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Artículo de método

Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens en Solanum nigrum

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DOI:

10.3791/68212

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24 de junio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

En este artículo

Resumen

En este artículo se presenta un protocolo detallado del método de transformación genética mediado por Agrobacterium tumefaciens para producir el transgénico Solanum nigrum.

Resumen

Solanum nigrumes un pariente solanáceo huérfano de la patata y el tomate, y su fruto fresco es una baya nutritiva y deliciosa. Toda la planta de S. nigrum se puede utilizar como medicina. Sin embargo, el S. nigrum silvestre alberga algunos rasgos indeseables. Afortunadamente, las técnicas de ingeniería genética, especialmente las tecnologías de edición de genes como CRISPR/Cas9, ofrecen valiosas oportunidades para mejorar rápidamente S. nigrum al abordar estas deficiencias. En la mayoría de las plantas, el mejoramiento de plantas a través de la tecnología de edición de genes se logra a través de la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens. En este artículo hemos detallado los protocolos de transformación genética mediados por A. tumefaciens en S. nigrum. Los cotiledones e hipocótilos de las plántulas de S. nigrum se utilizaron como explantes para la transformación genética. Debido a que S. nigrum es resistente a la kanamicina, se utilizó el gen DsRed como marcador visual para identificar plantas transgénicas. La transformación genética de S. nigrum puede completarse de manera eficiente de acuerdo con estos protocolos de operación. La detección de plantas transgénicas T1 se puede identificar directamente por si emiten fluorescencia roja, sin necesidad de identificación por PCR.

Introducción

Solanum nigrum (conocida como solanácea negra, 2n = 6x = 72) es un pariente solanáceo de la patata y el tomate1. El fruto es una baya esférica que se vuelve negra después de la maduración. La fruta fresca es una baya nutritiva y deliciosa. Toda la planta de S. nigrum se puede usar como medicina, con los efectos de dispersar la estasis sanguínea, reducir la hinchazón, eliminar el calor y desintoxicar. S. nigrum sintetiza dos clases distintas de metabolitos especializados a partir de un precursor común del colesterol: saponinas esteroideas en sus hojas y glicoalcaloides esteroideos (SGA) en sus bayas. El uttrósido B, una saponina esteroide derivada de S. nigrum, ha sido aprobado recientemente por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos como medicamento huérfano para el tratamiento del carcinoma hepatocelular2. La eliminación del gen GAME15 en S. nigrum dio lugar a plantas que carecían tanto de saponinas como de alcaloides esteroideos, y también reveló que las saponinas esteroidales controlan plagas graves de insectos agrícolas2. Los polifenoles de S. nigrum reducen el peso y la grasa corporal al afectar a los adipocitos y al metabolismo de los lípidos3. S. nigrum puede enriquecer cadmio y se utiliza como planta modelo para estudiar el enriquecimiento de cadmio 4,5. S. nigrum es una planta no domesticada y su base de investigación es relativamente débil. Es inspirador que la investigación sobre S. nigrum haya aumentado gradualmente en los últimos años. El genoma del hexaploide S. nigrum ha sido ensamblado recientemente, y S. nigrum podría haber evolucionado a partir de su diploide Solanum americanum (2n = 2x = 24)6,7. Por lo tanto, S. nigrum es una planta que posee valor medicinal y comestible. La investigación sobre S. nigrum no solo contribuye a una comprensión más profunda de sus posibles aplicaciones en el tratamiento de enfermedades humanas, sino que también proporciona información valiosa sobre la mejora de la producción agrícola. Por lo tanto, el establecimiento de un sistema de transformación genética en S. nigrum es la base para el mejoramiento genético a través de la tecnología transgénica y de edición de genes.

Existen varios reportes que se centran en la transformación genética de S. nigrum mediada por Agrobacterium tumefaciens 8,9,10,1 1. En nuestro trabajo previo, establecimos un sistema de transformación genética mediada por A. tumefaciens LBA4404 para S. nigrum, y transformamos AcMYB110 en S. nigrum, obteniendo nuevos germoplasmas de S. nigrum con mayor contenido de antocianinas1. Se obtuvieron plantas de S. nigrum transgénicas y editadas genéticamente con transformación genética mediada por EHA105 de A. tumefaciens 10. Diferentes proteínas fluorescentes tienen emisiones de fluorescencia verde, roja, amarilla, naranja y azul y son ampliamente utilizadas para indicar actividades de vida celular12. En el proceso de transformación genética de las plantas, los genes fluorescentes rojos se utilizan a menudo como genes indicadores para distinguir los eventos modificados genéticamente de los eventos no modificados genéticamente13. El uso del gen DsRed como gen reportero permite una discriminación conveniente de eventos transgénicos, mientras que el uso del factor de transcripción R2R3-MYB como gen reportero puede estar influenciado por el genotipo de las plantas14. En la progenie transgénica, las plantas transgénicas también pueden distinguirse fácilmente de las plantas no transgénicas utilizando instrumentos ópticos (por ejemplo, microscopios de fluorescencia o sistemas de imagen), lo que elimina la necesidad de una identificación basada en PCR. Al integrar el gen reportero de la proteína fluorescente con la tecnología de edición genética CRISPR, los genes de fertilidad en el maíz se eliminaron con precisión, lo que resultó en la creación de una línea nuclear estéril y una línea de mantenedor nuclear estéril controlada15. La autopolinización y fructificación de las plantas mantenedoras producirá descendencia 1:1 de líneas mantenedoras y estériles. Sobre la base de diferentes características luminiscentes, se puede lograr una clasificación no destructiva de semillas de mantenedor y de línea estéril mediante reconocimiento visual o automático15. Por lo tanto, el empleo del gen de la proteína fluorescente como gen indicador simplifica la identificación de semillas o plantas transgénicas sin necesidad de análisis de PCR. Esto representa una ventaja significativa en el campo de la transformación genética. Este método tiene como objetivo describir el protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens en S. nigrum, utilizando el gen rojo fluorescente, DsRed, como gen reportero.

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Protocolo

1. Cultivo aséptico de plántulas

NOTA: Los siguientes pasos se realizan en un banco súper limpio.

  1. Recolecta semillas silvestres de S. nigrum en la ciudad de Liaocheng, China, y nómbralas Snlc1. Tome 50 semillas silvestres de S. nigrum y colóquelas en un tubo de centrífuga de 2 ml. Después de remojar en 1 ml de giberelina al 5% durante 30 minutos, deseche la solución de giberelina.
  2. Agregue 1 ml de etanol al 75%, agite durante 1 minuto y luego deseche el etanol.
  3. Añadir 1 mL de solución de hipoclorito de sodio al 2% y desinfectar la superficie de las semillas durante 10 min. Agite bien el tubo de centrífuga para esterilizar la superficie de la semilla. Después de 10 minutos, deseche el hipoclorito de sodio.
  4. Lave las semillas 5 veces con agua esterilizada para eliminar el hipoclorito de sodio residual. Coloque las semillas en placas de Petri con un diámetro de 90 mm que contengan 1/2 MS de medio sólido. Cultive las placas en una cámara de crecimiento vegetal bajo un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad a 25 °C (Figura 1A).

2. Cultivo de A. tumefaciens LBA4404

  1. Transformar el vector binario pRed130516 albergado con un gen fluorescente rojo, DsRed2, en A. tumefaciens LBA4404 por electroporación con MicroPulser con parámetros: Voltaje 1800 V, Capacitancia 25 μF, Resistencia 200 Ω, Cubeta 1 mm. Cultivar las bacterias en medio sólido LB con 50 mg/L de kanamicina y 50 mg/L de rifampicina a 28 °C durante 48 h.
  2. Recoger un clon de LBA4404 que albergue pRed1305 y cultivarlo en 1 mL de medio LB líquido con 50 mg/L de kanamicina y 50 mg/L de rifampicina en un tubo de centrífuga de 15 mL en un concentrador de mesa a 180 rpm a 28 °C durante 12 h.
  3. Añadir 50 mL de LB líquido con el mismo antibiótico a 1 mL de solución bacteriana y luego cultivar en un concentrador de mesa a 200 rpm a 28 °C durante 6 h.
  4. Detener el cultivo cuando el diámetro exterior600 del medio de cultivo bacteriano sea 0,4 y, a continuación, centrifugar la solución bacteriana a 2200 x g durante 10 min a 25 °C.
  5. Vuelva a suspender las bacterias centrifugadas con solución infectada (IS: M519 4,43 g/L, sacarosa 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5,8) y ajuste la concentración de la solución bacteriana a OD600= 0,6 con un espectrofotómetro.

3. Explante de infección con A. tumefaciens

NOTA: Los siguientes pasos se realizan en un banco súper limpio.

  1. Cultive las semillas durante 7 días hasta que los cotiledones de las plántulas se hayan desplegado (Figura 1B). Corte los dos cotiledones y el hipocótilo con una longitud de aproximadamente 1 cm de las plántulas con un bisturí afilado y esterilizado en una placa de cultivo con papel de filtro humedecido con IS bacteriano y deseche las raíces primarias. Ten cuidado al usar un bisturí.
  2. Infundir los explantes en la solución infectada durante 30 min. Coloque los explantes en papel de filtro seco para permitir que se absorba la solución bacteriana en la superficie del explante.
  3. Colocar los explantes en medio sólido IS (Agar 0.7%; Figura 1C). Colocar los explantes en una cámara de crecimiento de plantas sin luz a 19 °C y cultivar durante 3 días.

4. Diferenciación de explantes

NOTA: Los siguientes pasos se realizan en un banco súper limpio.

  1. Recoja los explantes de la cámara de crecimiento de la planta a 19 °C. Lave los explantes con agua esterilizada 5 veces y colóquelos sobre papel de filtro seco y esterilizado.
  2. Colocar los explantes en medio de diferenciación de brotes (SD) (SD: M519 4.43 g/L, sacarosa 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0.5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0.7 g/L Agar, pH 5.8), y cultivar a 25 °C durante 4 semanas (Figura 1D,E).
  3. Cortar los callos/yemas de los explantes que muestren fluorescencia roja bajo la luz de excitación verde de una lámpara fluorescente de mano con un bisturí, y luego transfiéralos a un nuevo medio SD, y continuar cultivando durante 4 semanas a 25 °C (Figura 1F, G).

5. Enraizamiento y trasplante

  1. Cortar los cogollos con fluorescencia roja con una lámpara fluorescente de mano, transferirlos al medio de enraizamiento (RM: M519 4,43 g/L, sacarosa 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8), y cultivarlos durante 2-4 semanas a 25 °C para promover la producción de raíces.
  2. Trasplante las plántulas que muestran fluorescencia roja con una longitud de raíz de más de 2 cm al suelo (Figura 1H-K). Antes del trasplante, retire el agar de las raíces con la mano para evitar el crecimiento excesivo de bacterias en las raíces.

6. Pruebas de plantas T0 modificadas genéticamente con amplificación por PCR

  1. Extraer el ADN genómico de una línea transgénica independiente utilizando el método de bromuro de cetilo trimetil amonio (CTAB)17.
  2. Amplifique el gen DsRed con un conjunto de cebadores, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') y RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') utilizando 10 ng de ADN genómico como molde en un volumen de reacción de 15 μL que contiene 7,5 μL de 2x PCR Master Mix y 0,3 μL de cada cebador (10 μmol/L). El fragmento de ADN esperado era de 393 pb. Someter los productos de PCR a electroforesis en gel de agarosa al 1% para determinar si son plantas transgénicas.

7. Identificación de plantas transgénicas de la generación T1 con una lámpara fluorescente

  1. Coseche la fruta de las plantas transgénicas T0 de S. nigrum que se hayan vuelto completamente de color negro-púrpura y luego exprima las semillas dentro de la fruta con la mano. Seque naturalmente las semillas al aire libre a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 semana.
  2. Cultive las semillas secas en medio 1/2 MS de acuerdo con los pasos 1.1 a 1.4 de este protocolo y colóquelas en una cámara de crecimiento de plantas durante 1 semana. Distinga las plántulas transgénicas y las plántulas no transgénicas con una lámpara fluorescente de mano.

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Resultados

Transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens para producir S. nigrum transgénico.
Después de infectar los cotiledones e hipocótilos de las plántulas de S. nigrum con A. tumefaciens, pudimos determinar si la infección por Agrobacterium fue exitosa ya que se utilizó DsRed como gen reportero. Apareció fluorescencia roja en el sitio de ...

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Discusión

Hasta el momento, se han establecido métodos de transformación genética para S. nigrum mediada por A. tumefaciens en diferentes laboratorios 8,9,10,11. La mayoría de estos métodos de transformación utilizan kanamicina como sustancia de selección 8,9,10,11.<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación de la Universidad de Liaocheng (318012028) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2020MC034).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2X SanTaq PCR Master Mix (con tinte azul)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B532061La mezcla de PCR 2X SanTaq incluye MgCl?, dNTP, ADN polimerasa Taq, tampón de PCR, colorante de carga y potenciador de PCR.
6-BASangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.C14819266Citoquininas artificiales
AgarTianjin Damao Chemical Reagent Partnership Enterprise (Sociedad limitada)CAS NO:9002-18-0Solids
ASSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K914BA0002Inducir la expresión eficiente de Agrobacterium
CarbSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Antibiótico
CefSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I526BA0010Antibiótico
giberelinaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.K514BA0009Promueve la germinación de semillas
kanamicinaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.I614BA0013medio antibiótico
LBSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113Cultive las bacterias
MicroPulser ( Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, US617BR1 06783Gene Pulser Xcell
MS medio sólidophytotech Co., Ltd., USHCA0519228A  Murashige & Medio basal Skoog con vitaminas, caja de plástico M519
LiaoSu, ChinaT909HCaja de plantación de plantas
rifampicinaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.S180305Antibiótico
sacarosaSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Nº CAS:57-50-1     Como fuente de carbono
Tanon-5200Multi máquinaTanon Co., Ltd., China5200MultiSeparación
acelerada silvestre Solanum nigrumrecolectado en la ciudad de Liaocheng
ZTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.J921BA0014Reguladores del crecimiento de las plantas

Referencias

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