Medline Industries	MDS093944
Kit de tinción de hematoxilina/eosina Kit de tinción	Sigma-Aldrich	HT110116
Masson Ratones desnudos	Sigma-Aldrich	HT15
	Mdical University	/
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific
Pantalla de filtro redonda de acero inoxidable (0,15 mm)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Pantalla de filtro redonda de acero inoxidable (0,25 mm)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Bolsa de filtro de malla 100 esterilizada	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Extractor de gel de fracción vascular estromal (SVF) Shanghai	Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Tripsina	Thermo Fisher Scientific	25200056
Kit de análisis Western Blot	Bio-Rad	1705061

Dispositivo de filtrado tricrómico de Southern 10010023