Aquí, presentamos un enfoque de terapia génica que administra quitosano recubierto de ABE directamente a la médula ósea mediante inyección intraósea.
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Artículo de método
Mejora de la entrega y expresión génica mediante inyección intraósea de nanopartículas de quitosano Encapsulado en plásmidos de base de adenina
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Resumen
Resumen
La administración de plásmidos exógenos en animales de experimentación es crucial en la investigación biomédica, incluida la investigación de las funciones de los genes, la elucidación de los mecanismos de la enfermedad y la evaluación de la eficacia de los fármacos. Sin embargo, la eficiencia de transfección del método actual es relativamente baja, y la introducción de plásmidos para la expresión génica a largo plazo puede verse afectada por el sistema inmunológico. Para abordar estas limitaciones, desarrollamos e investigamos un método novedoso que utiliza quitosano para encapsular plásmidos del editor de bases de adenina (ABE) y luego administrar directamente el complejo a la médula ósea de ratones mediante inyección intraósea. En este estudio, para dirigirse al gen CaMK II δ , que está estrechamente relacionado con la diferenciación de osteoclastos, utilizamos quitosano para encapsular los plásmidos de δ CaMK II de ABE. Inyectamos directamente la carga plasmídica en la cavidad de la médula ósea mediante inyección intraósea. Los resultados mostraron una alta eficiencia de edición in vivo del 14,27% en el locus A1 y del 10,69% en el locus A2 en ratones receptores. Esta novedosa estrategia no solo es especialmente adecuada para las enfermedades causadas por una función anormal de los osteoclastos, sino que también tiene un potencial significativo para avanzar en el campo de la terapia génica.
Introducción
La terapia génica se ha convertido en un enfoque prometedor en el campo de la investigación biomédica 1,2. Ofrece el potencial de tratar una variedad de trastornos mediante la introducción de plásmidos extraños en animales de experimentación para modular la expresión de genes específicos y estudiar sus efectos terapéuticos. Sin embargo, los métodos convencionales de administración han encontrado algunos problemas que limitan su efectividad y seguridad3. Las preocupaciones incluyen baja eficiencia de transfección, alto daño biológic....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Salud Animal de la Universidad de Anhui sobre el Uso y Cuidado de los Animales. En este estudio, el ABE fue generosamente donado por el profesor Tian Chi (Universidad de Ciencia y Tecnología de Shanghai, Shanghai, China; Figura 1D).
1. Construcción de plásmidos ABE
- Diseño de ARNg con la secuencia TCCATGATGCACAGACAGGA donde PAM es presentado por GAC.
- De acuerdo con la guía de la lista de cebadores de la compañía, agregue el cebador al volumen correspondiente de ....
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Resultados
Los plásmidos in vitro se inyectaron en ratones mediante inyección intraósea (Figura 1A). El tamaño medio de partícula de las nanopartículas fue de unos 202,9 nm, el potencial fue de 2,77 mV y el PDI fue de 0,22 (Figura 1B). La Figura 1C muestra la forma de la superficie de las nanopartículas observadas como esféricas por microscopía electrónica. La Figura 1D m.......
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Discusión
Para la investigación biomédica, el desafío de la administración de plásmidos exógenos a los animales implica mejorar la eficiencia de la administración y la expresión génica y, al mismo tiempo, minimizar el daño a los animales para lograr el efecto terapéutico deseado15,16. Presentamos un método novedoso de inyección intraósea de plásmidos ABE mediado por quitosano en las células de la médula ósea de ratones receptores. Esta est.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Anhui (2208085MC74, 2208085MC51) y la Fundación de Investigación Científica del Departamento de Educación de la Provincia de Anhui, China (KJ2021A0055).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de PCR de 0,2 ml, tapón plano | LABSELECT | PT-02-C | |
| Jeringa de 1 ml | Anhui Jiangnan equipo médico Co., LTD | / | |
| 1% de pentobarbital sódico | / | / | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | LABSELECT | MCT-001-150 | |
| 10 &veces; Tampón de carga de ADN | Vazyme | P022-01 | |
| 10X T4 T4 Tampón de ADN Ligasa 1 ml | TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD | 2011A | |
| 1250 μ l Punta de pipeta 102,1 mm | LABSELECT | T-001-1250 | |
| 200 μ l Puntas de pipeta 50,55 mm | LABSELECT | T-001-200 | |
| 2x Tampón Phanta Maxa | Vazyme | P505-d1 | |
| 4 ? centrífuga | Termo Fisher | 75002425 | |
| Tubo de centrífuga de 50 ml | LABSELECT | T-012-50 | |
| Placas de cultivo celular de 6 pocillos | LABSELECT | 11110 | |
| Agar-agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Amperio | Abiowell | / | |
| Quitosano | Sangon Biotech | A600614-0500 | |
| Agitador de cultivo a temperatura constante | Shanghai Zhicheng Fabricación de instrumentos analíticos Co., LTD | ZWY-200D | |
| Contador de células automatizado Countess | Thermo Fisher Scientific | Condesa II/II FL | |
| Portaobjetos y soporte para cámara de recuento de células Countess, desechables | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Tampón CutSmart | Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra | B7204SVIAL | |
| DH5 y alfa; | Biosistemas generales | CS01010 | |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | |
| Mezcla dNTP | Vazyme | P505-d1 | |
| Enzima Esp3I | NEBiolabs | R0734S | |
| Ácido etilendiaminotetraacético | VETEC (sigma-aldrich) | V900106 | |
| Suero fetal bovino | OriCell | FBSAD-01011-500 | |
| Citómetro de flujo | BD FACSCalibur | 342975 | |
| Tubo de flujo | Biotecnología Beyotime | FFC005-1de bolsa | |
| Microscopio de fluorescencia | Leica | 427019 | |
| Kit de purificación Gel Maxi | TIANGEN | DP210 | |
| Kit de extracción de ADN genómico | TIANGEN | DP304 | |
| Ácido acético glacial | Corporación del Grupo Farmacéutico Nacional de China | 10000218 | |
| Marcador de ADN GoldBand DL2,000 | SÍEN | 10501ES60 | |
| Máquina de hielo | Shanghaizhengqiao | BNS-30 | Laboratorio reservado |
| Búfer ImunoSep | Precision Biomedicals Co., LTD | 604050 | |
| Megafuge 8 Serie de centrífugas de sobremesa pequeñas | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| MEM | Tecnología de la vida | 11140050 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos | ||
| NaOH | SIGAM | S5881-500G | |
| PBS | XiGene | XG3650 | |
| Vector PCMV-SPRY-ABE8E | / | / | |
| Aparato de amplificación de PCR | Termo Fisher | AKC96300441 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Solarbio | P1400 | |
| peptona | Sangon Biotech | A505247-0500 | |
| ADN polimerasa de superfidelidad Phanta Max | Vazyme | P505-d1 | |
| Lisado de glóbulos rojos | Tiempo de beyo. | C3702 | |
| Cloruro de sodio | Corporación del Grupo Farmacéutico Nacional de China | 10019318 | |
| Sulfato de sodio | Aladdin | S433911 | |
| T-001-10 10μ l Puntas de pipeta 31,65 mm | LABSELECT | T-001-10 | |
| ADN ligasa T4 | TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD | 2011A | |
| Tris | BioFroxx | 1115KG001 | |
| Triptona | Sangon Biotech | A505250-0500 | |
| Mezclador de vórtice | sigma | Z258423 | |
| Baño de agua | Shanghaiyiheng | DK-80 | |
| YeaRed Tinción en gel de ácido nucleico | SÍEN | 10203ES76 | |
| Extracto de levadura | BBI | A610961-0500 | |
| Zetasizer Nano | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | 444203 |
Referencias
- Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
- Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med.
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Reimpresiones y permisos
