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Artículo de método

In vivo Aplicación del etiquetado de proximidad basado en TurboID en Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/68193

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13 de junio de 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

En este artículo

Resumen

En este estudio, establecemos un protocolo detallado para el marcaje de proximidad (PL) basado en TurboID en el ovario de D. melanogaster , que abarca desde la suplementación con biotina y la disección ovárica hasta la validación de la expresión transgénica y el enriquecimiento de péptidos biotinilados para la espectrometría de masas.

Resumen

El marcaje de proximidad (PL) es un método potente para mapear las redes de interacción proteína-proteína. Los avances en el marcaje de enzimas, especialmente TurboID, han ampliado su uso en todos los sistemas biológicos. TurboID es particularmente ventajoso para aplicaciones in vivo debido a su robustez, no toxicidad y facilidad de uso. Esta enzima biotinila promiscuamente las biomoléculas cercanas, incluidas las proteínas y los ácidos nucleicos, dentro de un rango de aproximadamente 10 nm en presencia de biotina. Aplicamos este método para investigar el interactoma del calabacín (Zuc), un factor clave en la biogénesis del ARN que interactúa con piwi (piRNA) en la membrana mitocondrial externa (OMM) en las células de la línea germinal del ovario de Drosophila melanogaster . Al expresar Zuc-TurboID en células germinales y suplementarlo con biotina, indujimos la biotinilación de las proteínas proximales de Zuc. El análisis de espectrometría de masas tras el enriquecimiento de péptidos biotinilados identificó proteínas muy próximas a Zuc, incluidos interactores bien conocidos en la biogénesis de piRNA. Curiosamente, descubrimos nuevos interactores de Zuc implicados en el plegamiento de proteínas, la organización de la membrana y el tráfico de vesículas.

Introducción

Los métodos convencionales de mapeo de interacción proteína-proteína (PPI), como la purificación de afinidad-espectrometría de masas (AP-MS) y los sistemas híbridos de levadura-2 (Y2H), a menudo no logran capturar proteínas de baja abundancia, expresadas transitoriamente o unidas a la membrana. Esta limitación surge de su incapacidad para replicar las condiciones fisiológicas nativas de una célula viva 1,2,3. Para superar estos desafíos, PL se ha convertido en una poderosa técnica para el mapeo de proteoma de alta resolución a nivel de suborgánulos in vivo. La PL aprovecha la fusión de una enzima promiscua con la proteína cebo, lo que permite a la enzima catalizar la formación de moléculas reactivas de vida corta1. Estas moléculas reactivas, como la biotina, marcan covalentemente las proteínas a unos pocos nanómetros de la proteína de fusión4. Posteriormente, las proteínas biotiniladas se aíslan y analizan por espectrometría de masas para facilitar la identificación de proteínas a gran escala 5,6.

En los últimos años, se han desarrollado varias enzimas promiscuas para avanzar en las técnicas de PL. Dos enzimas ampliamente utilizadas son la biotina ligasa (BioID) mutante R118G derivada de Escherichia coli y la enzima 2 ascorbato peroxidasa derivada de guisantes (APEX2). BioID convierte la biotina y el ATP en biotinil-5'-adenilato (bioAMP)1. Esta molécula reactiva se une covalentemente a los residuos de lisina de las proteínas cercanas en ± radio de 10 nm. Una ventaja clave de la PL basada en BioID es el uso de biotina. Es una biomolécula natural y no tóxica en los organismos vivos, lo que permite un marcaje in vivo seguro6. Sin embargo, BioID tiene limitaciones, incluida la cinética de etiquetado lenta (18-24 h) y el requisito de alta temperatura (37 °C) para una actividad catalítica óptima4. Estos rasgos pueden dificultar su aplicación en el estudio de los procesos biológicos dinámicos. Por su parte, APEX2 cataliza la formación de radicales biotina-fenoxilo en presencia de biotina-fenol y peróxido de hidrógeno (H2O2)7. Estos radicales reaccionan principalmente con la cadena lateral de aminoácidos ricos en electrones como la tirosina y también pueden unirse a la cisteína, la histidina y el triptófano8. La capacidad de marcaje rápido de la enzima peroxidasa (< 1 min) es adecuada para capturar IBP dinámicos y transitorios9. Además, tiene un rango de detección más amplio (hasta 20 nm) que la biotina ligasa. Sin embargo, el PL basado en APEX2 tiene sus inconvenientes, incluyendo el requisito de un agente oxidante tóxico,H2O2, y la baja permeabilidad de la biotina-fenol, que limitan la aplicabilidad in vivo10.

En 2018, Branon et al. desarrollaron una nueva biotina ligasa llamada TurboID, una versión mutante de 35 kD de BirA (la biotina ligasa que se encuentra en E. coli)4. Esta enzima incorpora una mutación en la posición R118 (R118S) junto con otras 15 mutaciones relativas a BirA. Exhibe una actividad catalítica dos veces mayor que BioID. La biotinilación inducida por TurboID en 10 minutos produce datos proteómicos con un tamaño y especificidad comparables a 18 h de etiquetado por BioID. Además, demuestra una excelente actividad de etiquetado a 30 °C4. Por lo tanto, TurboID es más adecuado para su aplicación en organismos como Drosophila o Caenorhabditis elegans, que comúnmente se crían a 25 °C y 20 °C, respectivamente.

En este estudio, nuestro objetivo es utilizar PL basado en TurboID para el estudio del interactoma en el ovario de Drosophila. Los protocolos descritos aquí se emplean para mapear el interactoma de Zuc en las células germinales. Zuc es una endonucleasa localizada en la membrana mitocondrial externa (OMM), que media la biogénesis de los piRNAs, pequeños RNAs no codificantes críticos para el mantenimiento de la integridad del genoma 11,12,13. Al comparar las proteínas biotiniladas identificadas en el análisis de Zuc-TurboID con las de dos controles adicionales, NES-TurboID y Tom20-TurboID, definimos distintos candidatos que interactúan con Zuc.

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Protocolo

1. PL en mosca adulta

  1. Preparación de alimentos con biotina
    1. Prepare una solución de NaOH 1 M diluyendo un caldo de NaOH 10 M en agua triplemente destilada (TDW). Guárdelo a temperatura ambiente (RT). Prepare 1 M de solución madre de biotina disolviendo 0,0049 g de biotina en polvo en 20 mL de TDW. Añadir 150-200 μL de NaOH 1 M para aumentar la solubilidad de la biotina. Vórtice para homogeneizar la solución. Almacene la solución madre de biotina a 4 °C.
    2. Saque la comida para moscas del vial y cocine en el microondas durante 2 minutos hasta que se derrita.
      NOTA: El alimento estándar para moscas contiene 5% de harina de maíz, 3% de levadura, 10% de sacarosa, 1% de agar, 0,3% de ácido propiónico y 0,3% de 4-hidroxibenzoato de metilo13.
    3. Agregue caldo de biotina al alimento derretido con una concentración final de 100 μM, luego mezcle por vórtice. Dispense inmediatamente 4,5 ml de alimento suplementado con biotina en cada vial vacío con una pipeta serológica. Deje que la comida se enfríe durante 30 minutos, coloque un tapón de algodón en el vial y almacene la biotina a 4 °C.
      NOTA: La biotina debe agregarse antes de que el alimento se enfríe y se endurezca.
  2. Alimentación con biotina
    1. Cruza las moscas transgénicas que sobreexpresan la proteína de fusión TurboID con moscas GAL4 específicas de tejidos o células 14,15,16. Como control negativo, cruce moscas de tipo salvaje con moscas conductoras GAL4 para garantizar que no se produzca la inducción de biotinilación.
    2. Alrededor de 10 días después del cruce, las progenies comenzarán a eclosionar. Disuelva el polvo de levadura seca en TDW y revuelva hasta obtener una pasta suave. Aplique una cucharada de laboratorio de pasta de levadura en la pared de un vial nuevo. Golpee suavemente el frasco viejo que contiene moscas recién eclosionadas para recoger las moscas en el fondo. Invierta el vial viejo sobre el nuevo vial que contiene pasta de levadura, asegurándose de que los bordes de ambos viales estén alineados para evitar que las moscas se escapen.
    3. Golpee esos viales juntos para transferir moscas del vial viejo a la parte inferior del vial nuevo. Una vez que se hayan transferido las moscas, vuelva a colocar de forma segura las tapas de algodón tanto en los viales nuevos como en los viejos. Espere 3 días. La pasta de levadura se puede almacenar en RT durante unos días.
      NOTA: La transferencia de moscas debe realizarse lo más rápido posible porque las moscas solo se aturdirán temporalmente.
    4. Prepare una solución de ácido propiónico al 0,5% diluyendo 250 μL de caldo de ácido propiónico en 50 mL de TDW. Guárdalo en RT.
    5. Al3º día, prepare 100 μM de solución de trabajo de biotina diluyendo 1 M de caldo de biotina en TDW, luego agregue 500 μL de ácido propiónico al 0,5%. Mezcle la solución de trabajo de biotina con levadura seca en polvo y revuelva hasta que se forme una pasta. Agregue una cucharada de laboratorio de pasta de biotina y levadura a la pared del vial de biotina para alimentos. La pasta de biotina y levadura se puede almacenar en RT durante unos días.
    6. Divide las moscas en dos grupos. Mantenga un grupo en el vial de alimentos normal como control y transfiera el otro grupo al vial de alimentos de biotina (pasta de biotina y levadura añadida) para iniciar la biotinilación. Después de 16 h de biotinilación, transfiera las moscas a un nuevo vial de alimento normal.
      NOTA: Anteriormente realizamos una prueba de alimentación con biotina durante 4 h, 8 h y 16 h. La señal de biotinilación fue más fuerte después de 16 h de alimentación, por lo que elegimos este punto de tiempo para los experimentos posteriores.
  3. Colección de ovarios de Drosophila
    1. Coloque las moscas en la almohadilla de CO2 , guarde las hembras y deseche los machos. Después de que las moscas estén debidamente anestesiadas (ya no se muevan), pipetee 1 mL de medio para insectos frío de Grace en la placa de disección.
    2. Lleva una mosca a la placa de disección con pinzas de punta fina y deja que se sumerja en el medio. Sujete el tórax de la mosca con pinzas, tenga cuidado de no aplastar el cuerpo. Luego, use otra pinza para quitar suavemente la punta de la parte posterior del abdomen (donde se encuentra la parte de los genitales).
    3. Use las pinzas para exprimir lentamente los ovarios (comenzando desde la parte superior del abdomen hasta la parte inferior).
    4. Una vez que estén fuera, retire las redes musculares y otros tejidos que rodean los ovarios. Tenga cuidado de no dañar los ovarios.
    5. Transfiera cuidadosamente los ovarios limpios a un tubo de 1.7 mL con pinzas; Mantenga el tubo en hielo. Repita los pasos 1.3.2 - 1.3.4 para las siguientes moscas.
    6. Gire el tubo a 3.500 x g durante 30 s a 4 °C y, a continuación, utilice las puntas de la micropipeta para eliminar el medio restante. Tenga cuidado de no tocar los ovarios.
    7. Congele el tubo con nitrógeno líquido y almacene los ovarios a -80 °C. Las muestras de ovario son estables durante 1 año.

2. Expresión de transgenes y detección de proteínas biotiniladas mediante ensayo Western blot

NOTA: Para el ensayo de Western blot, recoja alrededor de cinco pares de ovarios por muestra.

  1. Lisis de tejidos
    1. Descongele el tejido ovárico congelado. Añadir 50 μL de tampón de lisis RIPA (50 mM de Tris-HCl pH 8, 150 mM de NaCl, 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0,5% de desoxicolato de sodio, 1% de Triton X-100), suplementado con 1x cóctel de inhibidores de la proteasa (PI) y 1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF). Almacene el tampón de lisis RIPA (sin 1x cóctel PI y 1 mM PMSF) a 4 °C.
      NOTA: El cóctel PI y PMSF solo deben agregarse justo antes del experimento.
    2. Interrumpa los ovarios usando un homogeneizador de mano junto con un mortero de plástico (1 minuto por tubo). Es necesario un proceso de lisis de tejidos en hielo durante 10 minutos para garantizar una lisis completa, seguido de homogeneización.
    3. Centrifugar a 13.500 x g durante 10 min a 4 °C para separar el lisado de proteínas de los residuos.
    4. Pipetear el lisado de proteínas claras en un nuevo tubo de 1,7 ml (evite llevar la capa lipídica por encima) y, a continuación, almacene el lisado a -20 °C hasta su uso posterior.
  2. Medición de la concentración de proteínas mediante ensayo de ácido bicinconínico (BCA)
    1. Prepare el reactivo de trabajo (WR) de ácido bicinconínico (BCA) mezclando el reactivo A y el reactivo B en una proporción de 50:1. Mezcle 1 μL de lisado o estándar BSA diluido con 200 μL de WR en una placa de 96 pocillos (por duplicados), luego incube la placa a 37 °C durante 30 min.
      1. Calcule cuánto WR es necesario usando esta fórmula:
        (# estándares + # muestras) × (# réplicas) × (volumen WR por muestra)
        Para hacer un conjunto de patrones de proteínas, prepare varias diluciones de 2 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) en tampón de lisis RIPA (sin cóctel PI y PMSF) con concentraciones finales de 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 y 2000 μg/mL.
    2. Mida la absorbancia utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 495 nm. Genere una curva estándar a partir de los valores de absorbancia BSA y, a continuación, determine la concentración de proteínas.
  3. Ensayo de Western blot
    1. Electroforesis
      1. Añadir 30-50 μg de lisado de proteínas al tampón de carga 2x SDS. Añadir TDW (si es necesario) para obtener una concentración final de 2 μg/μL de proteína y una concentración final de 1x SDS, a continuación, hervir la muestra a 95 °C durante 10 min.
      2. Prepare el tampón de funcionamiento mezclando 25 mL de tampón MOPS 20x con 500 mL de TDW para obtener una concentración de 1x de tampón de funcionamiento. Guárdalo en RT.
      3. Enjuague los pocillos de gel Bis-Tris con 1 mL de tampón corriente (3x), luego coloque el gel Bis-Tris en la cámara de electroforesis. Llene la parte frontal de la cámara con el nuevo tampón de funcionamiento hasta que todos los pocillos estén sumergidos (± 250 mL). Llene la parte posterior de la cámara con el tampón de ejecución utilizado (la mitad del volumen del nuevo tampón de ejecución utilizado es suficiente).
      4. Cargue la muestra en el gel Bis-Tris y utilice 4 μL de escalera de proteínas preteñida como marcador. Realizar electroforesis (200 V, 30 min). Retire el gel del casete y enjuague con TDW.
    2. Transferencia de membranas
      1. Haga el tampón de transferencia agregando 20 mL de tampón de transferencia (25x stock) y 50 mL de metanol en 430 mL de TDW.
      2. Coloque un sándwich que consista en almohadillas secantes, papel de filtro, gel y membrana de nitrocelulosa en un módulo de secado. Antes de apilar una nueva capa, use un rodillo para eliminar las burbujas.
      3. Instale el módulo de transferencia en la cámara de transferencia, luego llene la cámara con 500 ml de tampón de transferencia. Transfiera proteínas durante 1 h a 175 mA.
        NOTA: El tampón de transferencia debe estar recién preparado antes del experimento.
    3. Bloqueante
      1. Agregue 5 mL de caldo Tween20 en 45 mL de TDW para hacer una solución madre Tween20 al 10%. Disuelva dos tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en 400 mL de TDW. Retire 4 mL de solución, luego agregue 4 mL de Tween20 al 10% (concentración final 0.1%) para hacer 1x solución de PBST. Guárdalo en RT.
      2. Retire la membrana seca de la cámara de transferencia, luego enjuague con 1x PBST.
        NOTA: Si es necesario incubar la membrana con diferentes anticuerpos, córtela con una cuchilla limpia de acero inoxidable de acuerdo con los tamaños de proteína esperados antes de realizar el paso de bloqueo.
      3. Para comprobar la expresión génica, utilice un 2% de BSA en 1x PBST para el paso de bloqueo (1 h, RT). Prepare una solución de BSA al 2% añadiendo 1 g de BSA en 50 ml de 1x PBST. Para las detecciones de proteínas biotiniladas, realice el bloqueo utilizando BSA al 3% en 1x PBST (durante la noche, 4 °C). Disuelva 1,5 g de polvo de BSA en 50 ml de 1x PBST para hacer una solución de BSA al 3%. Almacene las soluciones de bloqueo a 4 °C.
        NOTA: El BSA utilizado es diferente del utilizado en el ensayo BCA. El ensayo BSA para BCA es parte del kit de BCA.
    4. Incubación primaria de anticuerpos
      1. Diluir 1 μL de α-V5 en 10 mL de BSA al 2% (1:10.000) y 10 μL del gen de mantenimiento α-HSP90 en BSA al 2% (1:1.000). Agregue 2,7 μL de conjugado de estreptavidina-rábano picante peroxidasa (SA-HRP) en 9 mL de 1x solución de PBST para hacer 0,3 μg/mL DE SOLUCIÓN SA-HRP.
      2. Para comprobar la expresión génica, incubar la membrana con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Para la detección de proteínas biotiniladas, incubar la membrana durante 1 h a 4 °C. Vuelva a almacenar el anticuerpo primario a 4 °C. Se puede utilizar varias veces.
      3. Lave la membrana con 1x PBST durante 3x a RT durante 15 minutos cada uno.
    5. Incubación secundaria de anticuerpos
      1. Prepare la solución de anticuerpos secundarios añadiendo 2 μL de IgG anti-conejo o anti-ratón de cabra (peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada) en 10 mL de BSA al 2% (1:5.000).
        NOTA: Para SA-HRP, no se necesita un anticuerpo secundario. Proceda directamente al paso de visualización. Los anticuerpos secundarios deben diluirse antes del experimento.
      2. Incubar la membrana en una solución de anticuerpos secundaria durante 40 min en RT. Lave la membrana con 1x PBST durante 3x en RT durante 15 min cada una.
    6. Detección de proteínas con el método de quimioluminiscencia mejorada (ECL)
      1. Mezclar 750 μL de luminol y 750 μL de solución HRP (proporción 1:1). Mantenga la membrana húmeda en el tampón de lavado mientras prepara la mezcla.
        NOTA: Esta mezcla debe estar recién preparada antes del experimento. Como los productos químicos son sensibles a la luz, manténgalos alejados de la luz solar u otras fuentes de luz intensa (la exposición a corto plazo a la iluminación del laboratorio está bien).
      2. Sumerja la membrana en la solución durante 30 s, luego colóquela entre láminas de plástico transparente. Observe las bandas de proteínas secadas con un instrumento Chemidoc.

3. Validación de la expresión y localización de transgenes mediante tinción de inmunofluorescencia

NOTA: Para verificar la expresión génica y la localización, diseccione alrededor de cinco pares de ovarios por muestra de hembras de 2 días de edad alimentadas con pasta de levadura. Los ovarios jóvenes contienen predominantemente etapas tempranas de cámaras de óvulos, que son ideales para la tinción de inmunofluorescencia debido a la abundancia de células nodrizas (células germinales) y sus membranas relativamente permeables17. Las etapas tardías de las cámaras de huevos son más rígidas y difíciles de penetrar debido a la formación del complejo de cáscara de huevo, que comienza en la etapa 918. Para la prueba de biotinilación de proteínas, diseccione alrededor de cinco pares de ovarios por muestra de hembras de 4 días de edad alimentadas con biotina, como se describe en el paso 1.2.

  1. Preparación de la muestra
    1. Sostenga la parte posterior de un ovario disecado en su lugar con fórceps. Use otra pinza para separar suavemente el ovario en cámaras de óvulos individuales. Trabaje con cuidado para evitar romper las cámaras de los huevos. El protocolo de aislamiento en cámara de huevos se describió en detalle en19. Pipetea cuidadosamente las cámaras de huevos en un tubo de 1,7 ml, luego lávalas con 1 ml de 1x PBS (RT). Corte el borde de las puntas de las pipetas antes de pipetear para evitar que las cámaras de los huevos se atasquen en las puntas.
      NOTA: Utilice únicamente las cámaras de huevos en la etapa ≤ 9 (transparentes). Deseche los ovocitos maduros y las cámaras de óvulos en etapa tardía ≥ 10. El pipeteo hará que las cámaras de huevos floten en la solución. Por lo tanto, deje que las cámaras de huevos se asienten en el fondo (durante 5 minutos) antes de continuar con los siguientes pasos.
  2. Fijación
    1. Diluir 3.125 mL de caldo de formaldehído (FA) al 16% en 6.875 mL de 1x PBS para hacer una solución de FA al 5%. Guárdalo en RT.
      NOTA: El FA es sensible a la luz, así que manténgalo alejado de la luz.
    2. Pipetear 1 mL de formaldehído (FA) al 5% en el tubo que contiene los ovocitos. Coloque el tubo en el rotador múltiple, luego fije los ovocitos durante 30 minutos.
      NOTA: Desde la fijación hasta la etapa de tinción nuclear, los experimentos se realizan en un rotador múltiple con una rotación suave.
    3. Prepare Triton X-100 al 0,5 % en 1x PBS (1 x PBT) como solución de lavado añadiendo 10 ml de caldo Triton X-100 al 10 % en 190 ml de 1x PBS. Guárdalo en RT.
    4. Enjuague las cámaras de huevos fijas 1 vez, luego lave 3 veces a RT durante 10 min. Use 1 ml de 1x PBT para las etapas de enjuague y lavado.
  3. Bloqueante
    1. Prepare un 5% de suero fetal bovino (FBS) añadiendo 250 μL de caldo de FBS en 4,75 mL de 1x PBT.
      NOTA: Esta solución debe estar recién hecha antes del experimento.
    2. Añadir 1 mL de FBS al 5% en el tubo y realizar el paso de bloqueo durante 1 h en RT. Enjuagar los ovocitos 1 vez.
  4. Incubación primaria de anticuerpos
    1. Para comprobar la expresión y localización de transgenes, diluir 2 μL de α-V5 y 2 μL de α-ATP5A o α-Tom20 (como marcador mitocondrial) en 400 μL de 1x PBT (proporción 1:200).
      NOTA: Aunque se pueden usar dos anticuerpos juntos para teñir una muestra, sus huéspedes deben ser diferentes. Su objetivo es evitar la unión superpuesta de anticuerpos secundarios posteriores.
    2. Incubar las cámaras de huevos con 400 μL de solución de anticuerpos primarios diluidos (durante la noche, 4 °C).
      NOTA: De manera similar al ensayo Western blot, los anticuerpos primarios se pueden usar varias veces para la inmunotinción. Antes de volver a almacenar una solución de anticuerpos, asegúrese de que no contenga ninguna cámara de huevos.
    3. Enjuague las cámaras de huevos 1 vez, seguido de un lavado 3 veces a RT durante 10 minutos.
  5. Incubación secundaria de anticuerpos
    1. Diluir 2 μL de IgG α-Rb de Cabra Alexa Fluor 488 y 2 μL de IgG α-M de Cabra Alexa Fluor 594 en 400 μL de 1x PBT (proporción 1:200). Incubar cámaras de huevos con 400 μL de solución de anticuerpos secundarios diluidos durante 2 h en RT. Para la detección de biotinilación, agregue 2 μL de Alexa Fluor 594 conjugada con estreptavidina a 1x PBT (proporción 1:200) e incube junto con un anticuerpo secundario.
      NOTA: A partir de este paso, proteja la muestra de la luz. Los anticuerpos secundarios deben diluirse antes del experimento. Se pueden usar múltiples anticuerpos secundarios juntos, pero cada anticuerpo primario debe asignarse a diferentes fluoróforos que se originaron en diferentes huéspedes para evitar señales superpuestas. Por ejemplo, 488 Goat α-Rb se unirá al conejo α-V5. En cuanto al α-ATP5A de ratón, se utiliza 594 Goat α-M como anticuerpo secundario complementario. En el caso de la detección de biotinilación, se debe omitir el uso de otros colorantes con la misma longitud de onda que el conjugado de estreptavidina.
    2. Enjuague las cámaras de huevos 1 vez, seguido de un lavado 3 veces a RT durante 10 minutos.
  6. Tinción nuclear
    1. Diluir 1 μL de DAPI en 1 mL de 1x PBS (proporción 1:1.000). Incubar las cámaras de huevos con 1 mL de solución diluida de DAPI durante 5 min en RT.
      NOTA: DAPI debe diluirse recién diluido antes del experimento.
    2. Enjuague las cámaras de huevos 1 vez, seguido de un lavado 3 veces a RT durante 10 minutos.
      NOTA: Las cámaras de huevos se pueden almacenar en 1x solución de PBS a 4 °C durante unas horas antes del montaje, pero se recomienda proceder lo antes posible.
  7. Montaje de corredera
    1. Limpie el portaobjetos de vidrio con un pañuelo sin pelusa y luego anote la información de la muestra en él. Retire 1x PBS del tubo, pero deje una pequeña cantidad para evitar que se seque.
    2. Corte el borde de las puntas de las micropipetas y, a continuación, pipetee con cuidado las cámaras de huevos en el portaobjetos de vidrio. Use pinzas para distribuir cuidadosamente las cámaras de huevos en el portaobjetos de vidrio y evite que se formen grumos. Observe los portaobjetos bajo un microscopio (un aumento de 2x es suficiente) para asegurarse de que las cámaras de huevos se distribuyan uniformemente.
    3. Retire el PBS restante del portaobjetos de vidrio con una micropipeta. Pipetee 15-30 μL de solución antidecoloración (sensible a la luz) en el portaobjetos de vidrio y asegúrese de que entre en contacto con todas las cámaras de huevos.
    4. Use pinzas para sostener el borde de la cubierta del portaobjetos, luego colóquelo encima del portaobjetos de vidrio (comenzando de un borde al otro) para que cubra las cámaras de huevos. Hazlo lentamente para evitar burbujas. Seque el exceso de solución con un pañuelo sin pelusa, luego selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Deje que el esmalte de uñas se seque adecuadamente (± 5 min).
    5. Tome imágenes de los portaobjetos con un microscopio confocal. Almacene los portaobjetos a -20 °C.

4. Enriquecimiento de péptidos biotinilados para análisis de espectrometría de masas

NOTA: Se necesitan alrededor de 3 mg de proteínas para la muestra de espectrometría de masas. Por lo tanto, disecciona alrededor de 100 pares de ovarios para obtener esa cantidad.

  1. Lisis de tejidos
    1. Descongele el tejido ovárico congelado. Mientras tanto, prepare 1 solución salina tamponada con Tris (TBS) disolviendo 1 tableta de TBS en 500 ml de TDW. Guárdelo en RT. Prepare el 2% de SDS en 1x TBS como tampón de lisis diluyendo 4 mL de material de SDS al 10% en 16 mL de 1x TBS. Guárdelo en RT.
    2. Añadir 500 μL de SDS al 2% en 1x TBS (suplementado con 1x cóctel PI) en el tubo que contiene los ovarios. Espere varios minutos hasta que las células se lisen y la solución se vuelva pegajosa.
    3. Lisado de pipeta a militubo de 1 ml que contiene fibra de acústica enfocada adaptativa (AFA). Corte las puntas de las pipetas antes de usarlas. Para garantizar una sonicación eficiente, transfiera un máximo de 500 μL de lisado por tubo.
    4. Realizar la sonicación con las siguientes condiciones: potencia incidente máxima 75 W, factor de trabajo 10%, ciclos por ráfaga 200, tiempo 180 s, temperatura 6 °C.
      NOTA: Si una muestra debe someterse a sonicación varias veces, establezca algunos intervalos intermedios para evitar generar un exceso de calor.
  2. Precipitación de acetona
    1. Mueva el lisado a un tubo de baja unión de 5 mL, luego agregue acetona fría en el tubo a 6 veces el volumen de la muestra. Por ejemplo, agregue 3 ml de acetona a 500 μl de lisato.
      NOTA: La acetona debe enfriarse previamente a -20 °C antes de su uso.
    2. Tubo de vórtice, cárguelo en un rotador múltiple e incube durante la noche (± 16 h) a -20 °C.
      NOTA: Este es un punto de parada, lo que significa que el experimento se puede pausar momentáneamente después de este paso.
    3. Proteínas precipitadas en pellets a 15.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y, a continuación, centrifugar el tubo a 4 °C.
    4. Agregue 2 ml de una solución de mezcla compuesta por un 90% de acetona fría y un 10% de 1x TBS. Pipetea con movimientos ascendentes y descendentes para mezclar el gránulo y la solución. Corte las puntas de las pipetas antes de usarlas.
    5. Tubo de vórtice, luego cárguelo en el rotador múltiple e incube durante 2 h a -20 °C.
    6. Pellets de proteínas a 15.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y, a continuación, gire el tubo a 4 °C. Abra el tubo y seque al aire el pellet durante 10 minutos.
      NOTA: No seque demasiado el pellet porque será difícil volver a suspenderlo más tarde.
    7. Prepare 500 mM de solución madre de bicarbonato de amonio (ABC) disolviendo 0,7906 g de ABC en 20 mL de TDW. Haga 50 mM de solución de trabajo ABC diluyendo 3 mL de solución madre ABC de 500 mM en 27 mL de TDW.
    8. Prepare la solución de urea 8 M añadiendo 0,4805 g de urea en 1 mL de 50 mM ABC.
      NOTA: La solución de urea debe estar recién preparada antes del experimento.
    9. Resuspender pellet de proteína en 500 μL de urea 8 M. El volumen de urea de 8 M se puede reducir para aumentar la concentración de proteínas.
    10. Transfiera la proteína resuspendida a un militubo de 1 ml que contenga fibra AFA y, a continuación, realice la sonicación con las mismas condiciones descritas en el paso 4.1.4.
    11. Realizar el ensayo de BCA para determinar la concentración de proteínas. Este paso es un punto de parada. Almacene la muestra de proteína a 4 °C hasta su uso posterior.
  3. Digestión de la tripsina
    1. Mezcle 3 mg de proteínas con TDW (si es necesario) en un tubo de baja unión de 5 mL para hacer un total de 500 μL de solución.
    2. Desnaturalizar proteínas mediante termobloque a 450 rpm durante 1 h a 37 °C.
    3. Añadir 5 μL de 1 M de DTT (disuelto en TDW) en el tubo para obtener una concentración final de 10 mM de DTT, luego reducir las proteínas utilizando un termobloque a 450 rpm durante 1 h a 37 °C.
    4. Prepare 400 mM de yodoacetamida disolviendo 0,0111 g de yodoacetamida en 150 μL de ABC. Añadir 55 μL de 400 mM de yodoacetamida en el tubo (concentración final 40 mM), luego alquilar proteínas usando termobloque a 450 rpm durante 1 h a 37 °C.
      NOTA: La yodoacetamida es sensible a la luz, y todas las soluciones de yodoacetamida deben estar recién preparadas antes del experimento.
    5. Diluir la muestra añadiendo 50 mM de solución ABC hasta que el volumen total alcance los 4 mL. Después de la dilución, la concentración de urea en la solución es de alrededor de 1 M.
    6. Haga 1 M de solución madre de CaCl2 disolviendo 1,1098 g de CaCl2 en 10 mL de TDW. Agregue 4 μL de caldo de CaCl2 1 M en el tubo para obtener una concentración final de 1 mM, luego pipetee hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la solución.
    7. Prepare una solución madre de tripsina de 1 mg/mL añadiendo 0,001 g de tripsina a 1 mL de ABC. Añadir 150 μL de tripsina al tubo (tripsina: muestra = proporción 1:20). Digiera la proteína con termobloque a 450 rpm durante 16 h a 37 °C.
      NOTA: La tripsina debe disolverse recién antes del experimento. Este paso es un punto de parada. Almacene los péptidos digeridos a 4 °C hasta su uso posterior.
  4. Enriquecimiento de péptidos biotinilados
    NOTA: Los tampones de lavado y elución deben estar recién preparados antes del experimento.
    1. Prepare 2 M de urea en 1x solución de TBS añadiendo 1,2012 g de urea en 10 mL de 1x TBS.
    2. Utilice 150 μL de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina por muestra de 3 mg. Lave las perlas de estreptavidina con 1 mL de urea 2 M en 1x TBS. Repita este paso 4 veces. Después de cada lavado, coloque el tubo en una rejilla magnética durante 1 minuto, luego deseche el tampón de lavado.
      NOTA: Se recomiendan las perlas magnéticas de estreptavidina de Pierce, ya que minimizan las señales de fondo similares a las PEG en los resultados de la espectrometría de masas.
    3. Pipetear 1 mL de péptidos digeridos en el tubo que contiene perlas, mezclar suavemente y luego combinar la mezcla con la muestra restante en un tubo de baja unión de 5 mL. Coloque el tubo en un rotador múltiple e incube durante 1 h a RT.
    4. Transfiera 1 mL de la mezcla a un tubo de 1,5 mL y colóquelo en la rejilla magnética durante 1 min. Deseche el sobrenadante. Repita este paso hasta que se recojan todas las cuentas.
    5. Prepare 2 M de urea en 50 mM ABC disolviendo 0,7207 g de urea en 6 mL de 50 mM de ABC. Lave las perlas con 1 mL de urea 2 M en 50 mM 2x y con 1 mL de TDW una vez. Después de cada lavado, coloque el tubo en una rejilla magnética durante 1 minuto, luego deseche el tampón de lavado.
    6. Prepare una solución madre de ácido fórmico al 10% disolviendo 1 mL de ácido fórmico en 9 mL de TDW. Prepare el tampón de elución compuesto por un 80% de acetonitrilo y un 0,1% de ácido fórmico en TDW. Por ejemplo, mezcle 1,2 ml de acetonitrilo, 15 μl de caldo de ácido fórmico al 10 % y 285 μl de TDW para hacer 1,5 ml de tampón de elución.
      PRECAUCIÓN: El acetonitrilo y el ácido fórmico son dañinos debido a sus propiedades volátiles, así que use una mascarilla y tenga cuidado al manipularlos.
    7. Pipetear 100 μL de tampón de elución en el tubo, homogeneizar suavemente y luego eluir los péptidos con un termobloque a 300 rpm durante 5 min a 60 °C. Después de la elución, coloque el tubo en una rejilla magnética y transfiera el eluido a un nuevo tubo de 1,5 mL. Evite tomar perlas al transferir el eluido. Repita este paso 5 veces.
    8. Coloque el tubo que contiene 500 μL de eluido en una rejilla magnética durante 5 minutos, luego transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mL para asegurar la eliminación completa de las perlas. A continuación, las muestras eluidas pueden secarse y utilizarse para el análisis de espectrometría de masas.
    9. Para obtener información adicional sobre el análisis LC-MS/MS de muestras de péptidos enriquecidos y el procesamiento de datos de MS, consulte Nguyen et al.20.

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Resultados

En la Figura 1, Figura 2, Figura 3 y Figura 4 se muestran ejemplos de resultados publicados previamente por Nguyen et al.20. La Figura 1 ilustra el procedimiento experimental de PL basada en TurboID en el ovario de Drosophila. En primer lugar, se generó una construcción que combina Zuc y TurboID (Zuc-V5-Turbo...

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Discusión

Aquí, proporcionamos un procedimiento integral para el etiquetado de proximidad (PL) basado en TurboID en el ovario de Drosophila , desarrollado a través de una amplia resolución de problemas para superar varios desafíos. Un problema clave involucró las construcciones genéticas, ya que los diferentes diseños de fusión afectaron significativamente la expresión de proteínas y la eficiencia de la biotinilación. Por ejemplo, NES-V5-TurboID mostró una expresión y biotinilación más dé...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio por sus discusiones y ayuda. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) (RS-2024-00345327 a M.L.; RS-2023-00219563 a M.L.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpos
Anticuerpo secundario anti-IgG (H+L) anti-cabra de cabra, HRPInvitrogen31430Anticuerpo secundario de grado analítico,
anti-IgG (H+L) anti-conejo de cabra altamente adsorbida de forma cruzada, alexa fluor plus 488InvitrogenA32731Anticuerpo secundario de grado analítico, anti-IgG
(H+L) de cabra sensible a la luz, HRPInvitrogen31460Grado analítico,
anticuerpo HSP90Tecnología de señalización celular4874Anticuerpo policlonal
Pierce Proteína de estreptavidina, HRPThermo Fisher Scientific21126Grado analítico
Estreptavidina, Alexa Fluor 594 conjugadoInvitrogenS11227Sensible a la luz, grado analítico
Anticuerpo V5-tag (ratón)InvitrogenR960-25Anticuerpo monoclonal
Anticuerpo V5-tag (conejo) (D3H8Q)Tecnología de señalización celular13202Anticuerpo monoclonal
Fly LinesCompanyNúmero de catálogoComments/Description
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3Korea Drosophila Stock Center2373-2Fly stock
pUASp Zucchini V5-TurboID/CyoKorea Drosophila Stock Center2188Fly stock
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/CyoKorea Drosophila Stock Center2635-4Fly stock
w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062Fly stock
Equipments and ConsummablesCompany>Número de catálogo>Comments/Description
Analytical BalanceMettlerToledo ME2040.1 mg legibilidad
Membranas de transferencia Western de nitrocelulosa Amersham Protran 0.45 NC (300 mm y tiempos; 4 m)Cytiva
10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge TubeCorningMCT-175-CCopolímero
MARCA  Cubierta de vidrio (22 mm x 22 mm)de vidrio de borosilicatoSigma-Aldrich
BR470055 (10 µ L)propilenoVertex4110N00
(1000 µ L)propilenoVertex4330N00
(200 µ L)Vertex4230N00de propileno
(96 pocillos)SPL300096Poliestireno, centrífuga de fondo plano
(con rotor del tamaño de un tubo de 1,5-2 ml)Eppendorf5424 RCentrífuga refrigerada de ángulo fijo
(con rotor del tamaño de un tubo de 5 ml)Eppendorf5425 RCuchara química refrigerada de ángulo fijo
-- Sistema
imágenes ChemiDocBiorad12003153Western blot
CO2 almohadilla de mosca--Placa anestésica
CO2 tanque y regulador--Precaución de gas a alta presión y mareos
Incubadora compactaJSR JSGI-10TPrecaución de alta temperatura
Microscopio de barrido láser confocalZeissLSM 710Precaución con el rayo láser intenso
Tubo cónico (15 mL)SPL50015Polipropileno /Polietileno de alta densidad 
Tubo cónico (50 mL)SPL50050Polipropileno /Polietileno de alta densidad 
Balanza digital---
Temporizador digital---
Plato de disección--Pinzas
de #5SF Dumont deHerramientas de ciencia fina11252-00Puntas súper finas, precaución de objetos afilados
Imán DynaMag-2Invitrogen12321DPara tubos de microcentrífuga de tamaño 1.5-2 mL
Fisherbrand  Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus (25 mm x 75 mm)Fisher Scientific12-550-15Precaución con objetos afilados
Botellas de comida para moscas (con tapón de papel)Hansol TechFFB-21010-Vialesde
comida para moscas (con tapón de algodón)Hansol TechFFV-11010-Ultrasonido
focalizadoCovarisM220Precaución con las ondas ultrasónicas
Cuchillo de gelInvitrogenEI9010Acero inoxidable con mango de plástico
Papel secante Chr de grado 3MM (46 cm y tiempos; 57 cm)Cytiva3030-917Papel Whatmann
Homogeneizador de mano y mortero de plásticoKimble749540-0000Motor inalámbrico
Bloque de calorPCR finaALB6400Precaución con el
tejido sin pelusaYuhan-Kimberly41112-
Nitrógeno líquido--Precaución de congelación y quemadura
Espectrofotómetro de microplacasAgilent TechnologiesEpochÓptica basada en monocromador
Microondas--Precaución de alta temperatura
miliTUBE 1 mL fibra AFACovarisPN 520135Vidrio
Mini tanque de gelThermo Fisher ScientificA25977Precaución con
los geles de proteína mini NuPAGE Bis-tris de alta temperatura, 4– 12%, 1.0– 1,5 mm, 10 pocillosInvitrogenNP0323BOXContienen poliacrilamida, precaución de toxicidad
NuPAGE Bis-tris mini geles proteicos, 4– 12%, 1.0– 1,5 mm, 15 pocillosInvitrogenNP0321BOXContiene poliacrilamida, precaución con la toxicidad
Pincel (Ø 1,8 mm)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006MMicropipeta monocanal con eyector de metal
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005MMicropipeta monocanal con eyector de metal
Pipetman L ( P20L)GilsonFA10003MMicropipeta monocanal con eyector metálico
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001MMicropipeta monocanal con eyector metálico
Fuente de alimentaciónMajor scienceMP-310Precaución con la electricidad de alto voltaje
Rotador programableBiosanRS-24-Protein
LoBind  tubosEppendorf30108302-Hoja de
afeitarDorco304020Acero inoxidable, precaución con objetos afilados
Rodillo---
Pipeta serológica (10 ml)SPL91010poliestireno
(25 ml)SPL91025poliestireno
(5 ml)SPL91005poliestireno
(50 ml)SPL91050
Tubos de microcentrífuga de baja retención con tapón a presión de poliestireno (1,5 ml)Thermo Scientific3451PK
Almohadilla de esponjaInvitrogenEI9052-Microscopio
estereoscópicoZeissStemi 508
 Leica
ThermoMixer  CEppendorf5382000015Con bloques de 1,5 y 5 ml
PinzasAven Tools18526Plástico, puntas planas
Mezclador de vórticeScientific IndustriesSI-0236-XCell
II Módulo de transferenciaInvitrogenEI9051Precaución con altas temperaturas
XCell  Minicelda SureLockInvitrogenEI0001Precaución de alta temperatura
ChemicalsCompanyNúmero de catálogoComments/Description
AcetoneSigma-Aldrich650501Grado analítico
AcetonitriloSupelco1.00029.1000Grado LC-MS, precaución con la toxicidad por inhalación y
ampollas estándar de albúmina inflamables (que contienen albúmina de suero bovino (BSA) a 2 mg/ml en solución salina al 0,9 % y azida sódica al 0,05 %)Thermo Scientific23209Parte de los kits de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Albúmina, suero bovinoBioshopALB001
Bicarbonato de amonioSigma-Aldrich09830Biotina de grado analítico
Sigma-AldrichB4639Grado de cultivo de células y tejidos
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5670Grado de cultivo celular
Sustrato ECL occidental de claridadBiorad1705060Grado analítico
DAPISigma-AldrichMBD0015
Ditiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861Grado analítico
Suero fetal bovinoCorning35-015-CV Grado decultivo celular
Ácido fórmicoSigma-AldrichF0507Grado reactivo, precaución de toxicidad por inhalación
Medio de insectosGrace Gibco11595030Grado de cultivo celular
Levadura seca instantáneaSin marcaN1019-
YodoacetamidaSigma-AldrichI1149sensible a la luz de grado analítico
Carlo Erba41484Esmalte
deuñasdeTampón de
muestra Novex Tris-glycine SDS de tipo transparente (2X)InvitrogenLC2676
Tampón de funcionamiento NuPAGE MOPS SDS (20X)InvitrogenNP0001Grado analítico
PageRuler Escalera de proteínas pretipificadasThermo Fisher Scientific26616Grado analítico
Fluoruro de fenilmetanosulfoniloThermo Fisher Scientific36978
Tampón de fosfato de grado analítico solución salinaSigma-AldrichP4417Grado analítico
Pierce 16 % de formaldehído (p/v)Thermo Fisher Scientific28908sensibles a la luz y de grado analítico
Thermo Scientific23225Grado analítico
Reactivo A de Pierce BCA (que contiene carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, ácido bicinconínico y tartrato de sodio en hidróxido de sodio 0,1 M)Thermo Scientific23228Parte de los kits de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Reactivo B de Pierce BCA (que contiene un 4 % de sulfato cúprico)Thermo Scientific1859078parte de los kits de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Ácido propiónicoSigma-Aldrich402907Conjunto de
cóctel inhibidor de proteasa deCalbiochem539134Grado de cultivo de células y tejidos
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36936
Cloruro de sodio sensible a la luz (NaCl)BioneerC-9025Grado analítico
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750Grado analítico
Dodecil sulfato de sodioSigma-Aldrich71736Grado molecular
Hidróxido de sodio (NaOH)BiosesangSR2018-100-00Grado analítico
Agua triple destilada--Ultrapura (tipo 1)
Solución salina tamponada con trisSigma-Aldrich94158
Tampón de transferencia de tris-glicinaKoma BiotechK0341001
Tris-HCl deBioneerC-9006Grado analítico
Triton x-100Sigma-Aldrich93443Tripsina de grado molecular
Thermo Fisher Scientific20233Grado de cultivo celular
Tween 20Sigma-AldrichP9416Urea de grado molecular
Sigma-AldrichU5378Molecular y grado de cultivo celular
sensible a la luz (conejo)Puntas de pipeta a granel Puntas de pipeta a granel de Puntas de pipeta a granel de Placa de cultivo celular de de acero inoxidable Sistema de imágenes silicona a alta temperatura Pipeta serológica de Pipeta serológica de Pipeta serológica de de polipropileno de grado analítico de Metanol grado analítico - Kits de ensayo de proteínas Pierce BCA grado ACS III de grado analítico grado analítico, pH 8

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