Artículo de método

Generación de cultivos monoclonales a partir de la línea celular Drosophila melanogaster JW18 infectada por Wolbachia

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DOI:

10.3791/68207

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27 de junio de 2025

 , 
1Institute of Environmental Sciences, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Doctoral School of Exact and Natural Sciences, Jagiellonian University, 3Department of Evolution, Ecology and Behaviour, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences, University of Liverpool

En este artículo

Resumen

Las líneas celulares son útiles en estudios sobre organismos intracelulares que no pueden cultivarse fuera de sus células huésped. Aunque las líneas infectadas por Wolbachia han permitido muchos descubrimientos, la heterogeneidad dentro de estas líneas puede conducir a resultados experimentales variables. Presentamos un protocolo para la generación de clones unicelulares y cultivos continuos a partir de células JW18 infectadas con Wolbachia.

Resumen

Las líneas celulares son modelos ampliamente utilizados en la investigación biológica. Son particularmente útiles en estudios de bacterias intracelulares que no se pueden propagar de manera eficiente fuera de los organismos huéspedes. La wolbachia, un simbionte intracelular de muchos invertebrados, induce fuertes efectos reproductivos y antivirales en sus insectos huéspedes. Las células de insectos infectadas con Wolbachia se han utilizado ampliamente para estudiar los fenotipos de Wolbachia. Sin embargo, estas líneas celulares a menudo consisten en poblaciones mixtas de células con fenotipos y respuestas potencialmente diferentes a los tratamientos experimentales. En particular, se ha informado que las líneas celulares con Wolbachia exhiben tasas de crecimiento variables y una prevalencia de infección por Wolbachia variable de un paso a otro. Para remediar esto, generamos líneas celulares monoclonales a partir de la línea celular JW18 derivada de Drosophila melanogaster infectada por Wolbachia. Estas líneas clonales se establecieron en diferentes puntos temporales y muestran diferentes estados de infección por Wolbachia. Esta variabilidad sugiere que cualquier tratamiento aplicado a una población parental JW18 podría conducir a la selección de subpoblaciones en lugar de influir en la fisiología de toda la cultura. Aquí, presentamos un protocolo para generar clones unicelulares y cultivos clonales continuos a partir de células de insectos infectadas con Wolbachia, lo que permite experimentos más controlados y reproducibles.

Introducción

Las células de Drosophila melanogaster se utilizan ampliamente en estudios genéticos, investigación de enfermedades y como plataforma para el cribado de fármacos de alto rendimiento1. También son útiles en el estudio de uno de los microbios intracelulares más prevalentes en el planeta: Wolbachia. La wolbachia es una bacteria intracelular obligada gramnegativa que se encuentra en el 40-70% de las especies de insectos 2,3,4, donde se propaga por vía materna e induce manipulaciones reproductivas 5,6,7,8. La wolbachia también puede proporcionar a los huéspedes infectados protección antiviral 9,10,11,12,13,14,15 que, junto con las manipulaciones reproductivas, está siendo explotada para controlar la transmisión de arbovirus de los mosquitos a los humanos 16,17. En varios sistemas, se ha demostrado que la Wolbachia controla la apoptosis18, suministra nutrientes esenciales19 y altera la expresión génica y proteica 20,21,22,23,24,25.

Las líneas celulares surgieron como un modelo para estudiar Wolbachia debido a su biología simple, conveniencia y capacidad para propagarse en grandes cantidades. Las líneas celulares han demostrado ser útiles para preadaptar Wolbachia a la simbiosis con nuevos huéspedes26 y permitir que Wolbachia acumule mutaciones27,28. Se utilizaron para detectar compuestos anti-Wolbachia, que pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades filariales29 y en el estudio de la interacción de traducción entre Wolbachia y huésped30. Aunque las líneas celulares son indispensables en los estudios sobre las simbiosis de Wolbachia 29,30,31, los mecanismos subyacentes a la mayoría de los fenotipos de Wolbachia siguen siendo desconocidos. Esto sugiere que el sistema modelo de cultivo celular aún puede mejorarse.

Las líneas celulares de insectos infectadas con Wolbachia se derivan de embriones y larvas de insectos. Aa23, derivada de embriones de Aedes albopictus, fue la primera línea32 estable infectada por Wolbachia, posteriormente utilizada para muchos estudios sobre la simbiosis de Wolbachia 33,34,35. La línea celular JW18 fue una de las primeras líneas infectadas naturalmente por Wolbachia generadas a partir de D. melanogaster29,36. Esta línea, derivada de embriones de 1 h a 15 h de moscas infectadas con wMel, también ha servido como fuente de Wolbachia para otras líneas celulares de Drosophila: 1182-4H y S2R+37. Como los embriones tienen una alta proporción de células pluripotentes, al adaptarse a crecer en plástico, pueden adquirir nuevas características, a veces diferentes para los linajes celulares individuales. Esto puede explicar la heterogeneidad de las morfologías celulares y las frecuencias de infección por Wolbachia observadas en estas células en un momento dado y a lo largo de generaciones29.

La diversidad celular dentro del cultivo JW18 genera preocupación, ya que los estudios sobre líneas celulares de mosquitos, como Aag2, han demostrado que las líneas celulares monoclonales y parentales pueden responder de manera diferente a los tratamientos debido a las variaciones en las características celulares38. En consecuencia, la administración de tratamientos a una población de células mixtas podría arrojar resultados engañosos. Para estudiar la respuesta de una población celular homogénea a un tratamiento (no la selección de tipos celulares individuales), hemos generado cultivos monoclonales a partir de la línea celular parental JW18. No ha habido intentos previos de generar cultivos monoclonales a partir de estas células. El protocolo consiste en aislar células individuales de la línea celular parental JW18, seguido de su mantenimiento y transferencia a matraces para establecer cultivos clonales continuos. Verificamos el estado de infección por Wolbachia de las líneas individuales, mostrando que difieren en esta característica clave. Los cultivos celulares homogéneos son fundamentales para garantizar la precisión y la reproducibilidad de futuros experimentos.

Protocolo

NOTA: Todo el trabajo con células vivas y sus medios debe realizarse en una cabina de seguridad biológica para evitar la contaminación.

1. Preparación de los medios

  1. Prepare un medio de cultivo fresco complementando el medio Shield and Sang Insect con un 10% de suero fetal bovino (FBS).
  2. Medios gastados y acondicionados
    1. Cultive las células JW18 en un matraz de 25cm2 que contenga medio fresco de Shield e Sang Insect suplementado con un 10% de FBS a 25 °C. Incubar hasta que las células alcancen la confluencia (~1 semana).
    2. Filtre el medio de cultivo celular gastado de 1 semana de antigüedad utilizado para cultivar las células, para eliminar la Wolbachia, los restos celulares y otros contaminantes: utilice un filtro estéril de 5 μm y, a continuación, un filtro estéril de 0,2 μm instalado en una jeringa de 50 ml.
    3. Prepare el medio acondicionado complementando el medio fresco con un 20% del medio gastado. Prepare suficiente medio acondicionado para una placa de 96 pocillos (~30 mL); utilizando una pipeta serológica, mezcle 6 mL del medio gastado filtrado con 24 mL de medio fresco Shield and Sang Insect suplementado con un 10% de FBS.

2. Preparación de la placa de 96 pocillos

  1. Preparación de la suspensión de celdas JW18
    1. Raspe las células de un matraz confluente de 1 semana de antigüedad con un raspador de células y vuelva a suspenderlas con una pipeta serológica.
    2. Cuente las células utilizando una cámara de Neubauer y dilúyalas con medio acondicionado para lograr una concentración final de 2 x 103 células/mL.
  2. Adición de medio acondicionado a la placa
    1. Transfiera el medio acondicionado preparado a un depósito de reactivo.
    2. Con una pipeta multicanal, agregue 100 μL de medio acondicionado a cada pocillo de la placa de 96 pocillos, excepto el pocillo A1.
  3. Dilución en serie de la suspensión celular
    1. Agregue 200 μL de la suspensión celular al pocillo A1.
    2. Con una pipeta monocanal, transfiera 100 μL del pocillo A1 al pocillo B1 y mezcle suavemente (evite las burbujas) como se muestra en la figura 1A.
    3. Repita la dilución en serie en la columna 1, desechando los últimos 100 μL del último pocillo.
  4. Dilución en toda la placa
    1. Agregue 100 μL de medio acondicionado a cada pocillo de la primera columna, hasta un volumen total de 200 μL. Mezcle suavemente.
    2. Con la pipeta multicanal, transfiera 100 μL de la primera columna a la segunda. Mezclar suavemente.
    3. Repita este proceso para todas las columnas (1-12) a lo largo de la placa (Figura 1A).
    4. Después de la resuspensión, deseche 100 μL de la última columna. En este punto, cada pocillo contiene 100 μL de suspensión celular.
    5. Agregue 100 μL adicionales de medio de cultivo a todos los pocillos, elevando el volumen final de cada pocillo a 200 μL.

3. Identificación de células individuales

  1. Cubra la placa, séllela con Parafilm y etiquétela adecuadamente.
  2. Observe la placa bajo un microscopio, revisando cuidadosamente cada pocillo en busca de células individuales (Figura 1B). Asegúrese de escanear los pocillos y los bordes a fondo para confirmar la presencia de una sola célula.
    NOTA: Este es uno de los pasos más críticos del protocolo.
  3. Registre el número de pocillos de celdas individuales en un mapa de placa de 96 pocillos (en papel).
    NOTA: Es más probable que las células individuales se encuentren en los pozos hacia la derecha y la parte inferior de la placa.
  4. Una vez identificadas y marcadas las células individuales, almacene la placa en una incubadora a 25 °C. Monitoree las células cada 2 días.

4. Mantenimiento y transferencia de células

  1. Monitoreo de células
    NOTA: Las células JW18 suelen tardar 3 días en comenzar a dividirse a partir de una sola célula, y las poblaciones clonales pueden crecer a diferentes ritmos (Figura 2).
    1. Monitoree los pozos cada 2-3 días para detectar contaminación bacteriana y asegurarse de que el medio no se haya secado. Si los pozos parecen estar secándose, rellénelos con medio fresco según sea necesario.
  2. Expansión celular
    1. Una vez que las células alcanzan la confluencia en la placa de 96 pocillos, transfiéralas a una placa de 24 pocillos (Figura 1D).
    2. Posteriormente, transfiera las celdas a una placa de 6 pocillos y finalmente a un matraz (Figura 1E, F).
      NOTA: Esta expansión escalonada aumenta la probabilidad de establecer una línea celular clonal continua.
  3. Congelación celular
    1. Una vez que se establece un cultivo clonal, congele una parte de las células para su uso futuro.
      1. Raspe las células del matraz con un raspador de células y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C.
      2. Prepare un medio de congelación 2x (Shield y Sang Insect Medium suplementado con 20% de FBS y 10% de DMSO).
      3. Después de la centrifugación, deseche parte del sobrenadante, dejando la mitad del volumen final deseado. Añada un volumen igual del medio de congelación 2x al sobrenadante restante y vuelva a suspender suavemente el pellet con una pipeta.
      4. Alícuota 1 mL de la suspensión en cada criovial de 1,5 mL y coloque los viales en hielo. Almacene los viales a -80 °C durante la noche, luego transfiéralos a un tanque de nitrógeno líquido al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.

5. PCR para confirmar el estado de Wolbachia

  1. Extraiga el ADN de las muestras de cultivo monoclonal utilizando el método de fenol-cloroformo39.
    1. Coloque 1 mL de células confluentes raspadas y resuspendidas en medio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugue las células a 290 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante (medio de cultivo celular) y coloque el tubo sobre hielo.
    2. Agregue 250 μL de solución A, que consta de 0,1 M de Tris HCl (pH 9,0), 0,1 M de EDTA y 1% de SDS. Vuelva a suspender las células e incube a 70 °C durante 30 min en un bloque calefactor.
    3. Después de la incubación, agregue 35 μL de acetato de potasio 8 M, agite el tubo suavemente (evite el vórtice) e incube en hielo durante otros 30 minutos.
    4. Centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min a 4 °C, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y añadir un volumen igual de fenol-cloroformo. Agitar bien y girar de nuevo, repitiendo este paso una vez.
    5. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo, luego agregue 150 μL de isopropanol, agite y centrifugue a 10,000 rpm durante 5 minutos. Retire el sobrenadante con cuidado, lave el pellet con 1 mL de etanol al 70% y centrifugue a 13.000 rpm.
    6. Después de secar el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente, vuelva a suspenderlo en 100 μL de tampón TE. Cuantificar el ADN y almacenar a -20 °C.
  2. Realice una PCR convencional con el ADN extraído de las muestras de cultivo monoclonal para detectar Wolbachia utilizando la mezcla maestra de PCR DreamTaq Green. Utilice los cebadores wsp 81F y wsp 691R40 para los cebadores Wolbachia y Drosophila rpl32 41 para el control de calidad del ADN.
    1. Agregue 7,5 μL de mezcla maestra, 0,5 μL de cada cebador a 10 μM, 1 μL de ADN diluido 1:50 y 5,5 μL de agua de grado molecular para obtener 15 μL de la mezcla de reacción.
    2. Utilice el siguiente programa de PCR: 94 °C durante 4 min, 30 ciclos x (94 °C durante 40 segundos, 55 °C durante 40 segundos, 72 °C durante 30 segundos), 72 °C durante 10 minutos. Después de la PCR, guarde las muestras a 4 °C.
  3. Realizar electroforesis en gel de agarosa en un gel de agarosa al 2% en tampón TAE a 90 V con los productos de PCR obtenidos para visualizar las bandas. Agregue una escalera de ADN al lado para identificar las bandas para wsp (632 pb) y rpl32 (194 pb).

6. Tinción de FISH para visualizar la infección por Wolbachia en líneas celulares

  1. Realice la hibridación fluorescente in situ (FISH) como se describe en el protocolo Stellaris FISH para que las células adherentes tiñan Wolbachia con el conjunto de sondas FISH de ARNr 16s marcado con Quasar 670. Tiñir los ácidos nucleicos con Hoechst 33342.
    NOTA: Este conjunto de sondas fue diseñado en base a la secuencia de ADNr wMel 16S y coincide con el conjunto de sondas publicado en Schneider et al.42 (ver Tabla Suplementaria S1).
    1. Prepare los reactivos (tampón de fijación, tampón de hibridación, tampón de lavado A y B, juego de sondas personalizadas reconstituidas) siguiendo las instrucciones del fabricante43.
    2. Cultive células adherentes en un cubreobjetos redondo de 18 mm esterilizado con etanol al 70% en una placa de cultivo de 24 pocillos. Una vez que las células alcancen la confluencia deseada, aspire el medio de crecimiento y lave con 1 mL de 1x PBS. Añadir 1 mL de tampón de fijación e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Lave las células dos veces con 1 mL de 1x PBS.
    3. Permeabilizar sumergiendo el cubreobjetos con células en 1 mL de etanol al 70% e incubar durante la noche a 4 °C; Almacene las muestras en etanol a esta temperatura hasta 1 semana antes de la hibridación. Aspirar el etanol y añadir 1 mL de tampón de lavado A; Incubar a temperatura ambiente durante 2-5 min.
    4. Prepare una cámara humidificada colocando una toalla de papel saturada de agua y una capa de Parafilm en una placa de cultivo de 150 mm. Pipetear 100 μL de tampón de hibridación que contiene 1 μL de material de sonda de 12,5 μM en el Parafilm. Invierta suavemente el cubreobjetos, colocando las células con el lado hacia abajo sobre la gota de tampón de hibridación. Cubra y selle la cámara con Parafilm, luego incube en la oscuridad a 37 °C durante al menos 4 h (hasta 16 h si es necesario).
    5. Después de la hibridación, transfiera con cuidado las celdas del cubreobjetos a un pocillo nuevo que contenga 1 mL de tampón de lavado A e incube a 37 °C durante 30 minutos. Aspire el tampón y añada 0,5 μL de caldo Hoechst de 20 mM a 700 μL de tampón de lavado A; incubar a 37 °C durante 30 min en la oscuridad.
    6. Retire la solución de Hoechst y añada 1 ml de tampón de lavado B; Incubar a temperatura ambiente durante 2-5 min. Finalmente, coloque una pequeña gota (10 μL) de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio y monte las celdas de vidrio con el lado hacia abajo sobre la gota. Absorba suavemente el exceso de medio de montaje y selle el perímetro de la cubierta con esmalte de uñas transparente.
    7. Guarde los portaobjetos a 4 °C y proceda a la toma de imágenes lo antes posible.
    8. Procese las imágenes con ImageJ44. Divida los canales y cambie la paleta de colores según sea necesario.

Resultados

Visualizamos el proceso de establecimiento de cultivos monoclonales con microscopía óptica desde el día de la preparación de la suspensión unicelular y la siembra (día 0) hasta el establecimiento de líneas celulares continuas (día 45 o 77, Figura 2). Los primeros signos de división celular se observaron el día 3 (4 días después de la siembra, ya que la siembra se realizó el día 0) cuando ya había cuatro células por pocillo (Figura 2). El día 14, los clones crecieron como una monocapa (JW18-B9, C7 y E5) o como una esfera (JW18-G4), que se interrumpió durante el paso. El día 28, las diferencias en el crecimiento entre líneas celulares fueron más obvias. El cultivo de JW18-C7 fue confluente en el día 45, mientras que los cultivos clonales restantes solo se establecieron en el día 77. También hemos visualizado los cuatro cultivos diferentes 30 veces después del establecimiento para capturar las diferencias en las morfologías celulares (Figura 3).

Para determinar el estado de infección por Wolbachia en los cultivos monoclonales, se realizó PCR (Figura 4) y FISH (Figura 5). Observamos que todos los clones excepto uno (JW18-C7) produjeron una banda para el gen wsp , indicativo de una infección por Wolbachia . FISH corroboró los resultados de la PCR: los clones JW18-B9, JW18-E5 y JW18-G4 conservaron la infección por Wolbachia , mientras que el clon JW18-C7 no tenía Wolbachia. En general, a partir de una población mixta de células JW18, pudimos establecer cuatro cultivos clonales, tres de los cuales conservaron la infección original por Wolbachia . Se puede acceder a los datos brutos en Figshare: https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9.

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Figura 1: Flujo de trabajo para la generación de cultivos monoclonales. (A) Diluciones primarias y secundarias en la placa de 96 pocillos. (B) Células individuales después de la dilución en serie. (C-E) Progresión en la multiplicación de células y transferencia de placa de 96 pocillos a placa de 24 y 6 pocillos, respectivamente. (F) Cultivos continuos en matraces decultivo celular de 25 cm2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Progresión de las líneas clonales JW18 desde una sola célula hasta un cultivo multicelular. Imágenes de campo claro de líneas clonales desde el día 0 (día de siembra) hasta el día 77, cuando todas las líneas se establecieron con éxito en un matraz de cultivo celular de 25cm2 . Barras de escala = 25 μm (día 0), 50 μm (día 3), 150 μm (día 14), 300 μm (días 28, 45, 77). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Morfología de las líneas clonales individuales de JW18. Imágenes de campo claro de líneas clonales que muestran morfologías celulares en el paso 30 después del establecimiento. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Estado de Wolbachia en cultivos clonales examinados por PCR. PCR para Wolbachia en la línea celular parental JW18 y las líneas clonales JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5 y JW18-G4 en el paso 11 después del establecimiento. La banda Wolbachiawsp confirma la presencia de Wolbachia, mientras que la banda Drosophilarpl32 es una PCR de control de calidad del ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Estado de Wolbachia en cultivos clonales examinados por FISH. Línea celular parental JW18 y clones JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5, JW18-G4 visualizados por tinción FISH en el paso 13 después del establecimiento. Wolbachia se tiñe con la sonda Stellaris FISH de ARNr 16s marcada con Quasar 670 en magenta, y los ácidos nucleicos se tiñen con Hoechst 33342 en cian. Barras de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla suplementaria S1: Sondas de oligonucleótidos diseñadas contra Wolbachia wMel 16S rDNA y su comparación con las sondas publicadas por Schneider et al.42. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Aquí describimos un método estandarizado para generar clones unicelulares a partir de la línea celular JW18 D. melanogaster, que se puede aplicar a otras líneas celulares de Drosophila e insectos. El protocolo implica la dilución en serie de una suspensión celular preparada en una placa de 96 pocillos para aislar células individuales. A continuación, estas células se incuban en condiciones óptimas para establecer cultivos continuos. El protocolo también incluye la adición de un 20% de medios acondicionados para promover la supervivencia celular y la división de células individuales45,46.

Un paso crítico en el protocolo es verificar la presencia de una sola celda en cada pozo después de la dilución en serie. Este paso requiere una atención meticulosa, ya que es esencial para el éxito de todo el protocolo. Para facilitar la confirmación futura del origen de una sola célula, se recomienda capturar imágenes de los pocillos seleccionados desde varios ángulos.

Otro paso clave consiste en transferir células entre placas de cultivo. Para garantizar el establecimiento exitoso de un cultivo continuo, las células solo deben transferirse una vez que hayan alcanzado la confluencia. Si el crecimiento celular se estanca durante más de dos semanas, refrescar el medio puede promover un mayor crecimiento. La transferencia prematura de células antes de la confluencia puede provocar la muerte celular.

Si bien este protocolo requiere más tiempo y mano de obra que otros métodos comúnmente utilizados, como la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)38,46, ofrece varias ventajas. Estos incluyen rentabilidad, riesgo mínimo de daño celular, sin necesidad de marcadores fluorescentes, equipos costosos y tiempo de optimización. En general, este protocolo es muy adecuado para generar poblaciones celulares homogéneas de insectos a partir de líneas celulares continuas.

Propiedades de los cultivos monoclonales

Nuestros resultados muestran que los cultivos monoclonales difieren en cuanto a la velocidad de su establecimiento y el estado de infección por Wolbachia (Figura 2, Figura 4 y Figura 5). El clon libre de Wolbachia JW18-C7 fue el más rápido en alcanzar la confluencia en nuestro protocolo de aislamiento de una sola célula. Wolbachia podría haber estado siempre ausente de este linaje celular, o podría haberse perdido debido a la incapacidad de mantenerse al día con la tasa de división de la célula huésped. También podría haberse perdido debido a la baja densidad celular inicial en nuestro protocolo de clonación. Sin embargo, como esto no sucedió con las otras líneas celulares clonales, consideramos que esto es poco probable. La infección experimental de JW18-C7 con Wolbachia (junto con otros clones tratados con tetraciclina) podría responder si esta línea es permisiva para el simbionte.

La heterogeneidad celular no es exclusiva de la línea celular JW18 y se ha descrito anteriormente para otras líneas celulares infectadas por Wolbachia 32,47,48,49,50,51,52. Un intento previo de mejora implicó una transferencia de Wolbachia de huevos de D. simulans o células Aa23 a una línea celular C7-10 de A. albopictus 53. C7-10 ha sido clonado muchos años antes de las transferencias de Wolbachia 54,55, y las transferencias no constituyen la infección natural que pretendemos estudiar.

La diferencia en el estado de infección por Wolbachia y el momento del establecimiento del cultivo monoclonal (indicativo de diferencias en la tasa de división celular) para clones individuales de JW18 puede tener profundas implicaciones para estudios previos que relacionan el título de Wolbachia y la tasa de crecimiento de células de insectos en respuesta a tratamientos específicos. La alteración del número de células, las densidades de simbiontes o los cambios en la expresión génica durante el tratamiento pueden ser el resultado de la selección de tipos de células con propiedades específicas en lugar de cambios en el estado de todas las células de una población mixta. Por lo tanto, la administración de tratamientos a una población celular mixta con la variabilidad de las características clave puede producir resultados sesgados e irreproducibles.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a William Sullivan (Universidad de California, Santa Cruz, EE.UU.), Laura Serbus (Universidad Internacional de Florida, EE.UU.) y Luis Teixeira (Universidade Católica Portuguesa, Lisboa, Portugal) por la línea celular JW18 y por las útiles sugerencias sobre cómo trabajar con ella. Agradecemos a Nidhi Krishna Shrivastava (Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia) por sus útiles sugerencias sobre el protocolo. Agradecemos a Yuliya Chykunova (Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia) por la revisión del manuscrito.

La Figura 1 se creó con BioRender (Chrostek, E. (2024) https://BioRender.com/o69b306).

Este trabajo cuenta con el apoyo de la ERC Starting Grant (ID del acuerdo de subvención: 101040311) otorgada a EC y la beca doctoral de la Escuela Doctoral de Ciencias Exactas y Naturales (Universidad Jagellónica) otorgada a NF. Sin embargo, los puntos de vista y opiniones expresados son únicamente los de los autores y no reflejan necesariamente los de la Unión Europea o de la Agencia Ejecutiva del Consejo Europeo de Investigación. Ni la Unión Europea ni la autoridad que concede la ayuda pueden ser consideradas responsables de ellos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.22 µ M Filtro de jeringa   TPP99722Estéril
10x solución salina tamponada con fosfato (PBS)ThermoFisher Scientific70011044Estéril
Cubrecristales redondos de 12 o 18 mm Cualquier marca
Tubos Falcon de 15 mlGenoplast601052Estéril
Placa de 24 pocillosCitoUnoCC7682-7524Cultivo de tejidos tratado
5 µ Filtro de jeringa MWhatman10462000Estéril
Placa de 6 pocillosCitoUnoCC7682-7506Cultivo de tejidos tratado
Placa de 96 pocillosCitoUnoCC7682-7596Cultivo de tejidos tratado
AgarosaThermoFisher ScientificJ66501.30
Matraz de cultivo celular, 25 cm2Greiner Bio-one391-3103Estéril
Raspadores de células Greiner Bio-one391-3010Estéril
Esmalte de uñas transparente Cualquier marca
Viales CryoPureSarstedt72.379Estéril
DMSO, grado de cultivo celularMerckD2650-100MLEstéril
Mezcla maestra de PCR DreamTaqThermoFisher ScientificK1081
EDTAMerck324503-100GMEstéril
Fuente de alimentación de electroforesisMerckPS 251-2
Eppendorf  Concentrador PlusMerckEP5305000509En su lugar, se puede utilizar un concentrador de vacío de cualquier marca.
EtanolMerck1009861000
Sistema de imágenes EVOS M5000ThermoFisher ScientificAMF5000Se puede utilizar un microscopio invertido de cualquier marca para controlar la progresión de los clones. Se requiere un microscopio fluorescente para visualizar FISH.
Suero fetal bovinoMerckF9665Inactivado por calor
FormaldehídoThermoFisher ScientificModelo 047377.9L
Formamida MerckF7503-100ML
Tanques de electroforesis en gelCleaver ScientificMSMIDI
Generador de imágenes en gelBioRad12009077Sistema de imágenes en gel GelDoc Go
Escalera de ADN GeneRuler de 100 pbThermoFisher ScientificSM0243
Bloque calefactorThermoFisher Scientific88870005
Herasafe 2025 Cabina de seguridad biológica Clase IIThermoFisher Scientific51033314Se puede utilizar un gabinete de seguridad biológica de cualquier marca siempre que mantenga un ambiente estéril en el interior.
Hoechst 33342 Solución (20 mM) 5 mLThermoFisher Scientific62249Almacenar en la oscuridad.
Ácido clorhídricoMerck258148-2.5L
Integra Biosciences Corp PIPETBOY acu 2 Pipet AidFisher ScientificNC0085686Se puede utilizar un controlador de pipetas serológico de cualquier marca.
IsopropanolMerckI9516-1L
Congelador de laboratorio  Liebherr LGUex 1500 MediLineCualquier congelador capaz de mantener una temperatura constante es adecuado.
Tanque de nitrógeno líquidoThermoFisher ScientificCY50985
Portaobjetos de microscopioMerckCLS294875X25-72EA
Agua de grado molecular
Pipeta multicanalEppendorf3125000036
NanogotaPeqlabND-1000
Hemocitómetro NeubauerMerckBR717810-1EA
Parafilm  M Película de selladoMerckHS234526B-1EA
Incubadora refrigerada por PeltierMemmertIPP55plus¿Alguna incubadora capaz de mantener constantes 25? C es adecuado. No se requiere control 2 para la línea celular JW18 o sus clones.
Fenol / Cloroformo / Alcohol isoamílico (25:24:1)ThermoFisher Scientific327115000
Juego de pipetasEppendorfEP2231300008
Acetato de potasioMerckP1190-500GEstéril
Quasar  Sonda FISH de ARNr 16s marcada con 670  ponerTecnologías de biobúsquedaLas secuencias de las sondas hechas a medida se pueden encontrar en la Tabla 1.
Microcentrífuga refrigeradaLabnetC2500-R
rpl32 cebador hacia adelante 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'Genómica de EurofinsHecho a medida en base a la referencia citada en el documento
rpl32 cebador inverso 5'-CAATCTCCTTGCCTTCTTG-3'Genómica de EurofinsHecho a medida en base a la referencia citada en el documento
SDSThermoFisher ScientificAM9823Estéril
Pipetas serológicasCorning357771
Escudos y Sang M3 Insecto MedioMerckS8398Estéril
Tampón de hibridación de ARN FISH de Stellaris  Tecnologías de biobúsquedaSMF-HB1-10Estéril
Tampón de lavado de ARN FISH de Stellaris    Tecnologías de biobúsquedaSMF-WA1-60Estéril
Tampón de lavado de ARN FISH Stellaris B     Tecnologías de biobúsquedaSMF-WB1-20Estéril
Depósitos de reactivos estériles ThermoFisher Scientific8094Estéril
Tampón TAEMerck10617410001x 
Tampón TEMerck93283Estéril
TermocicladorSyngen BiotechTermobloque 96En su lugar, se puede utilizar termociclador de cualquier marca.
Base TrisMerck10708976001Estéril
Congelador de temperatura ultrabajaCorporación PHC MDF-DU502VH-PECualquier congelador de laboratorio capaz de mantener -80 ? C.
Medio de montaje Vectashield    Laboratorios VectorH-1000-10
cebador wsp hacia adelante 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'Genómica de EurofinsHecho a medida en base a la referencia citada en el documento
cebador wsp reverso 5'-AAAAATTAAACGCTCCA-3'Genómica de EurofinsHecho a medida en base a la referencia citada en el documento

Referencias

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