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Artículo de método

Frecuencia y distribución de cruzamientos en la meiosis de Caenorhabditis elegans mediante genotipado de SNP mediante PCR en tiempo real

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DOI:

10.3791/68183

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11 de julio de 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un método para medir las frecuencias de cruce y la distribución durante la meiosis en Caenorhabditis elegans. Se utilizó el genotipado de polimorfismo de un solo nucleótido con PCR en tiempo real para determinar el origen de los cromosomas. El mapeo de 4 puntos permitió determinar las distribuciones cruzadas de las regiones del brazo izquierdo, central y derecho de cada cromosoma.

Resumen

Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para el estudio de la meiosis. Además de las ventajas generales, como un ciclo reproductivo corto, muchas progenies y un cuerpo transparente para la obtención de imágenes, hay seis pares de cromosomas holocéntricos homólogos. Existe una fuerte interferencia de cruce y regulación de la distribución de cruce. Para medir la frecuencia de cruzamiento, se ha desarrollado el mapeo de marcadores visibles, el mapeo de recortes-SNP y la cuantificación de marcadores citológicos como precursores de la formación de cruces. Aquí, presentamos un método de genotipado de SNP modificado para medir la frecuencia y distribución de cruzamiento en la ovogénesis de C. elegans . Este método puede omitir los laboriosos pasos de la digestión de restricción y la electroforesis en gel y evitar el juicio ambiguo de las bandas de ADN sin cortar. El genotipado de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) se realiza utilizando la cepa híbrida Bristol/Hawaiian. El cruce de hermafroditas con machos que expresan myo-3p::GFP nos permite centrarnos en la ovogénesis. Un solo lisado de lombriz produce suficiente molde de ADN para los seis cromosomas. La química TaqMan basada en exonucleasa 5' y las sondas de aglutinante de ranura menor (MGB) específicas de SNP permiten la detección precisa de SNP a una tasa de genotipado de aproximadamente el 97,7%. Utilizamos la detección precisa de SNPs para medir la frecuencia de cruce en C. elegans. Este método también se puede aplicar para determinar la frecuencia de cruzamiento en mutantes masculinos o defectuosos de cruzamiento, así como para intervalos cromosómicos más específicos.

Introducción

La formación de cruzamientos entre cromosomas homólogos es esencial para la correcta segregación de los cromosomas y también para la generación de diversidad genética1. Los errores en la formación de cruzamientos causan aneuploidía, que puede conducir a infertilidad, aborto espontáneo y defectos congénitos2. La frecuencia de cruzamiento varía según la región cromosómica, el tipo de mutante, la edad y el sexo, lo que subraya la necesidad de medir con precisión la frecuencia de cruzamiento en cada una de estas condiciones 3,4,5. El objetivo general de este método es medir con precisión la frecuencia de cruzamiento de cada dominio cromosómico y, por lo tanto, determinar con precisión la distribución de los entrecruzamientos en toda la longitud del cromosoma C. elegans.

Tradicionalmente, el mapeo de dos puntos utilizando marcadores morfológicos se ha utilizado para medir la frecuencia de cruce 6,7,8,9,10. En C. elegans, los fenotipos rechonchos, cortos, de cuerpo gordo (Dpy) y de movimiento descoordinado (Unc) se utilizan a menudo para crear mapas cromosómicos6. Las ventajas de este método son su bajo costo y la capacidad de analizar muchas progenies. Las desventajas de estos métodos incluyen la limitación de la elección de los loci de interés y la imposibilidad de utilizar progenies letales porque sus fenotipos no son visibles. Con el fin de superar el inconveniente de la elección del sitio, se han utilizado transposones Tc1 como marcadores para sitios marcados con secuencias polimórficas (STS)11,12. Los Tc1s se pueden detectar mediante PCR y electroforesis. Mientras que la cepa estándar N2 de Bristol tenía 30 copias del transposón Tc1, los aislados de C. elegans de Bergerac en Francia (RW7000 y DP13) tenían 500 copias de Tc1. Así, el número y la distribución de los transposones Tc1 varían entre los aislados, y esto se utiliza para analizar los cromosomas de la progenie de gusanos híbridos entre aislados mediante PCR. Posteriormente, también se utilizaron los SNPs para medir la frecuencia y distribución del crossover 13,14. El SNP entre las cepas Bristol N2 y Hawaiian CB4856 apareció cada 1.000 pb15,16. Los SNP se detectan como polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) mediante PCR, digestión de restricción y electroforesis. Recientemente, se han propuesto sitios pequeños de inserción/deleción (InDel), así como SNPs entre Bristol N2 y Hawaiian CB4856 como marcadores más eficientes17. Sin embargo, la medición de la frecuencia de cruce mediante Tc1, RFLP e InDel requiere procesos intensivos en mano de obra, como PCR, tratamiento con enzimas de restricción y electroforesis. Si cada proceso no se optimiza en un análisis a gran escala, los resultados pueden malinterpretarse debido a factores como la precisión de la PCR, el tipo de enzima de restricción utilizada, la eficiencia de la escisión del ADN y la claridad y separación de las bandas durante la electroforesis. Por el contrario, el método propuesto utiliza el genotipado de SNP por PCR en tiempo real para facilitar una cuantificación precisa y precisa.

Los entrecruzamientos no se distribuyen aleatoriamente a lo largo de los cromosomas. En C. elegans, los cruces simples tienden a formarse con mayor frecuencia en los brazos y se suprimen en el centro 3,5. El mapeo morfológico de dos puntos no puede identificar dónde ocurren los cruces fuera de los genes marcadores. Por el contrario, el mapeo de SNP permite un aumento de los marcadores y se ha demostrado que facilita la determinación de la región exacta de un cruce a lo largo de todo el cromosoma 5,14,18. En este estudio, empleamos los límites de dominio cromosómico propuestos por Rockman y Kruyglyak5 y seleccionamos cuatro SNPs para el análisis: en ambos extremos del cromosoma y en ambos extremos de los límites centro/brazo.

Aprovechando los métodos anteriores, propusimos un método preciso y rápido de detección de SNP por PCR en tiempo real utilizando TaqMan, 5' nucleasa19 para medir el cruce entre el brazo izquierdo, el centro y el brazo derecho de cada cromosoma. Las ventajas de nuestro método frente a tecnologías alternativas, en comparación con estudios previos 20,21,22, son la precisión y la simplicidad. Este método es un método de análisis cruzado aplicado por qPCR para C. elegans y es ampliamente adecuado para los investigadores que estudian la meiosis.

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Protocolo

1. Primer cruce genético

  1. Prepare placas de apareamiento que comprendan placas normales de medio de crecimiento de nematodos (NGM) con un pequeño punto OP50 (~5 mm de diámetro) en la placa de 35 mm.
  2. Agregue tres hermafroditas L4 de la cepa Bristol N2 (o mutantes con antecedentes de Bristol) y nueve machos adultos jóvenes de la cepa hawaiana CB4856 en una placa de apareamiento (Figura 1A).
    NOTA: Para analizar mutantes con alta letalidad embrionaria, es necesario utilizar mutantes equilibrados con antecedentes Bristol y hawaianos en este cruce. Para obtener mutantes con un trasfondo hawaiano, los mutantes de Bristol deben ser cruzados con la cepa hawaiana al menos seis veces hasta que todos los sitios de interés del SNP tengan un trasfondo hawaiano. Como resultado, el mutante hawaiano contiene fondo Bristol solo en la región mutada y el cromosoma equilibrador.
  3. Incubar la placa durante 1,5 días a 20 °C para aparear las dos cepas. Transfiera cada hermafrodita a una nueva placa NGM individual con OP50.
  4. Coloque las placas en una incubadora a 20 °C durante 1 día para permitir que pongan huevos fertilizados. Transfiera cada hermafrodita a una nueva placa NGM individual con OP50.
  5. Coloque las placas en una incubadora a 20 °C durante 1 día para permitir que los huevos fertilizados vuelvan a poner. Elimina los hermafroditas. Mantenga las placas durante 0,5 a 1 día en una incubadora a 20 °C para que las progenies crezcan hasta L4.

2. Segunda cruz

  1. Escoja seis hermafroditas L4 cruzados (híbridos Bristol/Hawaiian) y 12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::GFP mitocondrial + dpy-20(+)] I (TTS24) machos Bristol en una nueva placa de apareamiento (Figura 1B).
    NOTA: La cepa insertada ccIs4251 se obtiene del Centro de Genética de Caenorhabditis, y debe cruzarse con la cepa N2 de tipo salvaje más de seis veces.
  2. Mantenga la placa durante 1,5 días a 20 °C en una incubadora para aparearse. Transfiera cada hermafrodita a una nueva placa NGM con OP50.
  3. Coloque las placas en una incubadora a 20 °C durante 1 día para permitir que pongan huevos fertilizados. Transfiera cada hermafrodita a una nueva placa NGM individual con OP50.
  4. Mantenga las placas durante 1 día en una incubadora a 20 °C para que puedan volver a poner huevos fertilizados. Transfiera cada hermafrodita parental a un tubo de PCR con 3 μL de tampón de lisis para verificar si el primer cruce fue exitoso.
  5. Comprobar los genotipos de los progenitores como un híbrido Bristol/Hawaiian por PCR en una región del cromosoma V. Separar las bandas mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5%.
    1. En el SNP, WBVar01973670, la longitud del amplicón de PCR del genoma de Bristol es de 220 pb, y la del genoma hawaiano es de 196 pb. Si los resultados de la PCR indican que los progenitores son homocigotos de Bristol, esto se debe a la autofecundación del primer cruzamiento. No utilice la progenie de estos gusanos para realizar análisis posteriores.

3. Muestreo

  1. Prepare el tampón de lisis de lombriz de la siguiente manera: 50 mM de KCL, 10 mM de Tris pH 8.2, 2.5 mM de MgCl2, 0.45% IGEPAL CA-630 (NP-40), 0.45% Tween 20 y 0.01% de gelatina. Esterilizar por filtración y almacenar a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de usar, añadir 3 μL de 20 mg/mL de proteinasa K (enH2O) a 1 mL de tampón de lisis y almacenar en alícuotas a -20 °C.
  2. Comprobar la expresión de la GFP en el músculo de la pared corporal de las progenies de la segunda cruz mediante un microscopio de disección fluorescente antes de añadir los gusanos a los tubos de PCR individuales. El aumento es de 6,1 a 55x y la longitud de onda utilizada es de 440 a 460 nm.
  3. Elija un solo gusano positivo para GFP y agréguelo a cada tubo de PCR que contenga 3 μL de tampón de lisis de lombriz (Figura 1C). Recolectó un total de 360 (90 x 4 réplicas biológicas) de progenies cruzadas de machos adultos en cada uno de los 360 tubos de PCR.
    NOTA: Para evitar recoger crías autofertilizadas, se deben seleccionar lombrices positivas para GFP para el muestreo. Los hermafroditas no apareados menores que L4 también están disponibles para el análisis de autosomas, pero debido a que tienen diferentes números de cromosomas X, los machos y los hermafroditas deben identificarse después de crecer a L4 y muestrearse al analizar el cromosoma X.
  4. Coloque las muestras en un congelador a -80 °C durante 5 min. Las muestras se pueden almacenar a -80 °C hasta que pueda comenzar la lisis.
  5. Al analizar mutantes con alta letalidad embrionaria, recoja los embriones muertos en lugar de las larvas vivas para obtener resultados imparciales. Para recoger embriones, utilice una punta de pipeta con 0,5 μL de solución de quitinasa (20 mg/mL de quitinasa, 50 mM de NaCl, 70 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2). Recoja los embriones dentro de las 4 horas posteriores a la puesta.
    NOTA: Los embriones muertos puestos hace más de 4 horas no son aptos para el análisis de PCR, probablemente debido a la degradación del ADN genómico.

4. Lisis de la muestra

  1. Ajuste los tubos de PCR en el termociclador a 60 °C durante 1 h, seguido de 95 °C durante 15 min. Agregue 100 μL de agua sin nucleasas a cada tubo y mezcle bien.
  2. Almacenar las muestras a -20 °C hasta iniciar el genotipado de SNP por PCR en tiempo real.

5. Genotipado de SNP

  1. Haga una mezcla de la siguiente manera (Figura 2). En un tubo de 1,5 mL, agregue 125 μL de Master Mix, 6 μL de ensayo de genotipado de SNP (40x), 280 μL de agua destilada (DW), cebador directo (450 nM), cebador inverso (450 nM), sonda 1 (100 nM), sonda 2 (100 nM).
    NOTA: Las sondas y los cebadores se enumeran en la Tabla 1.
  2. Mezcle bien pipeteando varias veces para asegurar una concentración uniforme. Añada 4 μL de la mezcla a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos en la base de soporte con una micropipeta de 12 canales.
  3. Añadir 1 μL de lisado que contenga cada ADN genómico a cada pocillo y mezclar pipeteando varias veces.
  4. Prepare controles positivos, es decir, homocigotos Bristol, homocigotos hawaianos e híbridos Bristol/hawaianos, y tres controles sin plantilla como controles negativos (Figura 3A).
  5. Selle la placa con una película adhesiva óptica. Presione la película enfocándose en los bordes de cada pocillo con un aplicador.
  6. Centrifuga la placa brevemente para recoger el líquido en el fondo y eliminar las burbujas de aire del líquido.
  7. Cargue la placa en el instrumento de PCR en tiempo real. Haga clic en el botón Crear nuevo experimento en el software.
  8. En la configuración Propiedades, establezca Tipo de instrumento en Sistema QuantStudio 1, Tipo de bloque en Bloque de 0,2 ml de 96 pocillos, Tipo experimental en Genotipado, Química en Reactivos TaqMan y Modo de ejecución en Rápido.
  9. En la configuración de Método, establezca Volumen en 5 μL (asegurándose de que el volumen de reacción correcto coincida con la configuración), Recuento de ciclos en 40 ciclos (predeterminado). Ajuste los ajustes de temperatura y tiempo de la siguiente manera: etapa de prelectura a 25 °C durante 30 s, etapa de retención (activación enzimática, arranque en caliente) a 95 °C durante 20 s, etapa de PCR a 95 °C durante 1 s, 60 °C durante 20 s y etapa posterior a la lectura a 25 °C durante 30 s.
  10. En la configuración de placa, haga coincidir las posiciones de las muestras y los controles con cada pocillo en la pantalla del software.
  11. Guarde el experimento en un dispositivo USB, cárguelo en el instrumento de PCR en tiempo real y haga clic en el botón Ejecutar .

6. Análisis de datos

  1. Guarde los resultados en un USB y transfiéralos a una computadora para el análisis de datos.
  2. Analice los datos delta Rn (dRn) en tiempo real utilizando la fórmula a continuación, donde Rn (reportero normalizado) es la señal de fluorescencia del colorante reportero, VIC y FAM, normalizada dividiendo por la señal de fluorescencia del colorante de referencia pasivo, ROX.
    dRn = Rn - línea de base
  3. Revisa la gráfica de discriminación alélica.
  4. Confirme la separación de los clústeres (Figura 3B). En el gráfico de discriminación alélica, los homocigotos de Bristol se agrupan en la esquina inferior derecha, los híbridos de Bristol/Hawái se agrupan en la esquina superior derecha, los homocigotos hawaianos se agrupan en la esquina superior izquierda y los controles negativos se agrupan en la esquina inferior izquierda. Utilice los siguientes códigos de color:
    Rojo: Alelo de Bristol
    Azul: alelo hawaiano
    Verde: Heterocigoto
    Negro: Control negativo
  5. Exporte los resultados a un archivo de hoja de cálculo y ensamble los datos de genotipado de las cuatro posiciones de SNP. Si hay llamadas indeterminadas en cuatro posiciones consecutivas, excluya los datos del valor N. Utilice 90 muestras por placa para el análisis.
    1. Identifique los cruces de la siguiente manera: Si el SNP en la posición #1 es un híbrido Bristol/Hawaiano, y las posiciones #2-#4 son todos los homocigotos Bristol [B/H]-[B/B]-[B/B] o la posición #1 es un homocigoto Bristol y las posiciones #2-#4 son todos los híbridos Bristol/Hawaiian [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Estos resultados indican un solo cruce entre las posiciones #1 y #2 (en algún lugar del brazo izquierdo del cromosoma). De manera similar, en el caso de [B/H]-[B/H]-[B/B] o [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H], se produce un solo cruce entre #2 y #3 (en algún lugar de la región central del cromosoma), y en el caso de [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] o [B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], Un solo cruce ocurre entre el #3 y el #4 (en algún lugar del brazo derecho del cromosoma).
      NOTA: Hay seis patrones de cruces dobles. Izquierda y derecha: [B/B]-[B/H]-[B/B] y [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], izquierda y centro: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B] y [B/H]-[B/B]-[B/H], centro y derecha: [B/B]-[B/B]-[B/B] y [B/H]-[B/H]-[B/H] y [B/H]-[B/H]-[B/H].

7. Análisis estadístico

  1. Inserte los valores en el software SPSS Statistics (IBM). Para la comparación de la distribución de cruzamiento en el brazo izquierdo, la región central y el brazo derecho de los cromosomas, inserte 82 cromosomas con un cruce en el brazo izquierdo, 20 cromosomas con un cruce en la región central y 68 cromosomas con un cruce en el brazo derecho.
  2. Realice la corrección de ANOVA y Bonferroni y determine la significación estadística utilizando un valor p de dos colas. Realice tantas comparaciones como sea necesario, como brazo izquierdo frente a centro o WT frente a mutante.

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Resultados

Detectamos los cuatro sitios SNP en el cromosoma II en C. elegans mediante un ensayo de genotipado de SNP para cuantificar la formación de entrecruzamientos por longitud completa del cromosoma, en el brazo izquierdo, en la región central y en el brazo derecho. La detección de SNP se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla maestra contiene ADN polimerasa Taq, uracil-N-glicosilasa termolábil (UNG), dNTP con dUTP y colorante ROX de referencia pasivo. La ADN polimerasa Taq se activa a 95 °...

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Discusión

Aquí, hemos introducido un método para medir la frecuencia y distribución de cruzamiento en la meiosis de C. elegans basado en el genotipado de SNP de progenies cruzadas de la especie híbrida Bristol/Hawaiian. Mientras que el método convencional de snip-SNP (RFLP) requiere electroforesis en gel después de la PCR, y la detección de bandas de ADN requiere un sistema de documentación en gel14,18, el genotipado de SNP median...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Las cepas fueron amablemente proporcionadas por el Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC), financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Agradecemos a los miembros del Laboratorio Saito por sus útiles discusiones con respecto a este trabajo. Este trabajo fue apoyado por la subvención KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS, por sus siglas en inglés) JP23K05868 a TTS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
101-1000μ l Punta de pipetaQSP111-N-Q
Solución de 0,5 mol/I-EDTA (pH 8,0)Tesque de Nacalai14347-21
Solución de hidróxido de sodio 10mol / ITesque de Nacalai94611-45
10X DreamTaq Green BufferThermo Fisher Scientific EP0713
10μ L, Punta larga, GranduadoFUKAEKASEI, WATSON110-207C
200μ L, punta estándar, graduadoFUKAEKASEI, WATSON110-705C
Agar en polvoTesque de Nacalai01028-14
AgarosaPH JapónPH108
Autoclave TOMY modelo ES-215 Esterilizador de vapor de alta presiónTOMY SEIKOES-215
Bacto peptona Digestión enzimática de proteínasThermo Fisher Scientific 211677
Ácido bóricoTesque de Nacalai05215-05
Caenorhabditis elegans Bristol tipo salvajeCentro de Genética de CaenorhabditisN2
Caenorhabditis elegans tipo salvaje hawaianoCentro de Genética de CaenorhabditisCB4856
Cloruro de calcioTesque de Nacalai06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::GFP mitocondrial + dpy-20(+)] ILaboratorio SaitoTTS24originalmente de PD4251
ColesterolTesque de Nacalai08721-62
Ensayos de genotipado de SNP TaqMan personalizadosThermo Fisher Scientific 4332077
Mezcla de solución de desoxinucleótido (dNTP)Laboratorios biológicos de Nueva InglaterraN04470
Tableta DigPrint Doc DP-T130zHerramientas biológicasDP-T130z
Hidrogenofosfato de di-potasioTesque de Nacalai28726-05
Microscopio de disecciónNikonSMZ-745 C-DS
ADN polimerasa Dream TaqThermo Fisher Scientific EP0713
Solución de bromuro de etidioTesque de Nacalai14631-94
Imprimación directa para WBVar01973670IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
gelatinaTesque de Nacalai166-31
Gilson PIPETMAN Pipeta clásicaThermo Fisher Scientific 
IGEPAL CA-630Sigma-Aldrich18896
Sulfato de magnesio heptahidratadoTesque de Nacalai21003-75
Placa de reacción óptica de 96 pocillos MicroAmpThermo Fisher Scientific N8010560
Película adherente óptica MicroAmpThermo Fisher Scientific 4311971
MiniAmp  termocicladorThermo Fisher Scientific MiniAmp
Sistema de electroforesis horizontal Mini-Sub Cell GT, bandeja de 7 x 10 cmLaboratorios Bio-Rad1704466
Nichipet EXIINichiryo00-NPX2-2
Nichipet EXII MULTINichiryo00-NPM-12VP
Pippete Mate NEONichiryo00-PMNEO
Cloruro de potasioTesque de Nacalai285-38
Dihidrogenofosfato de potasioTesque de Nacalai28720-65
Proteinasa KThermo Fisher Scientific EO0491
Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 1, 96 pocillos, 0,2 mlThermo Fisher Scientific A40426
Escalera de ADN Quick-Load Purple 1kb PlusLaboratorios biológicos de Nueva InglaterraN0550S
Imprimación inversa para WBVar01973670IDT103988737tggctactcctagtcactga
Cloruros de sodioTesque de Nacalai31319-45
Mezcla maestra TaqPath ProAmpThermo Fisher Scientific Referencia A30866
TC Dish 35, estándarSARSTEDT83.3900
Tris (hidroximetil) aminometanoTesque de Nacalai35406-75
Base TrizmaSigma-Aldrich  T1503-1KG
Interpolación 20Reactivo Yoneyama03706
WormStuff Pico de gusanoGenesee Científico59-AWP
Puntas de gusano WormStuff (90/10% Pt/Ir, calibre 30)Genesee Científico59-30PI36

Referencias

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