En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Resumen

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido < 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las láminas.

Resumen

La compleja estructura laminar de la retina presenta desafíos significativos para el mapeo molecular espacial completo. Las técnicas actuales para investigar la arquitectura de los tejidos y las interacciones moleculares están limitadas por restricciones técnicas que comprometen las relaciones espaciales o restringen el perfil molecular. Los métodos existentes, como el corte transversal, las preparaciones de montaje completo, las disociaciones químicas o mecánicas y las secciones gruesas de la cara , alteran la integridad del tejido, pierden el contexto espacial crítico o, en la mayoría de los casos, son simplemente incompatibles con las plataformas de secuenciación espacial de alta dimensión.

Este estudio presenta una técnica de criosección que produce secciones delgadas (<20 μm) en la cara mientras preserva las relaciones espaciales esenciales para mapear las distribuciones de las células de la retina. El método mantiene la integridad del ARN y la arquitectura de los tejidos, al tiempo que genera secciones compatibles con plataformas de análisis molecular de alto rendimiento. La integridad del ARN se mantiene porque esta técnica secciona el tejido fresco congelado, que los fabricantes de plataformas transcriptómicas espaciales admiten oficialmente en relación con el tejido postfijo. Validamos este enfoque utilizando múltiples métodos de perfil molecular, demostrando una integración exitosa tanto con la hibridación manual in situ de RNAscope (12 objetivos) como con la secuenciación espacial de xenio (300 objetivos). La técnica preserva de forma coherente la arquitectura del tejido en todas las muestras, al tiempo que mantiene la calidad del ARN adecuada para estas aplicaciones moleculares sensibles.

Este avance metodológico permite nuevas investigaciones sobre las distribuciones de los tipos de células de la retina, los gradientes moleculares a través de las láminas y los aspectos espaciales de la patología de la retina. La versatilidad de la técnica y su compatibilidad con las plataformas modernas de biología espacial proporcionan una base para el mapeo molecular completo de la compleja organización celular de la retina.

Introducción

Las neuronas de la retina han desarrollado topografías espaciales que facilitan el procesamiento de la información, que en muchas especies da lugar a especializaciones macroscópicas como fóveas, área central y rayas ^1,2,3. En contraste con la diversidad bien conocida de la distribución de los fotorreceptores, la especialización espacial de la producción de la retina, formada por las células ganglionares de la retina (RGC), es menos clara. Para la mayoría de las especies, las distribuciones espaciales de los RGC son completamente desconocidas. Incluso en el caso del ratón, posiblemente uno de los modelos de función visual de los vertebrados, menos de un tercio de los subtipos de RGC se han mapeado con técnicas tradicionales como la inmunohistoquímica de montaje completo². Estas técnicas fracasan porque la mayoría de los subtipos de RGC no tienen un marcador genético específico. En cambio, se necesita información molecular de mayor dimensión para una clasificación precisa de RGC⁴ a través de la secuenciación de ARN de una sola célula^5,6,7.

La información sobre la distribución de RGC es importante, ya que las topografías observadas en el ratón demuestran claras correlaciones ecológicas entre la ubicación de RGC y la función visual. El ejemplo más llamativo es la organización espacial de las RGC ɑON-S, que se agrupan en la retina temporal. Esta región recibe la imagen de la presa⁸ durante las conductas de caza⁹. También se sabe que los subtipos de RGC son diferencialmente susceptibles a la enfermedad¹⁰, y algunas enfermedades comunes como el glaucoma tienen un componente espacial en su progresión^11,12. Por lo tanto, una pregunta importante que enfrenta el campo es: ¿cuál es la organización espacial de los subtipos de RGC a medida que se colocan en mosaico con la retina¹? Esta brecha en el conocimiento está limitando actualmente la comprensión de otros comportamientos y enfermedades guiados visualmente.

El objetivo del presente método es abordar estas lagunas de conocimiento molecular a través de un enfoque de criosección facial que preserve las relaciones espaciales al tiempo que permite el análisis molecular de alta resolución. Las plataformas modernas de secuenciación espacial, como Xenium de 10X, representan un avance transformador en la elaboración de perfiles moleculares, ya que ofrecen información sin precedentes sobre la organización de los tejidos y las interacciones celulares. Sin embargo, estas plataformas, junto con técnicas de plexo inferior como RNAscope y métodos de secuenciación con códigos de barras espaciales como Visium, comparten una restricción técnica crítica: requieren secciones de tejido más delgadas que 20 μm. Este requisito presenta un desafío particular para el tejido de la retina, que generalmente mide 200 μm de grosor.

Hasta la fecha, los investigadores se han basado principalmente en secciones transversales al aplicar estas tecnologías al tejido de la retina¹³. Si bien las secciones transversales revelan efectivamente las relaciones moleculares dentro de las capas nucleares y plexiformes en el contexto de los circuitos verticales, son menos adecuadas para capturar las distribuciones espaciales más amplias de las células de la retina que las preparaciones de montaje completo han revelado tradicionalmente⁸. Los intentos recientes de seccionamiento de la cara se han visto limitados por las restricciones del espesor de la sección, con estudios que alcanzan solo secciones de 50 μm,¹⁴ veces más gruesas para las plataformas modernas de análisis molecular de alta complejidad. Otros enfoques históricos que se han utilizado para estudiar la lámina retiniana individual, pero que no son compatibles con las técnicas modernas de secuenciación espacial, incluyen la digestión enzimática, combinada con la disociación mecánica^15,16, o las disociaciones mecánicas solas 17,18,19,20. Aquí, presentamos una novedosa técnica de criosección diseñada específicamente para tejido retiniano delgado y curvo que supera estas limitaciones. En resumen, nuestro método consiste en extraer la cámara posterior del ojo, crear cortes en relieve a través de la retina y la esclerótica, aplanar el tejido con la retina interna contra un cubreobjetos, incrustar el tejido en OCT y, finalmente, crioseccionar desde la retina externa a la interna (Figura 1). Nuestro método mantiene las relaciones espaciales mientras produce secciones lo suficientemente delgadas (<20 μm) para herramientas de biología espacial de alta dimensión, validadas a través de la implementación exitosa con RNAscope manual (12 objetivos) y la plataforma automatizada Xenium (300 objetivos), lo que demuestra la compatibilidad en diferentes escalas de complejidad del análisis molecular.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y las pautas institucionales pertinentes que aprueban estos métodos supervisados por la Universidad de Colorado. Todos los pasos relacionados con el uso de animales y la eutanasia deben seguir las regulaciones locales y los permisos experimentales. Todos los ratones fueron alojados con atención estándar en un centro veterinario acreditado con libre acceso a alimentos y agua. Esta técnica de criosección facial se basa en las técnicas estándar de disección de retina optimizadas para ratones C57BL/6. Para desarrollar esta técnica, se utilizaron aproximadamente 150 ratones de ambos sexos, con edades comprendidas entre las 6 semanas y los 2 años de edad. La técnica final comunicada aquí tiene una tasa de éxito de aproximadamente el 95%, independientemente de las características demográficas del ratón. Tenga en cuenta que si no se indica una temperatura para un escalón, se prevé una temperatura ambiente de aproximadamente 20-25 °C. Las soluciones sin la temperatura indicada funcionarán si se enfrían y, por lo tanto, el rango de temperatura de trabajo para las soluciones es de 4 a 25 °C.

1. Disección

1. Anestesiar al ratón con isoflurano y validar la anestesia con un pellizco en el dedo del pie, o seguir las reglas y regulaciones locales para inducir y confirmar la anestesia, ya que otros métodos son igualmente apropiados.
2. Aplicar la eutanasia al ratón mediante la dislocación cervical: asegure la cabeza del ratón con una mano y la base de la cola con la otra, luego tire en direcciones opuestas. Realizar la eutanasia secundaria por decapitación.
3. Marque el polo temporal del globo en la córnea para mantener la orientación y crear un punto débil para la disección (Figura 2B y Figura 3A).
4. Sumerja el globo en la solución de Ames en un plato que contenga un trozo de papel de filtro (más grande que el globo pero más pequeño que el plato).
   NOTA: El uso de soluciones distintas a Ames provocará deterioro de la retina (Figura 4A).
5. Con pinzas afiladas #5 y tijeras de iris, retire cuidadosamente toda la musculatura, la fascia, la vasculatura y los nervios del globo (Figura 2E, F y Figura 3B) sin perforar la esclerótica (Figura 2D).
   NOTA: La perforación de la esclerótica durante este paso (Figura 4B) provocará una hernia de tejido (Figura 4C).
6. Coloque la punta de la hoja de una tijera del iris perpendicular a la marca de la córnea, con las tijeras paralelas a la cabeza del nervio óptico. Perfore el globo en esta posición (Figura 3C, D).
7. Realice una sola incisión limpia a través de la córnea y el limbo, continuando hacia la esclerótica y la retina hacia la cabeza del nervio óptico (Figura 3E).
   NOTA: No corte a través de la cabeza del nervio óptico o la esclerótica y la retina se separarán. La longitud exacta de esta incisión variará dependiendo del tamaño del globo, que puede variar drásticamente entre animales viejos y jóvenes, así como en algunas líneas de Cre en relación con los animales de tipo salvaje. Recomendamos dejar aproximadamente 1 mm de tejido entre la extensión más profunda de esta incisión y la cabeza del nervio óptico.
8. Coloque la hoja perpendicular al corte inicial (Figura 3F,G), aproximadamente 1 mm detrás del limbo (Figura 2C). Comience a cortar radialmente a través de la esclerótica y la retina.
   1. Mantenga una línea de corte constante posterior y paralela al limbo mediante el uso de pinzas afiladas para guiar y rotar el globo. Si bien lo ideal es minimizar los cortes, priorice mantener una trayectoria radial limpia. Si la retina y la esclerótica se separan, vuelva a colocar la hoja de la tijera del iris para cortarlas juntas.
      NOTA: El corte en el limbo puede causar la separación de la retina de la esclerótica durante la extracción del cristalino. Son aceptables pequeños recortes y rotaciones. Evite aplicar fuerza para asegurarlo, ya que esto corre el riesgo de hernia en la retina.
   2. Calcule la distancia posterior de 1 mm utilizando el ancho medio de la hoja de tijera del iris. Cuando no esté seguro, opte por una posición más posterior, ya que la conexión de la retina con el limbo se curva internamente. Un corte más posterior facilita la extracción plana de la retina.
9. Después de completar el corte radial paralelo al limbo, inspeccione si quedan conexiones retinianas. Córtelos cuidadosamente con unas tijeras de iris hasta que las secciones anterior y posterior del globo estén separadas.
10. Usando dos pares de pinzas afiladas #5, separe suavemente las porciones anterior y posterior del globo (Figura 3H). En los ratones mayores, las fibras transparentes pueden conectar el cristalino con la copa de la retina; Córtelos cuidadosamente con unas tijeras de iris mientras minimiza la separación entre la retina y el esclerismo.
    NOTA: El cristalino debe permanecer unido al limbo y a la córnea.
11. Usando el papel de filtro como plataforma de soporte, corte la retina en un patrón de hoja de trébol (también conocido como cruz de hierro) con tijeras de iris (Figura 3I-K).
    NOTA: Las incisiones de las hojas de trébol deben ser más cortas que la incisión de orientación primaria que se hizo inicialmente a través del limbo si se desea registrar la orientación con este corte. Recomendamos reducir el tamaño de estas tres nuevas incisiones radiales para que sean aproximadamente 1-2 mm más cortas que la incisión primaria. Si se va a utilizar una característica diferente, como el gradiente de opsina, para la orientación, es apropiado que todas las incisiones tengan la misma longitud, reteniendo siempre aproximadamente 1 mm de tejido entre la parte más profunda de la incisión y la cabeza del nervio óptico para evitar la separación de la retina y la esclerótica.
12. Repite la disección con el segundo ojo. Para minimizar la necrosis, extirpación completa de la cámara anterior del segundo ojo dentro de los 10 minutos posteriores a la eutanasia.

2. Criopreservación

1. Prepare una pipeta de plástico de transferencia desechable cortando la punta para crear una abertura más grande que la retina y la esclerótica disecadas (en lo sucesivo, la retina).
2. Succionar suavemente la retina en la pipeta y depositarla en un portaobjetos de cristal para microscopio. Con una toallita de laboratorio, retire con cuidado el exceso de solución de Ames alrededor de la retina hasta que ya no pueda flotar libremente y se pueda aplanar.
3. Con dos pinzas afiladas #5, despliega la retina y colócala plana con la copa del ojo interior hacia arriba. Dependiendo del tamaño del tejido, haga cortes en relieve de 0,5-2 mm en cada segmento de hoja de trébol para aplanar aún más la retina, ajustando cuidadosamente el tejido para evitar el pliegue (Figura 5A). Retire la solución de Ames adicional hasta que el líquido quede solo adyacente a la retina.
4. Con un cubreobjetos, presione y transfiera rápidamente la retina (Figura 5B) con el líquido circundante de modo que la esclerótica externa mire hacia arriba y la copa del ojo interna entre en contacto con el cubreobjetos, es decir, las células ganglionares de la retina miren hacia arriba (Figura 5C).
5. Verifique que la retina no esté plegada y haga los ajustes necesarios; agregue la solución Ames para facilitar la manipulación. Como el exceso de líquido hará que el tejido se enrolle, use una toallita de laboratorio para eliminar todo el exceso de solución de Ames y deje que la retina se seque al aire durante 5 a 10 segundos.
   NOTA: Si no se permite un breve secado al aire, se puede producir una separación aleatoria de tejido y OCT durante la criosección. El secado excesivo al aire puede provocar daños en los tejidos relacionados con los cristales de sal.
6. Aplique el medio OCT para cubrir la retina y use fórceps para extender esta capa de manera uniforme a través del cubreobjetos, evitando la flotación de la retina. Espere 30 s para que el medio OCT penetre en la retina.
7. Congelación instantánea de la retina en OCT (Figura 5D) utilizando una placa de metal enfriada indirectamente con vapor de nitrógeno líquido o poniéndola en contacto directo con hielo seco.
8. Guarde las retinas en hielo seco si se usan inmediatamente o en un congelador a -80 °C en una bolsa de plástico o recipiente que contenga desecantes si se almacenan a largo plazo.

3. Crioseccionamiento

1. Ajuste la cámara de criostato a -18 °C y la etapa a -12 °C. Coloque la retina en la cámara para que se equilibre con la temperatura.
2. Cree una cúpula OCT en el mandril de muestras. Si utiliza el mismo modelo de criostato, asegúrese de que esta cúpula ocupe los 2-3 anillos interiores. Una vez congelado, recorte la cúpula OCT para crear una superficie de escenario plana paralela a la cuchilla en el mandril para conservar la planitud laminar (Figura 6A).
3. Cree o anote la guía de orientación que relaciona el mandril con la etapa de criostato.
   NOTA: En el modelo de criostato que recomendamos, la guía de orientación es una línea central grabada en la posición de las 12 en punto sobre el soporte del mandril, mientras que el mandril en sí tiene un corte triangular en el anillo más externo. Juntos, nos referimos a estas características como la guía de orientación. Si su criostato no tiene tales características, le recomendamos que utilice un marcador permanente para hacer el suyo propio.
4. Prepare la retina para la transferencia con una cuchilla de afeitar eliminando el exceso de OCT que rodea la retina lateralmente y luego, separe cuidadosamente la retina del cubreobjetos para que sea móvil.
5. Retire el mandril de la platina y aplique una pequeña gota de OCT líquida a la superficie plana de la platina OCT preparada.
6. Coloque la retina directamente sobre la OCT líquida. Con un portaobjetos de vidrio preenfriado (-18 °C), presione y sostenga la retina contra la etapa de OCT durante 10-30 s hasta que se congele.
7. Aplique OCT adicional sobre la retina y la etapa para asegurar una unión completa. Congele en el área de congelación rápida del criostato. Incubar la etapa de retina/OCT en el criostato durante un mínimo de 30 minutos para asegurar una unión completa.
8. Comience a seccionar:
   1. Recorte cuidadosamente el exceso de OCT hasta que la retina se haga visible (Figura 6B). Utilice la hoja de afeitar para eliminar el exceso de OCT de los bordes de los bloques.
      NOTA: Siempre retraiga la platina antes de reanudar el seccionamiento después de cualquier corte manual y radial. Para recortar las rodajas en la cara, recomendamos utilizar el mismo grosor de corte que se utilizará para las secciones deseadas; Sin embargo, el grosor de recorte puede estar entre 10 μm y 100 μm según las preferencias del usuario.
   2. Continúe recortando mientras inspecciona las secciones para detectar la presencia de escleróticas. Cuando la esclerótica esté visible, ajuste el ángulo de la platina según sea necesario. Continúe recortando hasta que las secciones muestren una distribución uniforme de la esclerótica, lo que garantiza una planitud óptima y un área máxima de trébol en cada sección.
   3. Recoja secciones de tejido (Figura 6C).
      NOTA: El espesor óptimo dependerá del ensayo final que se realice y debe cumplir con este protocolo posterior. Por ejemplo, si se emplea xenio 10X, recomendamos secciones de 20 μm de grosor. Mientras que para 10X Visium, las secciones de 15 μm de espesor son más apropiadas.
   4. Utilice portaobjetos preenfriados y manipule las secciones para colocarlas en su posición con dos pinceles.
   5. Coloque un dedo debajo de la sección hasta que la OCT se derrita y el tejido se adhiera (aproximadamente 5 s).
   6. Regrese el portaobjetos a una superficie fría para volver a congelar el tejido.
      NOTA: Al recolectar secciones en áreas pequeñas (por ejemplo, para xenio), pueden ser necesarios varios ciclos de congelación y descongelación. Si bien esto no afecta a las técnicas basadas en sondas, puede afectar a la calidad del ARN para los enfoques de secuenciación no sesgados.
9. Guarde los portaobjetos en hielo seco para su uso inmediato, a -20 °C para el RNAscope al día siguiente y a -80 °C para el almacenamiento a largo plazo.

4. Detección de objetivos y microscopía

NOTA: Si bien la técnica es compatible con otros métodos de perfiles moleculares, detallamos RNAscope como un ejemplo validado.

1. Preparación de la muestra:
   1. Retire los portaobjetos del almacenamiento a -80 °C y caliéntelos a -20 °C durante 1 h.
      NOTA: Los portaobjetos se pueden almacenar a -20 °C durante un máximo de 12 horas antes de comenzar el resto de este procedimiento, pero no deben dejarse a -20 °C durante demasiado tiempo para minimizar la degradación del ARN.
2. Caliente rápidamente los portaobjetos a 37 °C durante 10 s.
3. Fije el pañuelo sumergiendo los portaobjetos en PFA fresco al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Lave bien los portaobjetos con 1x PBS.
5. Deshidratación de tejidos a través de series de etanol: 50% de etanol durante 5 min, 70% de etanol durante 5 min, 100% de etanol durante 5 min, 100% de etanol fresco durante 5 min.
   NOTA: Este es un paso crítico de control de calidad para el montaje de tejidos. Si se produce un desprendimiento de tejido durante la deshidratación, indica una superposición de OCT de secciones adyacentes durante el montaje. El recorte cuidadoso del exceso de OCT durante el corte y el montaje evita este problema.
6. Preparación de la barrera:
   1. Seque al aire las guías en la mesa de trabajo durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   2. Con un bolígrafo de barrera hidrofóbico, dibuje una barrera alrededor de cada sección de tejido. Deje que la barrera se seque completamente durante 5 minutos a temperatura ambiente.
7. Detección molecular:
   1. Aplicar el tratamiento con proteasa IV para la permeabilización de los tejidos.
   2. Proceda con el protocolo del fabricante para la hibridación de la sonda objetivo (2 h a 40 °C), los pasos de amplificación de señal (tres amplificadores secuenciales), la detección de fluoróforos (cuatro rondas secuenciales para la tinción de tres plexos).
8. Imagenológico:
   1. Realice la contratinción nuclear DAPI antes de cada montaje de cubreobjetos.
   2. Monte el cubreobjetos utilizando un medio de montaje antidecoloración.
   3. Imagen mediante microscopía de fluorescencia con conjuntos de filtros adecuados.
   4. Para la detección múltiple, capture el mismo campo en las cuatro rondas de detección para el registro computacional.
   5. Mantenga ajustes de exposición consistentes entre rondas para una comparación precisa de la señal.
      NOTA: Para obtener detalles completos sobre la implementación de RNAscope, consulte los protocolos del fabricante (consulte la Tabla de materiales). En el caso de plataformas totalmente automatizadas como Xenium, siga todos los pasos del protocolo del fabricante exactamente como se proporciona. Para todos los protocolos, anticipe que el fracaso debido al desprendimiento de tejido probablemente ocurrirá durante una etapa temprana de deshidratación o lavado, debido a la superposición de OCT, como se señala en este protocolo ejemplar.

Resultados

La implementación exitosa de este protocolo produce secciones de retina intactas en la cara adecuadas para múltiples enfoques de perfiles moleculares, al tiempo que mantiene las relaciones espaciales en toda la superficie de la retina. Demostramos la utilidad del protocolo a través de un enfoque de validación sistemática, que progresa desde la inmunohistoquímica convencional a través de la detección manual de ARN multiplex hasta el perfil molecular automatizado de alto rendimiento.

La...

Discusión

El método presentado aquí aborda una barrera técnica crítica en la biología espacial de la retina al permitir la producción de secciones delgadas de la cara adecuadas para las tecnologías modernas de perfiles moleculares. Los pasos más críticos del protocolo se centran en la manipulación del tejido durante la disección inicial y el control preciso de la temperatura y la hidratación durante la criopreservación y el corte. El éxito de la implementación depende especialmente de log...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ames′ Medio	Sigma-Aldrich	A1420-10X1L	Marca específica no importante
Beadsmith Thread Zap, Thread Burner	The Beadsmith Store	7.90524E+11	Se pueden usar cauterizadores alternativos
Cryostat	Leica	cm1950	Las consideraciones importantes son el volumen controlable por separado frente a la temperatura de la etapa.
Dry Ice	NA	NA	NA
Fine Science Tools Dumont #5 Fórceps Fine	Science Tools 1129500	NC9889584	Marca específica no importante
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound Fisher	Scientific	23-730-571	Marca específica no importante
Fisherbrand Pinzas/Pinzas de punta fina rectas y delgadas de alta precisión	Fisher Scientific	12-000-127	La marca específica no es importante
Fisherbrand Tijeras de disección estándar Fisher	Scientific	08-951-20	La marca específica no es importante
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	22-037-246	La marca específica no es importante
Integra Miltex Noyes Iris Scissors	Integra Miltex 181510	12-460-278	La marca específica no es importante
Microscopio de epifluorescencia de disco giratorio Olympus IX81	para Figura 7
	Scientific	12-567-400	Marca específica no importante
Instrumento de precisión Microscopio trinocular de zoom estéreo de precisión (IV) en soporte de brazo	Instrumento de precisión mundial PZMTIVBS	50-253-8607	Marca específica no importante
Microscopio de epifluorescencia Zeiss Axio Imager.M2			Seccionamiento óptico habilitado (para la Figura 8)