Artículo de método

Preparación de tejido intacto para el análisis microscópico de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis en desarrollo y maduras

DOI:

10.3791/68217

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16 de mayo de 2025

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1Department of Life Sciences, School of Agriculture, Meiji University, 2Organization for the Strategic Coordination of Research and Intellectual Properties, Meiji University, 3Plant Functional Biotechnology, Agro-Biotechnology Research Center, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la preparación de muestras intactas de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis thaliana . El método solo requiere equipo de laboratorio común, como una aguja de inyección y pinzas de precisión, y permite obtener imágenes fluorescentes de células vivas de alta resolución de células endospermas tanto en semillas en desarrollo como maduras.

Resumen

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En las semillas de Arabidopsis , el endospermo, una sola capa de células vivas ubicada entre el embrión y la testa, desempeña un papel fundamental en la regulación de la maduración, latencia y germinación de las semillas. El análisis microscópico de las células del endospermo intactas es esencial para comprender las funciones fisiológicas del endospermo a nivel celular y molecular. Sin embargo, la preparación de la muestra ha sido un desafío debido al pequeño tamaño de las semillas de Arabidopsis y la ubicación de la capa de células endospermas debajo de la testa. Este artículo detalla la preparación de muestras de capas de endospermo intactas adecuadas para la observación y el análisis microscópico tanto en semillas en desarrollo como maduras. Este método permite la observación de grandes áreas y numerosas células endospermas intactas sin necesidad de fijación o seccionamiento. Además, el protocolo utiliza solo equipos de laboratorio estándar, como agujas de inyección, pinzas de precisión y microscopios estereoscópicos. Este enfoque permite con éxito la obtención de imágenes de células vivas de alta resolución de señales fluorescentes, como la proteína fluorescente verde (GFP), en células de endospermo intactas. Este método permite observar la localización intracelular y el movimiento de diversas proteínas, así como la morfología de los orgánulos, en las células del endospermo de diferentes mutantes de Arabidopsis . Este protocolo contribuye a la elucidación de nuevas funciones del endospermo y amplía el potencial para estudios celulares y moleculares de este tejido esencial.

Introducción

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Debido a que las plantas son organismos sésiles, la germinación de las semillas es un evento crucial que determina su destino. La decisión de germinar está estrictamente regulada por factores internos y ambientales, como los niveles de latencia de las semillas primarias, la temperatura, la intensidad y la longitud de onda de la luz, y la concentración de nitrógeno 1,2,3,4,5,6. Las semillas tienen estructuras complejas que consisten en múltiples tipos de tejidos7. En las semillas secas de Arabidopsis, el embrión, que se convierte en una plántula, está rodeado por una sola capa de endospermo y las capas más externas, la testa. La testa está compuesta por múltiples capas de células muertas, mientras que el embrión y el endospermo permanecen vivos incluso en semillas secas. El endospermo es comúnmente considerado como un tejido de almacenamiento que proporciona nutrientes para el crecimiento embrionario y, junto con la testa, confiere resistencia mecánica a la protrusión de la radícula 8,9,10,11,12,13.

Varios estudios recientes han demostrado que el endospermo desempeña un papel esencial en la regulación de la germinación óptima de las semillas 14,15,16,17. Por ejemplo, el fotorreceptor fitocromo B (PHYB) en las células del endospermo detecta la luz roja (R) o roja lejana (FR), regulando las respuestas de germinación15. El endospermo también funciona como un tejido sensible a la temperatura, suprimiendo las respuestas de germinación a altastemperaturas. El control de calidad del endospermo es fundamental para la germinación óptima de las semillas, especialmente en las semillas almacenadas a largo plazo17.

Ahora es necesario obtener imágenes de células vivas para dilucidar aún más las funciones fisiológicas del endospermo. El análisis microscópico de células endospermas intactas que expresan proteínas marcadas con fluorescencia permite investigar los mecanismos moleculares por los cuales el endospermo regula la germinación de las semillas. Sin embargo, la preparación de células de endospermo intactas para la observación microscópica es un desafío, particularmente en semillas de Arabidopsis . Las semillas tienen aproximadamente 0,4 mm de diámetro y el endospermo es una capa unicelular ubicada entre el embrión y la testa, lo que dificulta la manipulación precisa. En consecuencia, a pesar de sus importantes funciones fisiológicas, el endospermo rara vez se ha observado utilizando imágenes de células vivas.

Este artículo presenta un protocolo para la preparación rápida de muestras de capas de células endospermas intactas adecuadas para la obtención de imágenes de células vivas tanto en semillas en desarrollo como maduras.

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Protocolo

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En este estudio, se establecieron dos procedimientos diferentes para la preparación de muestras de capas de células endospermas vivas: uno para semillas en desarrollo y otro para semillas maduras. Se requieren enfoques ligeramente diferentes dependiendo de la solidez de la testa. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de muestras de endospermo intactas a partir de semillas en desarrollo

  1. Colección de silicuas
    1. Cultive plantas de Arabidopsis en tierra o lana de roca hasta que florezcan.
    2. Marque las flores completamente abiertas con hilos de colores (0 días después de la floración, 0 DAF).
      NOTA: Evite usar hilos verdes, amarillos o marrones para marcar las flores, ya que estos colores son difíciles de distinguir de las plantas en crecimiento o maduras y las silicuas.
    3. Corte las sílicas en desarrollo marcadas en el pedicelo (indicadas en la Figura 1 (1)) y recójalas en tubos de 1,5 mL.
      NOTA: Las siliquitas en desarrollo de 12-16 DAF son adecuadas para la preparación utilizando este protocolo.
  2. Disección de semillas en desarrollo
    NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en papel de filtro húmedo para proteger las muestras de la desecación. Las manipulaciones deben realizarse bajo un microscopio estereoscópico.
    1. Separe una válvula (indicada en la Figura 1 (2)) del replum (indicado en la Figura 1 (1)) usando dos pinzas: una con puntas gruesas para sujetar y la otra con puntas afiladas para desgarrar).
    2. Recoja suavemente las semillas en desarrollo de las sílicas con pinzas con las puntas cerradas para evitar dañar las semillas (Figura 1 (2)).
    3. Sosteniendo la semilla con pinzas sin chocar la semilla, haga una cicatriz de aproximadamente 0,2 mm de tamaño en la testa y el endospermo que rodea el embrión con una aguja de inyección (27 G, 0,40 mm × 19 mm) (Figura 1 (3)).
      NOTA: La ubicación óptima para hacer la cicatriz es en la unión de los cotiledones y la radícula.
    4. Empuje el embrión pellizcando la semilla con pinzas (Figura 1 (4)). No triture la envoltura vacía de la semilla, que consta de la testa y el endospermo, y trate de mantener su forma redonda.
    5. Inserte la aguja de inyección en el sobre de semilla vacío en la cicatriz, perforándola de adentro hacia afuera (Figura 1 (5)).
    6. Mantenga la aguja en posición, rasque la superficie de la testa con pinzas con las puntas cerradas y corte un lado de la envoltura de semilla vacía para permitir que se abra (Figura 1 (6)).
    7. Abra el sobre de semilla vacío en una hoja con pinzas con puntas afiladas (Figura 1 (7)). La muestra ahora debe aislarse como una lámina bicapa que consta de las capas de endospermo y testa (Figura 1 (8)).
      NOTA: Si la muestra tiende a enrollarse cuando se usa agua como medio de montaje en el paso 3 a continuación, divida la muestra en forma de hoja en dos partes. Las semillas cosechadas a partir de silicuas a unos 18 DAF (en esta etapa, la testa es marrón pero aún no completamente seca) también se pueden procesar utilizando este protocolo, aunque las semillas deben beberse durante varios minutos antes de la preparación.

2. Preparación de muestras de endospermo intactas a partir de semillas maduras

  1. Imbibición de semillas maduras
    1. Añadir 1 mL de agua bidestilada a un tubo de 1,5 mL que contenga semillas secas de Arabidopsis .
    2. Mantenga las semillas sumergidas durante al menos 40 minutos a temperatura ambiente (Figura 2 (1)).
      NOTA: Las semillas secas y las semillas dentro de los 40 minutos posteriores a la imbibición son difíciles de cicatrizar en la testa y el endospermo y de extraer el embrión del interior de la semilla sin dañar la envoltura vacía de la semilla en los pasos 2.2.1 y 2.2.2, mientras que un tiempo de imbibición más largo facilita la manipulación.
    3. Utilice una micropipeta de 1000 μL para transferir las semillas absorbidas a papel de filtro húmedo.
  2. Disección de semillas maduras
    NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en papel de filtro húmedo para proteger las muestras de la desecación. Las manipulaciones deben realizarse bajo un microscopio estereoscópico.
    1. Sosteniendo la semilla con pinzas sin estrellar la semilla, haga una cicatriz de aproximadamente 0,2 mm de tamaño en la testa y el endospermo que rodea el embrión con una aguja de inyección (Figura 2 (2)).
    2. Empuje el embrión pellizcando la semilla con pinzas (Figura 2 (3)). No triture la envoltura vacía de la semilla, que incluye la testa y el endospermo. Trata de mantener su forma redonda.
    3. Corte los lados superior e inferior del sobre de semilla vacío con una aguja de inyección para darle forma de cilindro (Figura 2 (4)).
    4. Corte el sobre de semilla vacío de forma cilíndrica a lo largo de su eje central para separarlo en dos piezas (Figura 2 (5)). Las muestras deben aislarse en láminas bicapa formadas por la capa de endospermo y la capa de testa (Figura 2 (6)).

3. Observación microscópica

  1. Coloque las muestras de endospermo en forma de lámina en un portaobjetos de vidrio y móntelas en agua o perfluorodecalina (PFD).
    NOTA: Si quedan burbujas de aire entre la muestra y el cubreobjetos, sería útil la perfluorodecalina (PFD), que se ha reportado que es particularmente útil para obtener imágenes de muestras que contienen bolsas de aire, como las hojas18,19. Se sabe que PFD tiene la tensión superficial más baja, lo que le permite llenar fácilmente los espacios de aire en la superficie de la muestra. Sin embargo, para las imágenes de lapso de tiempo, se recomienda el uso de agua como medio de montaje, ya que el contenido de agua en las semillas maduras debe ser abundante para mantener la liquidez celular.
  2. Coloque un cubreobjetos suavemente sobre la muestra. Asegúrese de que la capa del endospermo esté orientada hacia el cubreobjetos.
    NOTA: Se puede usar esmalte de uñas o grasa para sellar los bordes del cubreobjetos para evitar la desecación de la muestra y el medio de montaje.

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Resultados

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Utilizando el protocolo que se muestra en la Figura 1, se prepararon muestras de endospermo a partir de semillas en desarrollo cosechadas de sílicas a 14 DAF (en esta etapa, la testa aún está verde). Se observaron numerosas células endospermas en una gran área y sus estructuras intracelulares (Figura 3A). En este experimento, se utilizaron semillas que expresan PHYB fusionadas con GFP en el extremo C-terminal (PHYB-GFP). Es bien sabido que PHYB se transloca al n...

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Discusión

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El papel del endospermo en la germinación de las semillas se ha revelado a través de análisis genéticos y bioquímicos utilizando tejidos de semillas separados, como el análisis de expresión génica y la cuantificación de lípidos y fitohormonas 9,14,25,26,27. Un ensayo in vitro de lecho de la cubierta de la semilla, com...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Agradecemos a los Dres. Matsushita y Oka de la Universidad de Kyoto por proporcionar el mutante phyB que expresa PHYB-GFP impulsado por el promotor 35S. Este estudio fue financiado en parte por una Beca de Ayuda a la Investigación Científica en Áreas Innovadoras, Investigación en un Área de Investigación Propuesta (19H05713 a K.Y.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mlCubreobjetos Watoson Bio Lab131-815C
(18 x 18 mm)Matsunami Glass Ind.,Ltd.
Agua DDWpara montar
Papel de filtro No.526 (400 x 400 mm)ADVANTEC VIETNAM CO., LTD.02453400 
Genki-kun Seru Senyo yodo kopu N-150 (55 L)Katakura & Co-op Agri CorporationSuelos para el crecimiento de las plantas
Portaobjetos de vidrio (26mm x 76 mm)Matsunami Glass Ind.,Ltd.S1215
Grodan AO 36 x 36 x 40 mm CubosGrodanLanas de Roca para el Crecimiento de las Plantas
Iris TijerasPremium Plus  Japón Co., Ltd.FC-0212
Pinzas de joyero, Dumont No. 5 (4 1/4 pulg.)DumontF6521Pinzas para desgarro
Leica Application Suite X (LAS X) Leicapara Sterallis 8
Leica Microsystems Aceite de inmersión para microscopiosAceite de inmersión de autofluorescencia muy bajaTHMOIL-10LF
Pinzas de precisión LIOR 110mm  SL-14KENIS Ltd.KN33450438Pinzas para sujeción 
NAIL HOLICKOSEEsmalte de uñas
Needls 27G 3/4 (19 mm) RB Industria médica de Misawa Co., Ltd.Una aguja de inflexión para cortar
Nichipet Air 1000 uLNichiryo00-NAR-1000A 1000 µ L Micropipeta
PerfluorodecalinaAPOLLO SCIENTIFICPC5960Reactivos para montaje
Panel LED de luz roja/luz roja lejanaTOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.
Schappe Spun # 60Fujix Co., Ltd.Lubricante Thread
SPINKOTE 2 ozBECKMAN COULTER306812Grasa
Sterallis 8LeicaConfocal Laser Scanning Microscopy
Stereomicroscope Stemi 305 cam WCarl Zeiss NTS Ltd.491903-0017-000
Luz blanca LEDPANASONICFL40SSW/37
C218181Software 10147599

Referencias

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