Un sistema interactivo en tiempo real para estudiar el comportamiento de persecución confrontacional en roedores

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para detectar y cuantificar el comportamiento de persecución depredadora en un modelo de ratón. Esta plataforma proporciona un nuevo paradigma de investigación para estudiar la dinámica y los mecanismos neuronales del comportamiento de persecución depredadora en ratones y proporcionará una plataforma estandarizada para estudiar el comportamiento de persecución.

Resumen

El comportamiento de persecución depredadora implica una serie de procesos fisiológicos importantes, como la locomoción, el aprendizaje y la toma de decisiones, que son fundamentales para el éxito de un animal en la captura de presas. Sin embargo, existen pocos métodos y sistemas para estudiar el comportamiento de persecución depredadora en el laboratorio, especialmente en ratones, un modelo de mamífero comúnmente utilizado. Los principales factores que limitan esta investigación son la incontrolabilidad de las presas vivas (por ejemplo, grillos) y el desafío de armonizar los estándares experimentales. El objetivo de este estudio fue desarrollar una plataforma interactiva para detectar y cuantificar los comportamientos de persecución depredadora en ratones con un cebo robótico. La plataforma utiliza la visión por computadora para monitorear las posiciones relativas del ratón y el cebo robótico en tiempo real para programar los patrones de movimiento del cebo robótico, y los controles deslizantes bidimensionales interactivos controlan magnéticamente el movimiento del cebo robótico para lograr un sistema de circuito cerrado. El cebo robótico es capaz de evadir a los ratones hambrientos que se acercan en tiempo real, y su velocidad y dirección de escape se pueden ajustar para imitar el proceso de persecución depredadora en diferentes contextos. Después de un corto período de entrenamiento no supervisado (menos de dos semanas), los ratones pudieron realizar la tarea de depredación con una eficiencia relativamente alta (menos de 15 s). Al registrar parámetros cinemáticos como la velocidad y las trayectorias del cebo robótico y los ratones, pudimos cuantificar el proceso de persecución en diferentes condiciones. En conclusión, este método proporciona un nuevo paradigma para el estudio del comportamiento depredador y se puede utilizar para investigar más a fondo la dinámica y los mecanismos neuronales del comportamiento de persecución depredadora.

Introducción

La persecución de presas por parte de los depredadores no solo es una demostración vívida de la lucha por la supervivencia, sino también un impulsor clave de la evolución de las especies, manteniendo el equilibrio ecológico y el flujo de energía en la naturaleza ^1,2. Para los depredadores, la actividad de perseguir presas es un esfuerzo sofisticado que involucra una variedad de procesos fisiológicos. Estos procesos incluyen los estados motivacionales que impulsan al depredador a cazar³, las habilidades perceptivas que le permiten detectar y rastrear presas ^4,5,6, las habilidades de toma de decisiones que dictan el curso de la caza⁷, la función locomotora que permite la persecución física ^8,9 y los mecanismos de aprendizaje que refinan las estrategias de caza a lo largo del tiempo ^{10. 11} de la Constitución. Por lo tanto, la persecución depredadora ha recibido mucha atención en los últimos años como un modelo de comportamiento importante y complejo.

Como modelo de mamífero ampliamente utilizado en el laboratorio, se ha documentado que los ratones cazan grillos tanto en su hábitat natural como en estudios de laboratorio¹². Sin embargo, la diversidad y la incontrolabilidad de las presas vivas en la cuantificación del comportamiento de persecución depredadora limita la reproducibilidad de los experimentos, así como el intercambio de comparaciones entre diferentes laboratorios¹³. En primer lugar, las cepas de grillos pueden ser diferentes entre los laboratorios, lo que da lugar a diferencias en las características de las presas que podrían influir en el comportamiento de persecución. En segundo lugar, los grillos individuales tienen características únicas que pueden afectar el resultado de las interacciones depredadoras¹⁴. Por ejemplo, la velocidad de escape de cada grillo puede ser diferente, lo que lleva a variabilidad en la dinámica de persecución. Además, algunos grillos pueden tener una distancia de advertencia corta, lo que podría conducir a una falta de proceso de persecución, ya que es posible que el depredador no tenga la oportunidad de perseguirlo. Finalmente, algunos grillos pueden exhibir un comportamiento defensivo y agresivo cuando están estresados, lo que complica la interpretación de los datos experimentales¹⁵. Es difícil determinar si los cambios en el comportamiento del depredador se deben a las estrategias defensivas de la presa o son inherentes a los patrones de comportamiento del depredador. Esta línea borrosa entre la defensa de la presa y las estrategias de los depredadores añade otra capa de complejidad al estudio de la persecución de los depredadores.

Reconociendo estas limitaciones, los investigadores han recurrido a las presas artificiales como un medio para controlar y estandarizar las condiciones experimentales^16,17. Se ha demostrado que siete especies de roedores, incluidos ratones, exhiben un comportamiento depredador significativo hacia las presas artificiales¹³. Por lo tanto, un cebo robótico controlable puede ser factible en el estudio del comportamiento de persecución depredadora. Al diseñar diferentes presas artificiales, los investigadores pueden ejercer un nivel de control sobre las condiciones experimentales, lo que no es posible con presas vivas^18,19. Además, un pequeño número de estudios previos han utilizado peces o presas robóticas controladas artificialmente para estudiar el comportamiento de los cardúmenes y la depredación en peces 15,17,19. Estos estudios han puesto de manifiesto el valor de los sistemas robóticos para proporcionar estímulos consistentes, repetibles y manipulables para la investigación experimental, pero a pesar de estos avances, el campo del comportamiento de los roedores, especialmente en ratones, carece de una plataforma dedicada a detectar y cuantificar el comportamiento de persecución de los depredadores utilizando cebos robóticos.

Basándonos en las razones anteriores, diseñamos una plataforma interactiva en tiempo real de código abierto para estudiar el comportamiento de persecución depredadora en ratones. El cebo robótico de la plataforma puede escapar de los ratones en tiempo real, y el cebo robótico es altamente controlable, por lo que podemos establecer diferentes direcciones o velocidades de escape para simular diferentes escenarios de depredación. Se utilizó un programa Python en la computadora para generar los parámetros de movimiento de la presa robótica, que se combinó con un microcontrolador STM32 para impulsar los servomotores y controlar el movimiento del señuelo robótico. El sistema de hardware modular se puede adaptar al entorno de laboratorio específico en tiempo real, y el sistema de software puede ajustar la dificultad del sistema, así como los indicadores, para servir mejor al propósito de la investigación de acuerdo con las necesidades experimentales. El sistema liviano permite una reducción significativa en el tiempo de procesamiento de la computadora, lo cual es esencial para la efectividad del sistema y mejora su portabilidad. La plataforma admite las siguientes características técnicas: presas artificiales flexibles y controlables para facilitar la repetición y el modelado; máxima simulación del proceso de caza en un entorno natural; interacción en tiempo real y baja latencia del sistema; la escalabilidad del hardware y el software, así como la escalabilidad; rentabilidad y facilidad de uso. Con esta plataforma, hemos entrenado con éxito a ratones para realizar tareas depredadoras en diversas condiciones y hemos podido cuantificar parámetros como la trayectoria, la velocidad y la distancia relativa durante la persecución depredadora. La plataforma proporciona un método rápido para establecer un paradigma de persecución depredadora para investigar más a fondo los mecanismos neuronales detrás de la persecución depredadora.

Protocolo

Los ratones adultos C57BL/6J (machos, de 6 a 8 semanas de edad) son proporcionados por el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica del Ejército. Todos los procedimientos experimentales se realizan de acuerdo con las directrices institucionales de bienestar animal y están aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica del Ejército (No. AMUWEC20210251). Los ratones se alojan en condiciones de temperatura controlada (22-25 °C) con un ciclo inverso de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas de 20:00 a 8:00) y libre acceso a alimentos y agua.

1. Preparación de hardware para la plataforma interactiva en tiempo real

1. Monte una cámara web en una barra transversal sobre toda la plataforma para monitorear las posiciones del mouse y el cebo robótico en la arena de abajo en tiempo real y transmitir las imágenes a la computadora (Figura 1A).
2. Diseñe una gran arena circular (800 mm de diámetro, 300 mm de altura) que consta de un panel acrílico cuadrado en la parte inferior y un tubo acrílico como borde. Coloque cuatro íconos espaciados uniformemente (cuadrado, triángulo, círculo y cruz) en las paredes interiores de la arena para que sirvan como señales visuales (Figura 1B).
   NOTA: La pared interior del tubo acrílico y la superficie de la placa acrílica cuadrada deben cubrirse con una etiqueta opaca.
3. Utilice un imán redondo de neodimio (40 mm de diámetro, 10 mm de altura, los grillos miden unos 2-4 cm de longitud ^4,22) con gránulos de comida (5 × 0,2 mg) como cebo robótico. Coloque una pegatina azul en la superficie del imán para su identificación y ubicación.
4. Monta un deslizador bidimensional (con un recorrido efectivo de 1000 mm) debajo de la arena. Instale otro imán de neodimio en su portador como un imán de tracción para tirar magnética y remotamente del cebo robótico.
5. Accione el imán extractor mediante servomotores controlados por una placa STM32 y un circuito de conmutación. Utilizando el modo de velocidad-dirección para accionar un servomotor (75 mm por 16.000 pulsos), la frecuencia de la onda PWM en el puerto de salida de la placa STM32 codifica la velocidad, y los niveles altos o bajos (3,3 V o 0 V) codifican la dirección de avance o retroceso (Figura 1C).
   NOTA: El circuito de conmutación se muestra en la Figura complementaria 1, que solo muestra el diagrama de conexión de la señal de velocidad y dirección requerido para el movimiento de una corredera y el control de la otra corredera de la misma manera. Los cables de tierra en los dos circuitos de control de deslizamiento se pueden conectar entre sí.

2. Diseño de software para plataforma interactiva en tiempo real

1. Utilice el programa principal para detectar la posición relativa del ratón y el cebo robótico y para transmitir la señal de movimiento del cebo robótico al microcontrolador STM32 (Figura 1D).
2. Cuando el equipo reciba imágenes de la cámara web, procese los fotogramas en el entorno de Python.
3. Convierta cada fotograma del modelo de color RGB al modelo de color HSV utilizando el módulo OpenCV²⁰ (cv2.cvtColor).
   NOTA: Dado que los ratones son recolectores nocturnos y para la estabilidad de la identificación, los experimentos deben realizarse en condiciones de iluminación baja y estable, asegurando condiciones de iluminación consistentes en la arena y evitando sombras parciales. La iluminación en este experimento fue de aproximadamente 95 lux.
4. Adquiera imágenes de máscara del ratón y del cebo robótico en función de sus gamas de colores en el modelo de color HSV, respectivamente (cv2.inRange).
5. Aplique el filtrado de mediana a la imagen de la máscara para que los contornos del ratón y del cebo robótico sean más claros y estables (cv2.medianBlur).
6. Obtenga la información de contorno del ratón y del cebo robótico utilizando la función de detección de contornos (cv2.findContours) y, a continuación, encuentre un rectángulo mínimo que pueda cubrir el área de contorno. Utilice las coordenadas centrales de este rectángulo como la posición del ratón y del cebo robótico, respectivamente, y guárdelos como archivos TXT.
7. A partir de la información de posición del ratón y del cebo del robot en cada fotograma, calcule la velocidad del ratón y la distancia relativa al cebo del robot y guarde estos parámetros como archivos TXT.
   NOTA: Teniendo en cuenta el costo de tiempo de los cálculos relacionados con el procesamiento de imágenes, la velocidad de procesamiento real del script es de aproximadamente 41 fps, lo que significa que el sistema puede detectar movimientos de cebo robótico y del mouse en aproximadamente 24 ms. El retraso del sistema que se probó entre el envío de un comando de movimiento y la detección de movimiento es de 59,4 ± 7,3 ms (n = 8), por lo que el retraso entre el movimiento del ratón y el movimiento de la presa desencadenado por el ratón es de unos 83 ms (los grillos tienen un tiempo de reacción de menos de 250 ms²²).
8. Dependiendo de la distancia relativa entre el ratón y el cebo robótico y sus respectivas posiciones en la arena, determine la estrategia de escape del cebo robótico 21,22,23.
   NOTA: Si el ratón está relativamente lejos del cebo robótico (>250 mm), se supone que el cebo robótico está en una zona segura. Supongamos que el ratón está lo suficientemente cerca del cebo robótico (<80 mm, ya que la distancia relativa en este método se determina en función del centro del ratón y el señuelo robótico, ajustamos esta distancia umbral en función de la longitud del cuerpo del ratón, aproximadamente 11 cm, y el diámetro del señuelo, 4 cm). En ese caso, se considera que la captura es exitosa y el cebo robótico se detendrá, lo que permitirá que el ratón consuma los gránulos de comida que contiene (Figura 2A). En la estrategia de escape en línea recta, si el cebo está en el área central de la arena (distancia al límite >75 mm), lo que indica suficiente espacio en todas las direcciones de escape, se moverá en la dirección en que el mouse se está moviendo hacia sí mismo. Por el contrario, si el cebo está cerca de la pared de la arena como lo indica el área circundante (distancia al límite ≤75 mm), lo que significa espacio insuficiente para el movimiento continuo, hará un giro de 90° hacia el lado con una mayor distancia al límite de la arena (más espacio disponible, Figura 2B). En la estrategia de escape por turnos, el cebo robótico girará 90° hacia el lado con más espacio para escapar, juzgado a intervalos de 0,5 s (Figura 2C).
9. Después de determinar la estrategia de escape, haga que el script de Python codifique las señales de velocidad y dirección por separado y envíelas al STM32 a través del puerto serie (ser.port = 'COM3') a una velocidad de bits de 115200.
   NOTA: Los scripts en STM32 se compilan en entorno C. Cuando se recibe la señal de velocidad, se convierte en una onda PWM de la frecuencia correspondiente por el divisor de frecuencia y la salida del oscilador de cristal (la frecuencia del cristal STM32 es 72000000). Después de recibir la señal de dirección, la señal digital se convierte subiendo o bajando el voltaje del puerto de salida (0 o 3,3 V).
10. Utilice la grabadora de puerto serie para grabar un programa C compilado en el STM32.
11. Usa el programa de reinicio para mover el cebo robótico al centro de la arena.
    NOTA: Al detectar la posición del cebo robótico en la arena, el cebo robótico se impulsa continuamente hacia la posición central (5 cm/s), y cuando se detecta una distancia de <20 mm de la posición central, se considera que ha alcanzado el centro de la arena y deja de moverse. Ejecute el programa de reinicio antes de ejecutar el programa principal.

3. Habituación (Figura 2D)

1. Sujetar el ratón durante 12 h para reducir el peso corporal del animal al 90-95% de lo normal, con libre acceso al agua durante este periodo.
2. Primero, ejecute el programa de reinicio para mover el cebo robótico al centro de la arena y luego aísle al ratón hambriento en el borde de la arena con un deflector.
3. Establezca la ruta de guardado del archivo y la velocidad de movimiento del cebo robótico (5 cm/s) en el programa principal. A continuación, haga clic en Ejecutar y observe en la ventana de vídeo emergente si los señuelos del ratón y el robot se reconocen de forma estable.
4. Retire el deflector e inicie el temporizador para observar el comportamiento depredador del ratón durante 20 minutos, registrando el tiempo en que el ratón toma por primera vez una bolita de comida del cebo robótico. Si el ratón no lo hace, detenga el cebo y colóquelo junto al ratón para alimentarse.
5. Regrese el ratón a su jaula y permita un período de recuperación de 24 horas con libre acceso a comida y agua. Luego, repite la habituación. Si no hay diferencias significativas en el tiempo hasta la primera recuperación del alimento entre dos ensayos consecutivos dentro del mismo grupo de animales, considere que la habituación es completa. Este período suele durar de 3 a 5 ensayos.
6. Después de cada habituación, limpie la arena adecuadamente con alcohol al 75% y agua.

4. Tarea de depredación (Figura 2D)

1. Comienza la tarea de depredación inmediatamente después de la habituación.
2. Sujetar el ratón durante 12 h para reducir el peso corporal del animal al 90-95% de lo normal, con libre acceso al agua durante este periodo.
3. Primero, ejecute un programa de reinicio para mover el cebo robótico al centro de la arena y luego aísle al ratón hambriento en el borde de la arena con un deflector.
4. Establezca la ruta de guardado del archivo y la velocidad de movimiento del cebo robótico (0-60 cm/s, se pueden configurar diferentes velocidades según las necesidades experimentales) en el programa principal. A continuación, haga clic en Ejecutar y observe en la ventana de vídeo emergente si el ratón y el cebo robótico se detectan de forma estable.
5. Retire el deflector e inicie el temporizador para observar el comportamiento depredador del ratón durante 60 s.
   1. Si el ratón captura con éxito el cebo robótico dentro de los 60 segundos, cierre el programa principal y permita que el ratón coma todas las bolitas de comida antes de devolverlas a la jaula.
   2. Si el ratón no captura el cebo robótico en un plazo de 60 s, suéltalo directamente de vuelta a la jaula sin ninguna recompensa o castigo.
6. Realice una segunda ronda de tareas de depredación 4 horas después, repitiendo los pasos 4.3-4.5.
7. Permita que el mouse tenga un período de recuperación de 24 horas con libre acceso a alimentos y agua. Luego, repita la tarea de depredación. Si más del 80% de los ratones pasan menos de 15 segundos en dos ensayos consecutivos, los ratones se consideran depredadores hábiles.
8. Después de cada tarea de depredación, limpie la arena adecuadamente con alcohol al 75% y agua.

Resultados

Para escapar de un depredador, la presa a menudo emplea estrategias de escape flexibles y variables, como cambiar las velocidades de escape o huir en direcciones impredecibles 21,22,23. En este estudio, el patrón de movimiento del cebo robótico se controla de manera flexible en velocidad y dirección, de modo que podemos cambiar la dirección de escape, así como la velocidad del cebo robótico para simular la tarea de depredación e...

Discusión

En este protocolo, para lograr un control en tiempo real con baja latencia del sistema, utilizamos OpnenCV, una biblioteca de visión artificial ligera y eficiente, y un modelo de color para identificar las posiciones de los ratones y el señuelo del robot. Esto requiere que la iluminación de la arena sea relativamente estable y que se eviten las sombras en la arena tanto como sea posible para evitar interferir con la detección de los ratones negros. Para obtener una detección de contornos...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cilindro acrílico	SENTAI	PMMA	Diámetro 800 mm Altura 300 mm Espesor 8 mm
Mesa antivibración	VEOO	a medida	Longitud 1500 mm Ancho 1500 mm Altura 750 mm
Cámara	JIERUIWEITONG	HF868SS	Tamaño de píxel 3 µ m &agudo; 3 µ m 480P: 120 fps
Marco de soporte de cámara	RUITU		Ancho máximo hecho a medida 3300 mm Altura máxima 2600 mm
Placa de circuito	WXRKDZ	a medida	Longitud 60 mm Ancho 40 mm Espaciado de agujeros 2.54 mm
Computadora	DELL	Precision 5820 Tower	Inter(R) Xeon(R) W-2155 CPU NVIDIA GeForce RTX 2080Ti
Línea	DuPontTELESKY	30 cm	a medida
	Bio-serve	F07595	20 mg
Marco de soporte de plataforma	HENGDONG	OB3030	Longitud 1600 mm Altura 900 mm Ancho 800 mm
Fuente de alimentación regulada	ZHAOXIN	PS-3005D	Voltaje de salida: 0-30 V Corriente de salida: 0-3 A
Bloque magnético redondo	YPE	YPE-230213-5	Diámetro 40 mm Espesor 10 mm
Controlador de servomotor	FEREME	FCS860P	0.1 kw-5.5 kw SVPWM 220 VAC+10% ~-15% RS-485
Carril deslizante	JUXIANG	JX45	Longitud 1000 mm Ancho 1000 mm
Placa acrílica cuadrada	SENTAI	PMMA	Longitud 800 mm Ancho 800 mm Espesor 10 mm
Cuadrado Bloque magnético	RUITONG	N35	Longitud 100 mm Ancho 50 mm Espesor 20 mm
Stm32	Transistor de reloj ZHENGDIANYUANZI	F103	STM32F103ZET6 72 MHz
	Semtech	C118536	2N2222A, NPN