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Artículo de método

Aislamiento y cultivo de colangiocitos primarios de ratones con enfermedad hepática poliquística mediante un método de digestión de dos pasos

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DOI:

10.3791/68202

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16 de mayo de 2025

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1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2The Province and Ministry Co-sponsored Collaborative Innovation Center for Medical Epigenetics, Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease (Ministry of Education), State Key Laboratory of Experimental Hematology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método de digestión optimizado de dos pasos para aislar colangiocitos primarios de alta pureza y alta viabilidad de ratones de tipo salvaje y ratones con enfermedad hepática poliquística.

Resumen

En este protocolo, optimizamos un método de digestión de dos pasos para aislar colangiocitos primarios de alta pureza y alta viabilidad de ratones de tipo salvaje y ratones con enfermedad hepática poliquística (PLD). Después de anestesiar a los ratones, los hígados se perfundieron a través de la vena cava inferior con 50 mL de solución A, seguidos de 30 mL de solución B a 37 °C para digerir enzimáticamente el tejido hepático. Se realizó disociación mecánica, agitación y microdisección para eliminar las células parenquimatosas adheridas, dejando un árbol biliar intacto. A continuación, el árbol biliar se picó finamente y se digirió agitando durante 60 min a 37 °C. La suspensión unicelular resultante se recolectó utilizando un filtro celular de 70 μm. Los colangiocitos se purificaron mediante aislamiento inmunomagnético. La suspensión celular se incubó con un anticuerpo anti-EpCAM bajo rotación durante 45 min a 4 °C, seguido de la adición de perlas de proteína G y una rotación adicional durante otros 45 min a 4 °C. Después de tres lavados con PBS, los colangiocitos se recolectaron mediante un separador magnético. Los colangiocitos primarios purificados se resuspendieron en un medio de cultivo de colangiocitos y se sembraron en placas de cultivo celular recubiertas con 1 mg/mL de colágeno de cola de rata tipo I. La pureza de los colangiocitos se confirmó mediante inmunotinción para el marcador específico de colangiocitos citoqueratina-19 (CK19). Aunque este estudio se centró en aislar colangiocitos primarios de ratones de tipo salvaje y PLD, estamos seguros de que el protocolo también se puede aplicar a otros modelos de ratones con enfermedades. Este detallado método de digestión en dos pasos facilita los estudios in vitro de las colangiopatías y el desarrollo de terapias dirigidas.

Introducción

Los colangiocitos, las células epiteliales que recubren el árbol biliar intrahepático, forman una monocapa y constituyen aproximadamente el 3-5% de la población total de células del hígado1. Estas células se interconectan dentro del hígado para crear una compleja red ductal tridimensional2. En condiciones normales, los colangiocitos realizan funciones vitales, como la secreción, la absorción, la reparación de lesiones y sirven como barrera inmunitaria, por lo que desempeñan un papel fundamental en la fisiología y la patología hepáticas. Sin embargo, la disfunción de los colangiocitos puede conducir a diversas enfermedades, incluyendo PLD, colangitis esclerosante primaria, colangiocarcinoma y lesión hepática colestásica 3,4,5.

Entre las enfermedades relacionadas con la colangiopatía, la DLP destaca como un trastorno hereditario caracterizado por la formación de numerosos quistes llenos de líquido que se originan en los colangiocitos. El agrandamiento progresivo de estos quistes disminuye significativamente la calidad de vida de los pacientes6. Las opciones de tratamiento actuales para la DLP siguen siendo insuficientes, ofrecen una eficacia limitada y a menudo se asocian con altas tasas de recurrencia y complicaciones7. Esto pone de manifiesto la necesidad urgente de desarrollar estrategias terapéuticas seguras y eficaces para abordar las demandas clínicas insatisfechas en el tratamiento de la DLP.

La investigación sobre los mecanismos de las colangiopatías, incluida la PLD, se ha visto obstaculizada significativamente por la falta de líneas celulares adecuadas. Para abordar esta limitación, el uso de modelos de ratones con enfermedades y el aislamiento de colangiocitos primarios de estos modelos para experimentos in vitro han demostrado ser invaluables para descubrir los mecanismos moleculares que subyacen a las colangiopatías e identificar posibles estrategias terapéuticas.

En nuestro reciente estudio8, establecimos con éxito un modelo de ratón PLD utilizando ratones Pkd1 conditional knockout (KO). Los quistes hepáticos se observaron tan pronto como 1 mes después de la deleción de Pkd1 y aumentaron progresivamente de tamaño con el tiempo. Si bien los protocolos para aislar los colangiocitos de ratas y humanos están bien documentados 9,10, el aislamiento de colangiocitos primarios de ratones sigue siendo particularmente desafiante debido a su pequeño tamaño y a la intrincada arquitectura de la vena porta y el sistema biliar. Los métodos existentes enfrentan limitaciones significativas, incluyendo baja pureza celular, poca viabilidad, procedimientos complejos y altos costos11,12.

Este manuscrito presenta un protocolo detallado para aislar colangiocitos primarios de alta pureza de ratones utilizando un método de digestión de dos pasos. Este enfoque optimizado tiene como objetivo apoyar los estudios in vitro , facilitando la investigación de los mecanismos moleculares subyacentes a las colangiopatías y avanzando en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

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Protocolo

Todos los protocolos experimentales y de cuidado con ratones fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Tianjin (Doc. No: TMUa-MEC 2022016).

1. Preparación de equipos y soluciones

  1. Esterilice los instrumentos quirúrgicos (tijeras, fórceps y mangos de bisturí) esterilizándolos en autoclave al menos 1 día antes del aislamiento de las células.
  2. Al menos 1 día antes del aislamiento celular, prepare el medio de cultivo de colangiocitos utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 1. Esterilizar el medio de cultivo de colangiocitos filtrándolo a través de un filtro de 0,22 μm.
  3. Al menos 1 día antes del aislamiento celular, prepare la solución A y la solución B utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 2 para la perfusión de hígado de ratón. Esterilice la solución A y la solución B esterilizándolas en autoclave o filtrándolas a través de un filtro de 0,22 μm y ajuste su pH a 7,35 utilizando NaOH estéril bajo una agitación suave.
    NOTA: El medio de cultivo de colangiocitos, la solución A y la solución B pueden almacenarse a 4 °C durante al menos un mes.
  4. Antes de comenzar el experimento, agregue colágeno II en polvo a la solución B y mezcle suavemente para lograr una concentración final de 0,5 mg / mL. Precaliente la solución A y la solución B en un baño de agua a 37 °C antes de usar.
  5. Inmediatamente antes de comenzar el experimento, prepare platos de 6 cm llenos de PBS estéril y colóquelos en hielo para mantenerlos fríos durante el procedimiento.

2. Digestión del tejido hepático Perfusión

  1. Anestesiar al ratón con una sobredosis de isoflurano inhalado. Coloque el ratón anestesiado en posición supina y asegúrelo con cinta adhesiva para facilitar el procedimiento.
  2. Abra la cavidad abdominal del ratón después de esterilizar el abdomen con etanol al 75% y luego, haga un nudo corredizo alrededor de la vena cava inferior con una aguja estampada. Enjuague un catéter intravenoso de 24 g con la solución A con una jeringa de 20 ml.
  3. Inserte el catéter intravenoso en la vena cava inferior por debajo del nudo corredizo, asegure el nudo corredizo y fije el catéter en su lugar con cinta adhesiva.
  4. Perfundir el hígado con 50 mL de solución A a través de la vena cava inferior usando una jeringa de 20 mL e incidir la vena porta hepática para drenar la solución de perfusión. Mantener la tasa de perfusión a 10 mL/min.
  5. Continuar la perfusión con 30 mL de solución B que contiene colagenasa II a un caudal de 3,5 mL/min utilizando una bomba peristáltica.
    NOTA: Este paso está destinado a la digestión del tejido hepático.
  6. Retire el tejido hepático perfundido con éxito y colóquelo en un plato de 6 cm lleno de PBS frío y estéril.

3. Aislamiento de colangiocitos

NOTA: Como el número de colangiocitos en ratones normales es relativamente bajo, se recomienda utilizar un grupo de 2-6 ratones para el procedimiento. Sin embargo, para los modelos de enfermedad de ratón con proliferación anormal de colangiocitos, como PLD, los colangiocitos de un solo ratón son suficientes. A menos que se especifique lo contrario, las muestras y los reactivos siempre deben mantenerse en hielo, y todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica.

  1. Disociar y agitar mecánicamente el tejido hepático con pinzas curvas. Posteriormente, se realiza la microdisección bajo un microscopio de disección para eliminar las células parenquimatosas adheridas, dejando un árbol biliar intacto. Retire el tejido de la vesícula biliar antes de continuar con el siguiente paso.
    Lave el pañuelo 2 veces con PBS.
  2. Picar finamente el árbol biliar con una cuchilla quirúrgica y digerirlo en 3 mL de solución de digestión (Tabla 3) por ratón agitando (90 rpm) a 37 °C durante 60 min. A los 30 minutos, pipetee suavemente la mezcla con la punta de una pipeta para mezclar bien.
    NOTA: La solución de digestión debe estar recién preparada antes de usarla.
  3. Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm. Use el émbolo de una jeringa de 5 mL o 10 mL para presionar suavemente la suspensión celular a través del colador. Lave el colador con PBS.
  4. Centrifugar la suspensión de la célula a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Lave las celdas 3 veces con medio RPMI.
  5. Vuelva a centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 900 μL de medio RPMI que contenga 40 U/mL de DNasa I. Agregue 2 μg de anticuerpo anti-EpCAM e incube la suspensión en un rotador (20 rpm) a 4 °C durante 45 min.
  7. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mL de medio RPMI que contenga 40 U/mL de DNasa I. Prelave las perlas de proteína G con 1 mL de medio RPMI. Añadir 20 μL de perlas de proteína G a la suspensión celular e incubar con rotación (20 rpm) a 4 °C durante otros 45 min.
    NOTA: El anticuerpo anti-EpCAM también se puede preincubar con perlas de proteína G para crear un complejo perla-anticuerpo antes de introducir la suspensión celular.
  9. Lave las celdas 3 veces con PBS usando un separador magnético.
  10. Realizar el recuento celular y la evaluación de la viabilidad celular mediante la tinción con azul de tripano (0,04%, 3 min) en un hemocitómetro.
    NOTA: No es necesario quitar las perlas de los colangiocitos, se desprenderán naturalmente una vez que comience el cultivo y no interferirán con el cultivo celular.

4. Cultivo de colangiocitos

NOTA: Prepare placas frescas de cultivo celular recubiertas de colágeno de cola de rata tipo I antes del cultivo de colangiocitos. Enfríe previamente todos los reactivos en hielo.

  1. Siguiendo las instrucciones del fabricante, mezcle ddH2O estéril, 10x PBS, 1 N NaOH y colágeno de cola de rata tipo I para lograr una concentración final de 1 mg/mL de colágeno de cola de rata tipo I en 1x PBS. Cubra uniformemente las placas de cultivo celular con la mezcla y coloque las placas en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 30 minutos para permitir que el colágeno se solidifique.
  2. Lave los platos de cultivo celular recubiertos de colágeno con cola de rata tipo I con PBS precalentado.
  3. Resuspender los colangiocitos en un medio de cultivo de colangiocitos precalentado. Siembre la suspensión celular en placas de cultivo celular recubiertas de colágeno de cola de rata tipo I de 1 mg/mL e incube a 37 °C con 5% de CO2. Reemplace el medio cada 2 días.

5. Pasaje y criopreservación de colangiocitos

  1. Lave los colangiocitos dos veces con PBS, luego incube las células en tripsina al 0,25% a 37 °C durante 5-10 min.
  2. Agregue un volumen igual de medio de cultivo de colangiocitos para neutralizar la tripsina, luego centrifugue a 500 x g durante 5 min.
  3. Prepare placas de cultivo celular recubiertas de colágeno con cola de rata tipo I como se describe en el paso 4.1.
  4. Siga los pasos 4.2 y 4.3.
  5. Si se requiere criopreservación, vuelva a suspender los colangiocitos en un medio de almacenamiento (9:1 FBS: DMSO) y almacene en un congelador a -80 °C o nitrógeno líquido. Descongele las celdas según sea necesario para su uso futuro.

6. Validación de colangiocitos

NOTA: La pureza de los colangiocitos se evaluó mediante tinción para el marcador de colangiocitos CK19.

  1. Lave los colangiocitos 2 veces con PBS, luego fije las células en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos.
  2. Lave los colangiocitos con PBS, luego permeabilice las células con Triton X-100 al 1% durante 8 min.
  3. Lave los colangiocitos con PBS, luego bloquee las células en BSA al 5% durante 1 h.
  4. Lavar los colangiocitos con PBS, luego incubar las células con el anticuerpo primario contra CK19 (dilución 1:12 con 2% de BSA) durante la noche a 4 °C.
  5. Lave los colangiocitos 2 veces con PBS, luego incube las células con el anticuerpo secundario anti-ratas Alexa Fluor 488 (dilución 1:1,000 con PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.
  6. Lave los colangiocitos con PBS, tiña con 4',6-diamidino-2-fenilindol durante 15 minutos y observe bajo un microscopio.

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Resultados

En la Figura 1 se muestra el diagrama de flujo de trabajo para el proceso de digestión de dos pasos utilizado para aislar los colangiocitos. Todo el procedimiento dura ~5 h. Primero, el hígado se perfunde con la solución A a través de la vena cava inferior para eliminar la sangre, como lo indica el hígado que se vuelve pálido. A continuación, el hígado se perfunde con la solución B que contiene colagenasa II para iniciar la digestión de los tejidos. Este paso...

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Discusión

Este protocolo proporciona un método detallado para aislar colangiocitos primarios de alta pureza de ratones mediante un proceso de digestión de dos pasos, lo que permite el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes a las colangiopatías. Varios pasos críticos son esenciales para garantizar el aislamiento exitoso de los colangiocitos.

El primer paso crítico es asegurar una perfusión y digestión efectivas usando la Solución A y la Solución B. La perfusió...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Comisión Municipal de Educación de Tianjin (2022ZD054 a L.Z.)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,22 y mu; m filtroPALL4612
0.25% TripsinaGibco25200-056
10 mL jeringaKONSMED10 mL 1.2*30TWLB
20 mL jeringaKONSMED20 mL 1.2*30TWLB
24 G catéter intravenosoWEGO24GX19  mm/Y-G
3,3',5-triyodo-L-tironinaSigmaT55161.7 mg/mL stock
4% paraformaldehídoSolarbioP1110
5 mL jeringaKONSMED5 mL 0.7*30TWLB
platos de 6 cmThermo Scientific150462
70 µ filtro de células mCorning352350
anticuerpo anti-CK19DSHBTROMA-III
anticuerpo anti-EpCAMDSHBG8.8
BSASolarbioA8020
CaCl2Sangon BiotechA5013302 M stock
Concentrado lipídico químicamente definido (100x)Gibco11905-031
Colagenasa IIWorthingtonLS004176
Colagenasa XISigmaC76573,2 mg/mL stock
DexametasonaSigmaD175610 mg/mL
stock Microscopio de disecciónLeicaEZ4
DMEM/F12 (1:1)VivaCell biosciencesC3130-0500
DMSOSigmaD2650
DNasa ISigmaD451310 U/μ L stock
Burro anti-rata Alexa Fluor 488 anticuerpo secundarioInvitrogenA21208
EGTASolarbioE805050 mM (PH = 8) stock
Factor de crecimiento epidérmico (1 mg/mL)SigmaSRP3196
EtanolaminaSigmaE9508
Suero fetal bovinoVivaCell biosciencesC04001-500
ForskolinSigmaF391720 mM
stock Gentamicina/solución de anfotericina (500x)GibcoR01510
HemocitómetroQIUJINGXB. K.25.
HEPESSigmaH4034
HialuronidasaSigmaH350610 mg/mL
stock Insulina-transferrina-selenio (100x)Gibco41400045
IsofluranoRWDR510-22-10
KClSangon BiotechA100395
L-Glutamina (200 mM)SigmaG7513
Separador magnéticoPromegaZ5342
MEM aminoácidos no esenciales (100x)Gibco11140050
MEM solución vitamínica (100x)Gibco11120052
MgCl2Sangon BiotechA1002881,5 M stock
Na Pyruvate  (100 mM)Gibco11360070
Na2HPO4Sangon BiotechA600487
NaClSangon BiotechA610476
NaOHSangon BiotechA6206171 N stock
PBSVivaCell biosciencesC3580-0500
PBSSolarbioP1010
Penicilina-estreptomicina (100x)Gibco15140-122
Bomba peristálticaBaodingRongbaiYZ1515PPS
Proteínas G PerlasInvitrogen10004D
RotadorKylin-BellQB-528
RPMIVivaCell biosciencesC3010-0500
Inhibidor de tripsina de sojaSigmaT6522Culata de 10 mg/mL
Aguja estampadaJinhuan MedicalHM601
Triton X-100SolarbioT8200
Trypan azulSigmaT614610 mg/mL culata
Tipo I cola de rata colágenoBD 354236

Referencias

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