Protocolos experimentales de cribado, inmunocitoquímica y técnicas de imagen basadas en microscopía para Penium margaritaceum

Summary

Este informe describe los métodos fundamentales utilizados para cultivar y manipular experimentalmente el alga estreptofita unicelular, Penium margaritaceum. También proporciona protocolos fundamentales de imágenes basadas en microscopía, incluido el marcaje de células vivas con anticuerpos monoclonales y otras sondas fluorescentes y microscopía electrónica de barrido.

Abstract

La pared celular es el primer componente de la recepción/transducción de señales para una célula vegetal durante el desarrollo y cuando responde a factores abióticos y bióticos ambientales. La célula monitorea constantemente la integridad de su pared celular y la modula en respuesta al estrés. Dilucidar las modulaciones estructurales y bioquímicas específicas que ocurren en la pared celular es una tarea difícil, especialmente cuando se emplean plantas multicelulares y sus órganos/tejidos. Esto se debe a los límites en cuanto a lo que se puede resolver en una célula individual que forma parte de una red multicelular compleja. El alga estreptofita unicelular, Penium margaritaceum, se ha utilizado recientemente en investigaciones sobre la dinámica de la pectina, la plasticidad fenotípica basada en la pared celular y múltiples aspectos de la biología celular de las algas. Su fenotipo simple, su pared celular distintiva que tiene muchos componentes notablemente similares a las paredes celulares de las plantas terrestres y su facilidad en los estudios inmunocitoquímicos y experimentales lo convierten en un poderoso organismo modelo en la biología de la pared celular de las plantas. El objetivo de este estudio es proporcionar las técnicas básicas para el cultivo, la manipulación experimental y la detección de los factores estresantes aplicados. Protocolos de cribado para inmunocitoquímica, imágenes de microscopía de barrido láser confocal e imágenes de microscopía electrónica de barrido de la estructura de la pared celular. Del mismo modo, muchas de las técnicas descritas pueden modificarse para una amplia gama de otros estudios celulares y moleculares.

Introduction

La pared celular de una planta es una red polimérica compleja que tiene múltiples funciones en la vida de una célula vegetal¹. La integridad de la pared celular es monitoreada constantemente por la célula durante el desarrollo y en respuesta al estrés ambiental y, modula en química y estructura en consecuencia. Penium margaritaceum es un alga verde unicelular que ha sido utilizada recientemente en estudios de algas estreptofitas (Streptophyta, el grupo de algas verdes más estrechamente relacionadas y ancestrales de las plantas terrestres²).

Durante la....

Protocol

NOTA: Penium margaritaceum se obtiene en el Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de Göttingen, SAG; Cepa #2640.

1. Mantenimiento de las culturas

1. Mantenga el alga en un medio líquido Woods Hole (WH¹²) que también se puede complementar con extracto de agua del suelo (es decir, 40 mL por L de medio). Mantener los cultivos a 20-25 °C con un ciclo de luz: oscuridad de 16 h:8 h con 3,5 klux (74 μmol fotones/m²/s) de luz fluorescente blanca fría.
2. Prepare lo....

Results

El marcaje de la pared celular de P. margaritaceum con mAbs anti-pectina (por ejemplo, JIM5) revela una red de fibras complejadas con calcio y proyecciones que forman un patrón regular o red (Figura 1). La pectina se deposita en el centro celular o istmo, donde desplaza a la pectina más vieja hacia los polos (Figura 2). El marcaje con un anticuerpo JIM7 similar a la pectina diferente destaca la secreción inicial de pectina con alto contenido de metilest.......

Discussion

P. margaritaceum es un organismo eficaz para dilucidar la dinámica del desarrollo de la pared celular y la secreción de MEC en plantas y algas estreptófitas. Los principales atributos incluyen un hábito unicelular y facilidad en el mantenimiento del cultivo y la manipulación experimental, una pared celular primaria con una red externa de pectina y otros polímeros distintos, facilidad en el marcaje de células vivas con mAbs dirigidos a la pared celular que se pueden seguir a tiem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 ml por microcent. Tubos	Fisher Scientific	01-549-740
Microplaca de 12 pocillos	Fisher Scientific	50-233-6077
cubreobjetos de 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-016
cubreobjetos de 45 x 50 cm	Brain Research	4550-1.5D
Agar	Sigma Aldrich	A9414
anti-rata FITC	Sigma Aldrich	F6258
anti-rata TRITC	Sigma Aldrich	T4280
cloruro de calcio	Sigma Aldrich	C4981
Cambbridge stubs	EMS	75183-65
Fluoview CLSM	Evident	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
Microcentrífuga	Fisher Scientific	13-100-675
Micropipetors	BioRad	1660499EDU
Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universitä t Gö ttingen - Cultivo de Recolección de Algas en Gö ttingen University	2640
Kit	Polysphere Polysciences	18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
recubridor por pulverización catódica	EMS	Q150V
Mezclador de vórtice	Fisher Scientific	02-215-414