Artículo de método

Modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura

DOI:

10.3791/68208

⸱

30 de mayo de 2025

 ,  , 
1Department of Chemical, Biological, and Materials Engineering, University of South Florida

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para el uso de sustratos de levadura mostrados en la superficie para ensayos de modificación enzimática. La plataforma se demostró utilizando el análisis de la actividad de desfosforilación de la tirosina fosfatasa SHP-2 frente a uno de sus sustratos como ensayo representativo de modificación enzimática.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La visualización de la superficie de la levadura es una estrategia de ligamiento genotipo-fenotipo que permite el cribado de alto rendimiento de la función de las proteínas. Tradicionalmente, la visualización de la superficie de la levadura se ha aplicado a la evolución de nuevas proteínas de unión, con citometría de flujo utilizada para evaluar y clasificar por niveles de fuerza de unión. Recientemente, ha habido un creciente interés en la aplicación de la visualización de la superficie de la levadura para la modificación enzimática del cribado de variantes de sustrato, con modificaciones aditivas (por ejemplo, fosforilación) o sustractivas (por ejemplo, proteólisis) que proporcionan un fenotipo legible por citometría de flujo. Tales modificaciones se aplican regularmente utilizando la colocalización intracelular, pero la capacidad de lograr la modificación enzimática extracelular de los sustratos mostrados podría abrir muchas más reacciones a la investigación. En este trabajo se describen las técnicas para diseñar y aplicar ensayos de cribado para la modificación enzimática extracelular de los sustratos candidatos que se muestran en la superficie de la levadura y su posterior evaluación mediante análisis de citometría de flujo. Proporcionamos estos protocolos en el contexto de las fosfatasas, la levadura desfosforilante, los sustratos mostrados que contienen residuos de tirosina fosforilada y comentamos cómo este marco aplicado se puede adaptar al desarrollo de ensayos de cribado para otros pares de enzimas-sustrato.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La comprensión de las interacciones entre las enzimas y sus dianas se ha convertido en un área de investigación cada vez más interesante debido a su necesidad en la caracterización biológica de las vías que controlan la homeostasis celular y el desarrollo de enfermedades 1,2. Las enzimas son responsables de la catálisis de muchas de las reacciones que mantienen la vida biológica, controlando vías necesarias como el metabolismo celular 3,4, la señalización5, e incluso procesos fundamentales como la reparación del genoma 6,7. Debido a su papel en estos procesos, sus interacciones también juegan un papel en el desarrollo de muchas enfermedades, ya que las desviaciones en su actividad pueden causar una desregulación severa en la actividad celular, causando apoptosis o proliferación de células cancerosas dañinas2. El estudio de la actividad enzimática ha tenido importantes aplicaciones en el desarrollo de nuevas terapias 8,9, requiriendo ensayos que se adapten a cada interacción enzima-sustrato específica10. Se han establecido múltiples ensayos enzimáticos como protocolos estándar para la evaluación y caracterización de estas interacciones. Los ensayos desarrollados para analizar las interacciones enzimáticas se clasifican en ensayos de detección que monitorean la unión para la activación/inhibición11 o ensayos que monitorean la modificación del sustrato por enzimas12.

Una de las principales funciones de las enzimas es la regulación del comportamiento celular. La transducción de señales, la respuesta intracelular de una célula a un desencadenante extracelular13, es responsable de la supervivencia y funcionalidad celular. La proliferación celular, la diferenciación y muchos otros procesos funcionales involucran vías de señalización con interacciones enzimáticas que las gobiernan14,15. Las enzimas catalizan modificaciones postraduccionales, que a menudo modulan las redes masivas de señalización responsables de la correcta transmisión de mensajes extracelulares16. La fosforilación de proteínas es la modificación postraduccional más común, ubicua en la señalización celular y en muchas otras vías celulares. En consecuencia, las proteínas quinasas se han convertido en una proporción significativa de posibles dianas terapéuticas debido a su papel regulador crítico17. Las fosfatasas son las moléculas moduladoras naturales de los complejos de señalización celular basados en fosfato18,19, y tienen la capacidad de eliminar los residuos de fosfato de sus proteínas diana20. En la última década, las fosfatasas se han convertido en una diana terapéutica importante para el tratamiento del cáncer21 y las enfermedades inflamatorias22 debido a su participación en la regulación de las vías de señalización posteriores en múltiples tipos de células. Juntas, las proteínas quinasas y las fosfatasas proporcionan una amplia gama de interacciones, que pueden estudiarse mediante el desarrollo de protocolos de ensayos enzimáticos específicos.

La visualización de la superficie de la levadura se ha utilizado como herramienta para la caracterización y evaluación de la actividad enzimática23,24. Proporciona una plataforma de alto rendimiento para el cribado de procesos de modificación postraduccional cuando se combina con estrategias de secuestro del retículo endoplásmico25,26. Esto permite que los pares quinasa-sustrato se colocalicen y retengan en el retículo endoplásmico a través de la unión a los receptores KDEL27, donde la fosforilación del sustrato puede ocurrir a tasas mayores debido a la proximidad entre las quinasas y sus objetivos. La unión al receptor KDEL está mediada por una secuencia de retención del retículo endoplásmico FEHDEL C-terminal que ha demostrado tener una mayor capacidad de retención que otras secuencias HDEL25,28. A continuación, el sustrato fosforilado se ancla a la superficie de la levadura para su posterior evaluación mediante citometría de flujo29. Actualmente, no existen protocolos generalizables establecidos para la modificación enzimática de los sustratos mostrados en la superficie de la levadura. Ampliamos las capacidades de visualización de la superficie de la levadura aprovechando las variantes de sustrato fosforilado expresadas extracelularmente y modificándolas a través de la desfosforilación por su fosfatasa conocida. El análisis de citometría de flujo proporciona una plataforma para la evaluación fenotípica de los sustratos antes mencionados a través de la medición de alteraciones en la mediana de fosforilación como consecuencia de la incubación con la fosfatasa conocida. Esto proporciona un método adaptable para la modificación postraduccional de proteínas mostradas en la superficie, al tiempo que proporciona un método para el análisis de modificación enzimática de las interacciones cuando se utiliza la plataforma de visualización de la superficie de la levadura.

Presentamos técnicas para el desarrollo y aplicación de un ensayo de modificación enzimática que describe la introducción de una interacción quinasa-sustrato en la plataforma de visualización de la superficie de la levadura, la co-incubación del sustrato fosforilado expresado con una fosfatasa recombinante, y el posterior análisis de la actividad de desfosforilación mediante citometría de flujo. En este informe, esto se logra mediante la colocalización del dominio citoplasmático de CD28 con la quinasa de linfocitos (LCK) en el retículo endoplásmico de levadura, seguido de la visualización del CD28 fosforilado en la superficie de la levadura y la posterior desfosforilación por la región de homología Src que contiene fosfatasa-2 (SHP-2). Un anticuerpo antifosfotirosina pan (en este estudio, 4G10), que detecta residuos de tirosina fosforilada en una amplia variedad de secuencias peptídicas, se utiliza para cuantificar el nivel de fosforilación en función del tratamiento con fosfatasa. El proceso detallado proporciona un enfoque generalizable para investigar las interacciones enzima-sustrato; Una forma prospectiva de estudiar enzimas y sustratos de forma purificada.

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Protocolo

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1. Crecimiento celular de levaduras que albergan plásmidos e inducción de la expresión de proteínas

  1. Siguiendo la receta descrita en la Tabla 1, prepare los medios necesarios para el crecimiento de levaduras que no contienen plásmidos (YPD), el crecimiento de células de levadura que contienen plásmidos (SD-CAA) y la inducción de la expresión de proteínas (SRG-CAA), así como placas SD-CAA.
  2. El ADN plásmido de la muestra de levadura que contiene el par quinasa-sustrato en células de levadura EBY-100 a través del método basado en cationes de litio30,31, comúnmente adoptado para su uso en kits de transformación de levadura de una variedad de fabricantes.
    NOTA: La electroporación32 u otras técnicas preferidas de transformación de plásmidos de levadura se pueden utilizar dependiendo de la construcción de plásmido que se esté transformando.
  3. Prepare un tubo de cultivo de 14 mL con 10 mL de medio YPD. Inocular células EBY-100 y cultivarlas en una incubadora agitadora a 30 °C, 300 rpm hasta que el cultivo alcance una densidad óptica (OD600nm) de 0,8-1,0 (8 x 106- 1 x 107 células/mL).
    NOTA: El diámetro exterior de600 nm se mide preparando cubetas de muestra de 3 ml que contienen diluciones 1:10 de cultivos de levadura en sus respectivos medios y cubetas en blanco de 3 ml que contienen los medios utilizados para las diluciones de muestras. El programa OD600nm en el espectrofotómetro se utiliza para medir primero la cubeta en blanco, luego cada cubeta de muestra configurando la dilución correspondiente preparada para cada muestra. 1 OD600 nm corresponde a 1 × 107 levaduras/mL.
  4. Recolectar las células centrifugando el cultivo a 1.000 x g durante 3 min, y lavar con la1ª solución de lavado suministrada en el kit de transformación de levaduras, o TE (10 mM de Tris-HCl y 1,0 mM de EDTA)31.
  5. Vuelva a granular las células a 1.000 x g durante 3 min y vuelva a suspender en 1 mL del tampón de transformación proporcionado en el kit de transformación de levadura, o agua estéril. Las pilas deben alícuotas de 50 μL y pueden almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
  6. Para la transformación de plásmidos, se prepara una alícuota por plásmido y se descongela en hielo, luego, se agregan directamente a las células 0,5-1,5 μg de ADN plásmido que contiene la construcción de visualización de levadura. Se añaden 0,5 mL de la solución de transformación proporcionada en el kit de transformación de levadura, o 0,5 mL de una solución estéril de polietilenglicol al 50% y LiOAc0,1 M 31. Combine bien la mezcla de células, ADN plasmídico y solución de transformación mediante pipeteo.
  7. Incubar la mezcla de transformación estáticamente durante 30-60 min a 30 °C, la mezcla de vórtice a intervalos de 15 min. Recolectar las células centrifugando a 1.000 × g durante 3 min.
  8. Prepare un tubo de cultivo de 14 mL con 4,5 mL de medio SD-CAA. Vuelva a suspender las células que contienen el plásmido deseado en 500 μL de SD-CAA e inocule los 4,5 mL preparados.
  9. Teniendo cuidado de no perforar el agar, distribuya 50 μL de los 5 mL de cultivo inoculado en una placa SD-CAA e incube estáticamente a 30 °C durante 48 h para determinar la eficiencia de la transformación.
  10. Incubar los 5 mL de cultivo celular SD-CAA en una incubadora agitadora a 30 °C, 300 rpm durante al menos 18 h. Supervise la densidad óptica (OD600 nm) después de 16 h y 20 h. Una vez que la muestra haya crecido hasta una densidad óptica suficiente que no exceda de 6, centrifugar el cultivo durante 3 min a 2.500 × g. Deseche el sobrenadante sin alterar la pelletza de levadura.
  11. Vuelva a suspender el pellet de levadura en SRG-CAA a un diámetro exterior final de600 nm inferior a 1 (<1 × 107 levaduras/ml).
  12. Incubar el cultivo de levadura en una incubadora agitadora a 30 °C, 300 rpm durante al menos 8 h pero no más de 24 h.
    NOTA: La inducción de la expresión de proteínas en las células de levadura puede variar entre 20 y 37 °C. 30 °C es adecuado para la síntesis de pares quinasa/sustrato29,33, pero puede ajustarse si se considera necesario para las proteínas específicas que se están estudiando.
  13. Mida OD600 nm para determinar la densidad de celdas.
    NOTA: El protocolo puede detenerse en este punto almacenando los cultivos de levadura a 4 °C.

2. Biotinilación del anticuerpo antifosfotirosina 4G10

  1. Vuelva a suspender un vial de 2 mg de PEG4-NHS-Biotina hasta una concentración final de 5 mM añadiendo 680 μL de PBS estéril.
    NOTA: La resuspensión de PEG4-NHS-Biotina debe realizarse inmediatamente antes de que se lleve a cabo la reacción de biotinilación. NHS se hidroliza en solución acuosa. El uso de PBS y viales estériles es importante para la preparación de reactivos para el almacenamiento a largo plazo y para su uso en ensayos basados en células para mitigar cualquier efecto potencial de los contaminantes en la viabilidad de los reactivos o en los ensayos sensibles que se están realizando.
  2. En función de la concentración de anticuerpos 4G10, agregue 100 μg de anticuerpo en un vial estéril de 1,7 ml.
  3. Añada 1 μL de los 5 mM de PEG4-NHS-Biotina preparados del paso 2.1 al vial que contiene los 100 μg de anticuerpo 4G10 para lograr una proporción molar de biotina a anticuerpo de 7,5:1. Pipetear la mezcla suavemente para homogeneizar la reacción.
  4. Incubar la reacción a temperatura ambiente con rotación constante durante al menos 2 h.
  5. Siga el protocolo del fabricante para las columnas de desalinización de centrifugación de 0,5 mL para intercambiar el tampón del 4G10 biotinilado (B-4G10) en PBS.
    NOTA: Las columnas de desalinización con un corte de peso molecular (MWCO) de 7 kDa se usan comúnmente para la biotinilación de anticuerpos para permitir que la biotina y otras moléculas pequeñas sin reaccionar se eliminen mientras se retiene el anticuerpo más grande.
  6. Diluir el anticuerpo B-4G10 hasta una concentración final de 1 μM en PBSA (PBS con 1 g/L de albúmina sérica bovina). Alícuota el anticuerpo B-4G10 en volúmenes más pequeños para evitar ciclos repetidos de congelación/descongelación.
    NOTA: Los anticuerpos biotinilados pueden almacenarse a 4 °C para su uso diario durante un máximo de 3 meses sin perder una eficacia significativa. Almacene el resto de las alícuotas que no estén en uso a -20 °C durante un máximo de 2 años.

3. Desfosforilación de sustratos expresados en la superficie celular de la levadura

  1. Prepare la solución tampón de trabajo 2x como se describió anteriormente en la literatura34.
    NOTA: Se recomienda 2x para facilitar la medición de los ingredientes necesarios.
  2. Prepare el tampón de trabajo para las muestras en un vial de 1,7 ml diluyendo la solución tampón 2x preparada en el paso 3.1 1:2 en agua desionizada.
    NOTA: El volumen total de reacción para cada muestra será de 20 μL, y cada muestra requerirá entre 10 μL y 18 μL de tampón de trabajo. Prepare suficiente tampón de trabajo para todas las muestras o controles.
  3. Siguiendo la preparación de muestra recomendada descrita en la Tabla 2, etiquete los viales de 1,7 ml con el nombre de control o muestra correspondiente.
  4. Sobre la base del diámetro exterior de600 nm medido en el paso 1.9, calcule el volumen de cultivo necesario para recuperar dos millones (2 × 106) células de levadura del cultivo de levadura correspondiente para cada muestra.
  5. Añada el volumen de cultivo de levadura calculado en el paso anterior en el vial de 1,7 ml para cada muestra.
  6. Centrifugar el vial durante 1 min a 4.500 × g. Retire con cuidado el sobrenadante con una micropipeta y deséchelo como residuo biopeligroso.
  7. Vuelva a suspender las células peletizadas en 1 ml de PBSA y repita el paso 3.6.
    NOTA: Es importante eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante sin alterar las células granuladas.
  8. Sobre la base de su concentración de existencias, calcule el volumen de SHP-2 humano recombinante necesario para tener una concentración final de 1.000 nM en un volumen total de reacción de 20 μL.
    NOTA: La SHP-2 recombinante debe alícuota en pequeños volúmenes para que cualquier proteína utilizada en cada ensayo no haya pasado por más de dos ciclos de congelación-descongelación. Cualquier SHP-2 que quede de una alícuota después de que todas las muestras se hayan preparado para un ensayo debe desecharse.
    Las concentraciones de enzimas recombinantes pueden variar en función del número de lote. El SHP-2 recombinante se formula comúnmente a una concentración de 0,2-0,4 mg/mL. Para una concentración de stock de 0,324 mg/mL SHP-2, esto corresponde a una concentración de stock de 4,696 μM (SHP-2 tiene un peso molecular de 69 kDa). 4,26 μL de la cepa SHP-2 en una reacción de 20 μL dan como resultado una concentración de reacción final de 1.000 nM SHP-2.
  9. Añadir 7,7 mg de DTT en 10 mL de agua desionizada preparada en un cónico de 15 mL para crear una solución de DTT de 5 mM. Si las limitaciones del equipo dificultan el peso de miligramos, agregue 0,77 g de DTT a 10 mL de agua desionizada, luego realice una dilución de 100x para crear la solución de DTT de 5 mM utilizada para el ensayo.
    NOTA: La solución de TDT se puede preparar en soluciones madre de mayor concentración para diluir a 5 mM si no es posible medir cantidades a escala de miligramos utilizando el equipo disponible. La solución de DTT debe prepararse fresca antes de la resuspensión celular en un tampón de trabajo debido a su tendencia a hidrolizarse, lo que la hace inestable durante largos períodos cuando se diluye en agua.
  10. Vuelva a suspender las células peletizadas en el tampón de trabajo preparado en el paso 3.2 de modo que el volumen final de reacción en cada muestra o control sea de 20 μl.
    NOTA: La cantidad de tampón de trabajo añadido debe calcularse en función de la cantidad de DTT (2 μL) y SHP-2 (calculada en el paso 3.8) que habrá en cada muestra.
  11. Añada 2 μL de la solución de DTT de 5 mM preparada en el paso 3.9 a cada muestra o control para obtener una concentración de reacción final de 0,5 mM de DTT.
  12. Añada el volumen de SHP-2 calculado en el paso 3.8 a cada muestra hasta obtener un volumen final de 20 μL y mezcle suavemente con una micropipeta.
  13. Envuelva las tapas de los viales de muestra en parafilm para evitar fugas o contaminación cruzada.
  14. Incubar las muestras a 37 °C durante 2 h en un rotor a velocidad constante.
  15. Retire las muestras del rotor y detenga la reacción agregando 1 mL de PBSA a cada muestra.
  16. Repita el paso 3.6.

4. Marcaje celular y análisis por citometría de flujo de sustratos desfosforilados

  1. Vuelva a suspender las muestras del paso 3.16 en una mezcla de 20 μL de sus reactivos primarios correspondientes, como se describe en la Tabla 2. Incubar las muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Se ha calculado que todas las concentraciones de reactivos utilizadas son superiores al número de proteínas expresadas en la superficie de las células de levadura. El cálculo supone la expresión de 10.000 proteínas/célula de todas las levaduras 2 x 106 en una muestrade 35, cuando habitualmente solo ~50% de ellas lo hacen. La Tabla 3 muestra la proporción de reactivos de marcado en exceso para cada uno de los reactivos expresada en la Tabla 2, calculada de la siguiente manera:
    figure-protocol-1
  2. Centrifugar las muestras a 4.500 × g durante 1 min y desechar el sobrenadante como residuo biopeligroso.
  3. Lave las células una vez resuspendiéndolas en 1 mL de PBSA. Repita el paso 4.2.
  4. Vuelva a suspender las muestras en una mezcla de 20 μL de sus reactivos secundarios correspondientes, como se describe en la Tabla 2. Incubar las muestras durante 15 min en ausencia de luz.
  5. Repita el paso 4.2.
  6. Repita el paso 4.3.
  7. Vuelva a suspender las muestras lavadas en 300-500 μL de PBSA y transfiéralas a tubos de poliestireno de 5 mL para analizarlas inmediatamente utilizando un citómetro de flujo adecuado.
    NOTA: Si es necesario transportar muestras, manténgalas sobre hielo húmedo. No se recomienda, pero las muestras se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 h como gránulos húmedos.
  8. Después de realizar el inicio y la preparación necesarios del citómetro para un nuevo experimento, haga clic en el botón Nuevo experimento dentro del menú Archivo , asigne un nombre al experimento y haga clic en Guardar para asegurarse de que los datos adquiridos se guarden en la ruta de archivo deseada.
  9. Seleccione el icono de diagrama de puntos dentro de la barra de herramientas superior para crear dos o más diagramas de puntos para cada muestra que se va a ejecutar. Para uno de los diagramas de puntos, seleccione el nombre del eje X para mostrar el canal FSC-A y el nombre del eje Y para mostrar el canal SSC-A. Este gráfico muestra la dispersión lateral - área frente a la dispersión directa - área y se utiliza para controlar las células de levadura para su posterior análisis.
  10. En otro diagrama de puntos, seleccione el nombre del eje X para mostrar el canal en el que el reactivo secundario dirigido al anticuerpo primario de la etiqueta antiepítopo emite fluorescencia. Seleccione el nombre del eje Y para mostrar el canal en el que el reactivo secundario de estreptavidina emite fluorescencia. Este gráfico mostrará solo los eventos cerrados desde el diagrama de dispersión lateral frente al frontal como células de levadura y se utiliza para mostrar la fosforilación de tirosina en el eje Y y la expresión de la superficie del sustrato en el eje X.
    NOTA: En este ejemplo, el reactivo secundario dirigido al anticuerpo primario anti-epítopo marca fluorescencia en el canal FITC (AF-488) y el reactivo secundario de estreptavidina emite fluorescencia en el canal AF-647. Los canales utilizados pueden variar en función de los reactivos primarios y secundarios utilizados durante el etiquetado.
  11. Coloque cada tubo de muestra en el soporte del tubo del citómetro y seleccione Ejecutar para que el citómetro comience a cargar la muestra y adquirir datos. Ajuste los eventos que se van a mostrar, los eventos que se van a registrar, el tiempo que se va a registrar y el caudal de muestra según sea necesario.
  12. Defina una puerta que rodee las células de levadura sanas en la gráfica SSC-A frente a FSC-A creada en el paso 4.9. La figura 1 ilustra una representación descriptiva de la estrategia de compuerta que se va a aplicar.
    NOTA: En el gráfico SSC-A frente a FSC-A, 100.000 eventos para mostrar y 50.000 eventos para registrar dentro de la puerta de levadura definida es una buena guía para visualizar y recopilar datos suficientes para un análisis posterior. Se pueden aplicar estrategias de compuerta más estrictas para seleccionar la levadura singlete en función de un gráfico de altura de dispersión directa frente a área de dispersión directa, como se informó recientemente36. La estrategia de compuerta que se muestra en la Figura 1 corresponde a un enfoque menos estricto, que incluye levadura singlete y algo de levadura doblete a través de la compuerta de dispersión.
  13. Registre la fluorescencia de todas las muestras de control utilizando un analizador de citometría de flujo. Las muestras de control se recogen primero de forma rutinaria para ayudar a definir una estrategia de compuertas, como se describe a continuación en el paso 4.14.
  14. Defina una estrategia de compuerta para su parcela creada en el paso 4.10 antes de analizar las muestras tratadas. La figura 1 ilustra una representación descriptiva de la estrategia de compuerta que se va a aplicar.
  15. Registre la fluorescencia de las muestras desfosforiladas utilizando el citómetro de flujo y la estrategia de compuerta definida en los pasos 4.12 y 4.14.
  16. Analice los datos de citometría de flujo adquiridos mediante un software de análisis de citometría de flujo.
  17. Evalúe la desfosforilación midiendo y comparando la mediana del eje Y de las células que expresan proteínas en su superficie y la fosforilación de referencia proporcionada por las células que no se muestran entre las muestras y los controles. Calcule la diferencia porcentual de fosforilación mediana de la siguiente manera:
    figure-protocol-2

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El análisis de citometría de flujo a partir de una réplica individual de nuestro sistema modelo incubado durante 2 h sin (Figura 1A) y con (Figura 1B) 1.000 nM SHP-2 revela una diferencia de fosforilación mediana del 63,6%, que se define como la relación entre la mediana del eje Y (fosforilación) de todos los eventos mostrados en la superficie menos la señal de fosforilación de referencia definida como la mediana del eje Y de los eventos no mostrados entre la mu...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo presentado permite el análisis de las interacciones enzimáticas utilizando la visualización extracelular de proteínas en la superficie de la levadura. La incorporación del secuestro del retículo endoplásmico en el plásmido de visualización de superficie utilizado introduce la capacidad de analizar extracelularmente interacciones específicas entre enzimas y sustratos modificados postraduccionalmente debido a las interacciones intracelulares que se pueden diseñar para que ocur...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este trabajo que divulgar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de un premio NSF CAREER a L.A.S. (CBET - 2339172) y fondos de inicio de la Universidad del Sur de Florida.

En la Figura 2A, el icono de microtubo abierto translúcido de Servier https://smart.servier.com/ está licenciado bajo CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/. Las modificaciones incluyen la adición de un tampón y una célula de levadura (izquierda) y la adición de anticuerpos (centro-derecha).

El tubo de ensayo, la incubadora y el citómetro de flujo de la Figura 2A se proporcionaron a través de www.bioicons.com de acceso abierto.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Botellas de medios de 1 l Corning06-414-1D
1.7/2.0 mL MicrotubosAxygenMCT-175-C
10 µ L Puntas de pipeta SureOneFisher Scientific02-707-438
1000 µ L Puntas de pipeta SureOneFisher Scientific02-707-408
12 mL Tubos de poliestireno de fondo redondoGreiner07-000-212
Cubetas de 3 mL de platicMARCA759076D
300 µ L Puntas de pipeta SureOneFisher Scientific02-707-411
5 mL Pipetas serológicasFisher Scientific13-678-11D
Caseína ácida (Casaminoácidos)Balanza analítica Fisher ScientificBP-1424-500
 Mettler
Toledo CorningFalcon 351008
Cabinas de bioseguridadLabconcoLogic Clase II, Tipo A2 
EppendorfKinetic 6136000010
Bovine Serum AlbuminFisher biorreactivosBP1600-100
Ácido cítricoFisher ScientificA940-500
CytoFLEX Citometría de flujo Analizador Beckam CoulterCytoflex C09745Software CytExpert
DextrosaFisher ScientificD16-1
DitiotreitolFisher biorreactivosBP172-5
Burro anticabra FITCInvitrogenA16000
EDTAAlfa AesarH56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-BiotinaThermo ScientificA39259
Kit de transformación de levadura Frozen-EZ IIZymo ResearchT2001
GalactosaFisher ScientificBP656-500
Refrigerador de Propósito GeneralMarvel ScientificMS24RAS4RW
Cabra anti-myc tag anticuerpo Centrífuga de Mictrotubo BethylA190-104A
Eppendorf5425 R 5406000313
Mini Incubadora Refrigerada de Baja TemperaturaFisher Scientific15-015-2632
Anticuerpo antifosfotirosina de ratón 4G10BioXcellBE0194
Parafilm MBemisM PM999
Solución salina tamponada con fosfatoControlador de pipetasFisher bioreagents BP399-500
Eppendorfeasypet 3 4430000018
RaffinosaThermo ScientificJ21060-36
Proteína SHP-2 humana recombinante activaR& CentrífugaD Systems 1894-SH
Eppendorf5910 R
Saccharomyces cerevisiae levadura muestra la superficie de la cepa EBY 100ATCCMYA-4941
Incubadora de agitadoresEppendorfM1335-0002 New Brunswick Innova 42 
Juego de pipetas de un solo canal Eppendorf05-403-151
Cloruro de sodioFisher ScientificS671-500
Citrato de sodio dihidratadoFisher ScientificS279-500
Fosfato de sodio dibásico heptahidratadoFisher ScientificS373-500
Fosfato de sodio monobásico monohidratoFisher ScientificS468-500
Streptavidin Alexa Fluor 647InvitrogenS32357
Balanza de carga superiorMettler Toledo
Tris hydrochlorideEMD Millipore648317-100GM
Tubo de rotación de revólverFisher Scientific11-676-341
Papel de pesaje Fisher Scientific09-898-12B
Base de nitrógeno de levaduraBD Difco291940
Zeba Spin Columnas de desalinización Thermo Scientific89883
Placa de Petri bacteriológica 30243397 Bioespectrómetro 302310102 refrigerada

Referencias

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