En este estudio, establecemos un protocolo detallado para el marcaje de proximidad (PL) basado en TurboID en el ovario de D. melanogaster , que abarca desde la suplementación con biotina y la disección ovárica hasta la validación de la expresión transgénica y el enriquecimiento de péptidos biotinilados para la espectrometría de masas.
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Artículo de método
In vivo Aplicación del etiquetado de proximidad basado en TurboID en Drosophila melanogaster
En este artículo
Resumen
Resumen
El marcaje de proximidad (PL) es un método potente para mapear las redes de interacción proteína-proteína. Los avances en el marcaje de enzimas, especialmente TurboID, han ampliado su uso en todos los sistemas biológicos. TurboID es particularmente ventajoso para aplicaciones in vivo debido a su robustez, no toxicidad y facilidad de uso. Esta enzima biotinila promiscuamente las biomoléculas cercanas, incluidas las proteínas y los ácidos nucleicos, dentro de un rango de aproximadamente 10 nm en presencia de biotina. Aplicamos este método para investigar el interactoma del calabacín (Zuc), un factor clave en la biogénesis del ARN que interactúa con piwi (piRNA) en la membrana mitocondrial externa (OMM) en las células de la línea germinal del ovario de Drosophila melanogaster . Al expresar Zuc-TurboID en células germinales y suplementarlo con biotina, indujimos la biotinilación de las proteínas proximales de Zuc. El análisis de espectrometría de masas tras el enriquecimiento de péptidos biotinilados identificó proteínas muy próximas a Zuc, incluidos interactores bien conocidos en la biogénesis de piRNA. Curiosamente, descubrimos nuevos interactores de Zuc implicados en el plegamiento de proteínas, la organización de la membrana y el tráfico de vesículas.
Introducción
Los métodos convencionales de mapeo de interacción proteína-proteína (PPI), como la purificación de afinidad-espectrometría de masas (AP-MS) y los sistemas híbridos de levadura-2 (Y2H), a menudo no logran capturar proteínas de baja abundancia, expresadas transitoriamente o unidas a la membrana. Esta limitación surge de su incapacidad para replicar las condiciones fisiológicas nativas de una célula viva 1,2,3. Para superar estos desafíos, PL se ha convertido en una poderosa técnica para el mapeo de proteoma de alta resolución a nivel de suborg....
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Protocolo
1. PL en mosca adulta
- Preparación de alimentos con biotina
- Prepare una solución de NaOH 1 M diluyendo un caldo de NaOH 10 M en agua triplemente destilada (TDW). Guárdelo a temperatura ambiente (RT). Prepare 1 M de solución madre de biotina disolviendo 0,0049 g de biotina en polvo en 20 mL de TDW. Añadir 150-200 μL de NaOH 1 M para aumentar la solubilidad de la biotina. Vórtice para homogeneizar la solución. Almacene la solución madre de biotina a 4 °C.
- Saque la comida para moscas del vial y cocine en el microondas durante 2 minutos hasta que se derrita.
NOTA: El alimento estándar pa....
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Resultados
En la Figura 1, Figura 2, Figura 3 y Figura 4 se muestran ejemplos de resultados publicados previamente por Nguyen et al.20. La Figura 1 ilustra el procedimiento experimental de PL basada en TurboID en el ovario de Drosophila. En primer lugar, se generó una construcción que combina Zuc y TurboID (Zuc-V5-Turbo.......
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Discusión
Aquí, proporcionamos un procedimiento integral para el etiquetado de proximidad (PL) basado en TurboID en el ovario de Drosophila , desarrollado a través de una amplia resolución de problemas para superar varios desafíos. Un problema clave involucró las construcciones genéticas, ya que los diferentes diseños de fusión afectaron significativamente la expresión de proteínas y la eficiencia de la biotinilación. Por ejemplo, NES-V5-TurboID mostró una expresión y biotinilación más dé.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio por sus discusiones y ayuda. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) (RS-2024-00345327 a M.L.; RS-2023-00219563 a M.L.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpos | |||
| Anticuerpo secundario anti-IgG (H+L) anti-cabra de cabra, HRP | Invitrogen | 31430 | Anticuerpo secundario de grado analítico, |
| anti-IgG (H+L) anti-conejo de cabra altamente adsorbida de forma cruzada, alexa fluor plus 488 | Invitrogen | A32731 | Anticuerpo secundario de grado analítico, anti-IgG |
| (H+L) de cabra sensible a la luz, HRP | Invitrogen | 31460 | Grado analítico, |
| anticuerpo HSP90 | Tecnología de señalización celular | 4874 | Anticuerpo policlonal |
| Pierce Proteína de estreptavidina, HRP | Thermo Fisher Scientific | 21126 | Grado analítico |
| Estreptavidina, Alexa Fluor 594 conjugado | Invitrogen | S11227 | Sensible a la luz, grado analítico |
| Anticuerpo V5-tag (ratón) | Invitrogen | R960-25 | Anticuerpo monoclonal |
| Anticuerpo V5-tag (conejo) (D3H8Q) | Tecnología de señalización celular | 13202 | Anticuerpo monoclonal |
| Fly Lines | Company | Número de catálogo | Comments/Description |
| pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3 | Korea Drosophila Stock Center | 2373-2 | Fly stock |
| pUASp Zucchini V5-TurboID/Cyo | Korea Drosophila Stock Center | 2188 | Fly stock |
| pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo | Korea Drosophila Stock Center | 2635-4 | Fly stock |
| w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H | Bloomington Drosophila Stock Center | 7062 | Fly stock |
| Equipments and Consummables | Company | >Número de catálogo | >Comments/Description |
| Analytical Balance | Mettler | Toledo ME204 | 0.1 mg legibilidad |
| Membranas de transferencia Western de nitrocelulosa Amersham Protran 0.45 NC (300 mm y tiempos; 4 m) | Cytiva | ||
| 10600002-Axygen 1.7 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-175-C | Copolímero |
| MARCA Cubierta de vidrio (22 mm x 22 mm) | de vidrio de borosilicato | Sigma-Aldrich | |
| BR470055 (10 µ L) | propileno | Vertex | 4110N00 |
| (1000 µ L) | propileno | Vertex | 4330N00 |
| (200 µ L) | Vertex | 4230N00 | de propileno |
| (96 pocillos) | SPL | 300096 | Poliestireno, centrífuga de fondo plano |
| (con rotor del tamaño de un tubo de 1,5-2 ml) | Eppendorf | 5424 R | Centrífuga refrigerada de ángulo fijo |
| (con rotor del tamaño de un tubo de 5 ml) | Eppendorf | 5425 R | Cuchara química refrigerada de ángulo fijo |
| - | - | Sistema | |
| imágenes ChemiDoc | Biorad | 12003153 | Western blot |
| CO2 almohadilla de mosca | - | - | Placa anestésica |
| CO2 tanque y regulador | - | - | Precaución de gas a alta presión y mareos |
| Incubadora compacta | JSR JSGI-10T | Precaución de alta temperatura | |
| Microscopio de barrido láser confocal | Zeiss | LSM 710 | Precaución con el rayo láser intenso |
| Tubo cónico (15 mL) | SPL | 50015 | Polipropileno /Polietileno de alta densidad |
| Tubo cónico (50 mL) | SPL | 50050 | Polipropileno /Polietileno de alta densidad |
| Balanza digital | - | - | - |
| Temporizador digital | - | - | - |
| Plato de disección | - | - | Pinzas |
| de #5SF Dumont de | Herramientas de ciencia fina | 11252-00 | Puntas súper finas, precaución de objetos afilados |
| Imán DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Para tubos de microcentrífuga de tamaño 1.5-2 mL |
| Fisherbrand Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus (25 mm x 75 mm) | Fisher Scientific | 12-550-15 | Precaución con objetos afilados |
| Botellas de comida para moscas (con tapón de papel) | Hansol Tech | FFB-21010-Viales | de |
| comida para moscas (con tapón de algodón) | Hansol Tech | FFV-11010-Ultrasonido | |
| focalizado | Covaris | M220 | Precaución con las ondas ultrasónicas |
| Cuchillo de gel | Invitrogen | EI9010 | Acero inoxidable con mango de plástico |
| Papel secante Chr de grado 3MM (46 cm y tiempos; 57 cm) | Cytiva | 3030-917 | Papel Whatmann |
| Homogeneizador de mano y mortero de plástico | Kimble | 749540-0000 | Motor inalámbrico |
| Bloque de calor | PCR fina | ALB6400 | Precaución con el |
| tejido sin pelusa | Yuhan-Kimberly | 41112 | - |
| Nitrógeno líquido | - | - | Precaución de congelación y quemadura |
| Espectrofotómetro de microplacas | Agilent Technologies | Epoch | Óptica basada en monocromador |
| Microondas | - | - | Precaución de alta temperatura |
| miliTUBE 1 mL fibra AFA | Covaris | PN 520135 | Vidrio |
| Mini tanque de gel | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Precaución con |
| los geles de proteína mini NuPAGE Bis-tris de alta temperatura, 4– 12%, 1.0– 1,5 mm, 10 pocillos | Invitrogen | NP0323BOX | Contienen poliacrilamida, precaución de toxicidad |
| NuPAGE Bis-tris mini geles proteicos, 4– 12%, 1.0– 1,5 mm, 15 pocillos | Invitrogen | NP0321BOX | Contiene poliacrilamida, precaución con la toxicidad |
| Pincel (Ø 1,8 mm) | Hwa hong | 791240-Pipetman | |
| L (P1000L) | Gilson | FA10006M | Micropipeta monocanal con eyector de metal |
| Pipetman L (P200L) | Gilson | FA10005M | Micropipeta monocanal con eyector de metal |
| Pipetman L ( P20L) | Gilson | FA10003M | Micropipeta monocanal con eyector metálico |
| Pipetman L (P2L) | Gilson | FA10001M | Micropipeta monocanal con eyector metálico |
| Fuente de alimentación | Major science | MP-310 | Precaución con la electricidad de alto voltaje |
| Rotador programable | Biosan | RS-24-Protein | |
| LoBind tubos | Eppendorf | 30108302-Hoja de | |
| afeitar | Dorco | 304020 | Acero inoxidable, precaución con objetos afilados |
| Rodillo | - | -- | |
| Pipeta serológica (10 ml) | SPL | 91010 | poliestireno |
| (25 ml) | SPL | 91025 | poliestireno |
| (5 ml) | SPL | 91005 | poliestireno |
| (50 ml) | SPL | 91050 | |
| Tubos de microcentrífuga de baja retención con tapón a presión de poliestireno (1,5 ml) | Thermo Scientific | 3451PK | |
| Almohadilla de esponja | Invitrogen | EI9052-Microscopio | |
| estereoscópico | Zeiss | Stemi 508 | |
| Leica | |||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | Con bloques de 1,5 y 5 ml |
| Pinzas | Aven Tools | 18526 | Plástico, puntas planas |
| Mezclador de vórtice | Scientific Industries | SI-0236-XCell | |
| II Módulo de transferencia | Invitrogen | EI9051 | Precaución con altas temperaturas |
| XCell Minicelda SureLock | Invitrogen | EI0001 | Precaución de alta temperatura |
| Chemicals | Company | Número de catálogo | Comments/Description |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Grado analítico |
| Acetonitrilo | Supelco | 1.00029.1000 | Grado LC-MS, precaución con la toxicidad por inhalación y |
| ampollas estándar de albúmina inflamables (que contienen albúmina de suero bovino (BSA) a 2 mg/ml en solución salina al 0,9 % y azida sódica al 0,05 %) | Thermo Scientific | 23209 | Parte de los kits de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225) |
| Albúmina, suero bovino | Bioshop | ALB001 | |
| Bicarbonato de amonio | Sigma-Aldrich | 09830 | Biotina de grado analítico |
| Sigma-Aldrich | B4639 | Grado de cultivo de células y tejidos | |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | Grado de cultivo celular |
| Sustrato ECL occidental de claridad | Biorad | 1705060 | Grado analítico |
| DAPI | Sigma-Aldrich | MBD0015 | |
| Ditiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Grado analítico |
| Suero fetal bovino | Corning | 35-015-CV Grado de | cultivo celular |
| Ácido fórmico | Sigma-Aldrich | F0507 | Grado reactivo, precaución de toxicidad por inhalación |
| Medio de insectos | Grace Gibco | 11595030 | Grado de cultivo celular |
| Levadura seca instantánea | Sin marca | N1019 | - |
| Yodoacetamida | Sigma-Aldrich | I1149 | sensible a la luz de grado analítico |
| Carlo Erba | 41484 | Esmalte | |
| de | uñas | de | Tampón de |
| muestra Novex Tris-glycine SDS de tipo transparente (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| Tampón de funcionamiento NuPAGE MOPS SDS (20X) | Invitrogen | NP0001 | Grado analítico |
| PageRuler Escalera de proteínas pretipificadas | Thermo Fisher Scientific | 26616 | Grado analítico |
| Fluoruro de fenilmetanosulfonilo | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Tampón de fosfato de grado analítico solución salina | Sigma-Aldrich | P4417 | Grado analítico |
| Pierce 16 % de formaldehído (p/v) | Thermo Fisher Scientific | 28908 | sensibles a la luz y de grado analítico |
| Thermo Scientific | 23225 | Grado analítico | |
| Reactivo A de Pierce BCA (que contiene carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, ácido bicinconínico y tartrato de sodio en hidróxido de sodio 0,1 M) | Thermo Scientific | 23228 | Parte de los kits de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225) |
| Reactivo B de Pierce BCA (que contiene un 4 % de sulfato cúprico) | Thermo Scientific | 1859078 | parte de los kits de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225) |
| Ácido propiónico | Sigma-Aldrich | 402907 | Conjunto de |
| cóctel inhibidor de proteasa de | Calbiochem | 539134 | Grado de cultivo de células y tejidos |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36936 | |
| Cloruro de sodio sensible a la luz (NaCl) | Bioneer | C-9025 | Grado analítico |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich | D6750 | Grado analítico |
| Dodecil sulfato de sodio | Sigma-Aldrich | 71736 | Grado molecular |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Biosesang | SR2018-100-00 | Grado analítico |
| Agua triple destilada | - | - | Ultrapura (tipo 1) |
| Solución salina tamponada con tris | Sigma-Aldrich | 94158 | |
| Tampón de transferencia de tris-glicina | Koma Biotech | K0341001 | |
| Tris-HCl de | Bioneer | C-9006 | Grado analítico |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | Tripsina de grado molecular |
| Thermo Fisher Scientific | 20233 | Grado de cultivo celular | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Urea de grado molecular |
| Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular y grado de cultivo celular |
Referencias
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein....
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Reimpresiones y permisos
