Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14+ humanos

Summary

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Abstract

Las células dendríticas tolerogénicas (tolDC) son un subconjunto de células dendríticas (CD) que se sabe que influyen en las células T vírgenes hacia un fenotipo de células T reguladoras (Treg). Los TolDC están actualmente bajo investigación como terapias para la autoinmunidad y el trasplante, tanto como terapia celular como método para inducir TolDC a partir de CD endógenos. Hasta la fecha, sin embargo, el número de agentes conocidos para inducir tolDCs a partir de DC ingenuas es relativamente pequeño y su potencia para generar Tregs in vivo ha sido inconsistente, en particular las terapias que inducen tolDCs a partir de DC endógenas. Esto brinda la oportunidad de explorar nuevos compuestos para generar tolerancia.

En este trabajo describimos un método para probar nuevos compuestos inmunomoduladores en CD derivadas de monocitos (moDCs) in vitro y validar su funcionalidad para generar Tregs autólogas. En primer lugar, obtenemos PBMC y aislamos monocitos CD14⁺ y linfocitos T CD3⁺ utilizando kits de separación magnética disponibles en el mercado. A continuación, diferenciamos los monocitos en moDC, los tratamos con un inmunomodulador establecido, como rapamicina, dexametasona, IL-10 o vitamina D3, durante 24 h y probamos su cambio en marcadores tolerogénicos como validación del protocolo. Por último, cocultivamos las tolDCs inducidas con linfocitos T autólogos en presencia de estimulación anti-CD3/CD28 y observamos cambios en las poblaciones de Treg y la proliferación de linfocitos T. Prevemos que este protocolo se utilizará para evaluar la eficacia de nuevos agentes inmunomoduladores para reprogramar las CD ya diferenciadas hacia tolDC.

Introduction

Las células dendríticas (CD) son mediadores críticos entre la inmunidad innata y la adaptativa. Las CD, que residen principalmente en las membranas mucosas, la piel y el tejido linfoide, son las células presentadoras de antígenos primarios (CPA)¹. Las CD absorben proteínas extrañas y las procesan y presentan en proteínas de histocompatibilidad mayor (MHC) a las células T vírgenes. Las CD expresan específicamente proteínas MHC de clase II, como el antígeno leucocitario humano-DR (HLA-DR) en humanos. El estado de activación de las CD tras la exposición al antígeno es crítico para la respuesta de las células T agu....

Protocol

Todas las muestras de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se obtuvieron del Núcleo de Inmunología Humana de la Universidad de Pensilvania de donantes no identificados con la aprobación previa de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Pensilvania con el consentimiento del paciente.

Opcional: Mientras que en este método, utilizamos PBMC recién aislados obtenidos de un laboratorio académico, las PBMC se pueden aislar de sangre completa o productos sanguíneos enriquecidos con leucoféresis. Recomendamos utilizar el método de centrifugación en gradiente....

Results

Hemos descrito un protocolo para PBMCs humanas, aislar tanto las células T CD3⁺ como los monocitos CD14⁺ utilizando kits de separación magnética disponibles en el mercado, diferenciar los monocitos en CD14^-, HLA-DR⁺, CD141⁺, CD1c⁺ moDCs utilizando GM-CSF e IL-4, tratarlos durante 24 h y cocultivar con células T autólogas con estimulación anti-CD3/CD28 durante 72 h. En la Figura 1 se muestra un esquema experimental.

Discussion

En este trabajo describimos un método fiable y versátil para evaluar la funcionalidad de agentes inmunomoduladores para inducir tolDCs a partir de moDCs y validar su funcionalidad para generar Tregs a partir de células T autógenas ex vivo. Hay varios pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, los monocitos son células notoriamente sensibles y deben obtenerse de PBMC frescas, no previamente congeladas, para obtener los mejores resultados. Los monocitos deben aislarse lo a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-10 µ L Puntas de pipeta filtradas	VWR	76322-158	Cultivo celular general
Tubo de centrífuga de 1,5 ml	VWR	77508-358	Cultivo celular general
Pipetas serológicas de 10 ml	VWR	414004-267	Cultivo celular general
100-1000 µ L Puntas de pipeta filtradas	VWR	76322-164	Cultivo celular general
Tubo cónico de 15 mL	VWR	77508-212	Cultivo celular general
20-200 µ Puntas de pipeta filtradas L	VWR	76322-160	Cultivo celular general
2-Mercaptoetanol	MP Cultivo de	células T	194834
Tubo cónico de 50 ml	VWR	21008-736	Cultivo celular general
Plato de 60 x 15 mm, Nunclon Delta	Thermo Fischer	150326	celular general
Placa inferior cónica (V) de 96 pocillos, superficie no tratada	Thermo Fischer	277143	General Cell Culture
Placa de fondo plano de 96 pocillos	Thermo Fischer	161093	General Cell Culture
APC/Cyanine7 anticuerpo CD272 antihumano (BTLA)	Biolegend	344518	Flow Cytometry
Attune NxT (láser rojo/azul, 7 canales)	Thermo Fischer	A24863	Flow Cytometry
BSA	Thermo Fischer	15260-037	General Cell Cultivo
anticuerpo monoclonal CD14 (61D3), PE	Thermo Fischer	12-0149-42	citometría de flujo
anticuerpo monoclonal CD1c (L161), PE-cianina7	Thermo Fischer	25-0015-42	citometría de flujo
anticuerpo monoclonal CD209 (DC-SIGN) (eB-h209), PerCP-cianina5.5	termo fischer	45-2099-42	citometría de flujo
, anticuerpo monoclonal CD25 (CD25-4E3), APC	Thermo Fischer	17-0257-42	Anticuerpo
monoclonal CD274 (PD-L1, B7-H1) de citometría de flujo (MIH1), PE	Thermo Fischer	12-5983-42	Anticuerpo
monoclonal CD4 de citometría de flujo (RPA-T4), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	53-0049-42
Anticuerpo monoclonal CD40 de citometría de flujo (5C3), APC	Thermo Fischer	17-0409-42
Anticuerpo monoclonal CD40 de citometría de flujo (5C3), APC-eFluor 780	Thermo Fischer	47-0409-42	Citometría de flujo
Anticuerpo monoclonal CD69 (FN50), PE	Thermo Fischer	MA1-10276	Citometría de flujo
Anticuerpo monoclonal CD86 (BU63), FITC	Thermo Fischer	MHCD8601	Citometría de flujo
Anticuerpo monoclonal CD8a (RPA-T8), PE-Cianina7	Thermo Fischer	25-0088-42	Citometría
de flujoFondo cónico (pocillo en V) Placa de 96 pocillos	Thermo Fischer	2605	Viales
, 2 ml	cultivo de células T	Thermo Fischer	430488
(DMSO), grado de secuenciación	Thermo Fischer	20688	Cultivo celular general
DPBS	Thermo Fischer	14200166	General
Cell Culture Kit de aislamiento de monocitos humanos EasySep	Stem Cell Technologies	19359	Separación celular
Kit de aislamiento de células T humanas EasySep	Cell Technologies	17951	Separación celular
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000	Separación celular
EDTA	Thermo Fischer	AIM9260G	General Cell Culture
Falcon Tubos de poliestireno de fondo redondo, 5 mL	Stem Cell Technologies	38025	Separación celular
Inhibidor de unión al receptor Fc Anticuerpo policlonal	Thermo Fischer	14-9161-73	Citometría de flujo
Suero fetal bovino	Thermo Fischer	A5670701	Cultivo celular general
Colorante de viabilidad fijable eFluor 780	Thermo Fischer	65-0865-18	Citometría de flujo
Foxp3 / Juego de tampones de tinción de factor de transcripción	Thermo Fischer	00-5523-00	Citometría de flujo
FOXP3 Anticuerpo monoclonal (PCH101), PE-cianina5.5	Thermo Fischer	35-4776-42	Citometría de flujo
HBSS	Thermo Fischer	14170-112	Cultivo celular general
Suero fetal bovino inactivado por calor	Thermo Fischer	A5670801	Cultivo celular general
HEPES (1 M)	Thermo Fischer	15630106	célula moDC
Cultivo de anticuerpo monoclonal HLA-DR (L243), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	A51009	Citometría de flujo
Activador de células T CD3/CD28/CD2 humanas	StemCell Technologies	10970	Cultivo de células T
Proteína recombinante GM-CSF humana	Thermo Fischer	300-03	moDC Cultivo celular
IL-10 humano Kit ELISA, alta sensibilidad	Thermo Fischer	BMS215-2HS	ELISA
IL-4 humana, proteína recombinante libre de animales	Thermo Fischer	AF-200-04	moDC Cultivo celular
PBMC humano (recién aislado)	UPenn HIC	N	/A
Cells Kit ELISA TNF alfa humano	Thermo Fischer	BMS223-4	ELISA
Microscopio óptico (DMi1)	Lucia	391240	de cultivo celular general
(LPS)	Invivogen	tlrl-eblps	moDC Cell Culture
LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas de infrarrojo cercano fijable	Thermo Fischer	L34975
Solución de aminoácidos no esenciales MEM de citometría de flujo (100x)	Thermo Fischer	11140050	T Cell Culture
Penicilina-Estreptomicina (100x)	Thermo Fischer	15140122	de pipetas de cultivo celular general
	VWR	77575-370	Cultivo celular general
Rapamicina, 98+%	Thermo Fischer	J62473. MF	moDC Cell Culture
RPMI 1640 con Glutamax	Thermo Fischer	61870-036	de separación de cultivos celulares generales
	Stem Cell Technologies	20144	Cóctel
estimulación de células T de separación celular (500x)	Thermo Fischer	00-4970-93	T Cell Culture
UltraComp eBead Plus Compensation Beads Thermo	Fischer	01-3333-41	Flow Set
pipetas variables	Fischer Scientific	05-403-152	Cultivo celular general