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Artículo de método

Transducción generalizada de neuronas neocorticales de ratón mediante inyección subaracnoidea de AAV2

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DOI:

10.3791/68235

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23 de mayo de 2025

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1Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, 2Faculty of Biology and Biotechnology, National Research University High School of Economics

En este artículo

Resumen

Se describe una nueva técnica para la administración generalizada de virus adenoasociados que utiliza la infusión de virus subaracnoideos. Este método no solo asegura la transducción generalizada de las neuronas neocorticales de ratón en las capas superficiales, sino que también da lugar a la expresión selectiva del transgén en las neuronas piramidales de la capa cinco, incluso cuando se utiliza un promotor no selectivo.

Resumen

Los virus adenoasociados recombinantes son una herramienta flexible y potente para la administración y expresión de varios genes de interés en muchas áreas de la biología experimental, particularmente en neurociencia. El método más popular para impulsar la expresión de un transgén deseado en un área particular del cerebro es inyectar un vector AAV directamente en el parénquima cerebral. Sin embargo, este método no permite la transducción neuronal generalizada que se requiere para algunos experimentos in vivo . En este artículo, presentamos una nueva técnica para la expresión génica generalizada en el neocórtex de ratón basada en la infusión viral en el espacio subaracnoideo del cerebro. Este método de marcaje neuronal no solo garantiza la transducción generalizada de neuronas en las capas neocorticales superficiales de ratones adultos, sino que también da lugar a la expresión del transgén en una gran población de neuronas piramidales de la capa cinco con alta especificidad, incluso cuando se utiliza un promotor fuerte y no selectivo como el CAG. Además, debido a que la transducción celular tiene lugar a una distancia significativa del lugar de la inyección, este método puede ayudar a preservar el tejido cerebral para posteriores registros ópticos o electrofisiológicos de la actividad neuronal.

Introducción

El cerebro de los mamíferos está formado por muchas células inhibidoras, excitadoras y moduladoras interconectadas en circuitos por billones de sinapsis. Uno de los desafíos centrales de la neurociencia es decodificar el papel de los distintos tipos de células en la organización y función de los circuitos cerebrales y el comportamiento. La manipulación de células genéticamente definidas dentro del cerebro requiere métodos para introducir y expresar transgenes. Los sistemas de administración de genes basados en virus son, con mucho, el método más eficaz y sencillo para la entrega de genes en el sistema nervioso central2. Los sistemas de administración viral se basan en la replicación de virus (adenovirus, virus adenoasociados (AAV), lentivirus y retrovirus) que tienen la capacidad de entregar información genética a una célula huésped 2,3.

Los vectores basados en AAV se han convertido en una de las herramientas más utilizadas para la entrega de transgenes deseados a las células dentro del cerebro, tanto para fines de investigación neurocientífica básica como para desarrollar terapia génica para enfermedades neurológicas. Cuando se comparan con otros virus, los AAV con replicación defectuosa poseen muchas características que los convierten en vectores ideales para estos fines. En particular, los vectores AAV transducen de manera eficiente las células no divisorias (terminalmente diferenciadas), como las neuronas y las células gliales, lo que resulta en altos niveles de expresión de transgenes in vivo2. Los vectores se pueden producir fácilmente a un alto título funcional adecuado para uso in vivo 3,4,5. Es importante destacar que la entrega in vivo de genes mediados por virus adenoasociados no produce alteraciones histopatológicas ni toxicidad relacionada con vectores6. A diferencia de los vectores adenovirales, la administración in vivo de vectores AAV en modelos animales generalmente no provoca respuestas inmunes del huésped contra las células transducidas, lo que permite una expresión estable del transgén dentro del parénquima cerebral durante largos períodos de tiempo 2,7,8.

Otra razón de la popularidad de los vectores AAV es la amplia gama de serotipos de AAV con tropismos únicos de tejido y tipo celular 9,10,11,12,13,14. Las distintas proteínas de la cápside expresadas por diferentes serotipos de AAV dan lugar al uso de diferentes receptores de superficie celular para la entrada celular y, por lo tanto, a tropismos específicos10,14.

El tropismo de AAV está determinado no solo por las proteínas de la cápside, sino por muchos otros factores14. Se ha demostrado que los serotipos 1, 2, 6, 7, 8 y 9 de AAV transducieron tanto neuronas como astrocitos en cultivo primario15,16, pero exhibieron un fuerte tropismo neuronal después de la inyección cerebral intraparenquimatosa17,18. El método utilizado para la preparación del vector AAV también puede influir en el tropismo de las células nerviosas, incluso para el mismo serotipo. Por ejemplo, el AAV8 purificado con CsCl poseía un fuerte tropismo astroglial después de la inyección cerebral intraparenquimatosa, mientras que el AAV8 purificado con yodixanol, inyectado en condiciones idénticas, transducía solo neuronas19. El tropismo de AAV también puede verse afectado por la dosis inyectada y el volumen14. Por ejemplo, el título alto de rAAV2/1 transdució eficientemente tanto las neuronas excitadoras corticales como las inhibidoras, pero el uso de títulos más bajos expuso una fuerte preferencia por la transducción de las neuronas inhibidoras corticales20.

Por lo tanto, no es posible lograr una especificidad robusta del tipo de célula basándose únicamente en el serotipo de la cápside. Los promotores específicos del tipo de célula se pueden utilizar para superar el amplio tropismo natural de la cápside del AAV. Por ejemplo, la sinapsina I humana se utiliza para dirigirse a las neuronas21, el promotor CaMKII puede impulsar la expresión transgénica en las neuronas excitadoras glutamatérgicas con alta especificidad20, el promotor ppHcrt se dirige a las neuronas que expresan hipocretina (HCRT) en el hipotálamo lateral22, el promotor PRSx8 se dirige a las neuronas noradrenenérgicas y adrenérgicas que expresan dopamina beta-hidroxilasa23, y el promotor GFAP puede impulsar la expresión específica de astrocitos24. Sin embargo, algunos promotores específicos de células tienen una actividad transcripcional débil y no pueden impulsar niveles suficientes de expresión transgénica25. Además, los promotores cortos que caben en los vectores virales AAV a menudo no conservan la especificidad del tipo celular 1,26. Por ejemplo, se ha demostrado que un constructo de CaMKII también transducía neuronas inhibidoras12.

Además de la especificidad del tipo de célula (tropismo), otra característica importante de los AAV es la eficiencia de la transducción. Los distintos serotipos de AAV tienen diferentes propiedades de difusión. AAV2 y cuatro vectores virales se difunden menos fácilmente a través del parénquima cerebral y, por lo tanto, median la transducción en un área más pequeña17,27. La transducción neuronal más extendida se observa con los serotipos 1, 9 y rh.10 11,17,18,19,28.

El método más popular para impulsar la expresión de un transgén deseado en un área particular del cerebro es inyectar el vector AAV directamente en la región cerebral de interés (parénquima)3. Después de la inyección intraparenquimatosa, incluso los serotipos de AAV con una difusión más efectiva a través del cerebro transducen típicamente solo un área local alrededor del sitio de inyección 12. Además, la inyección intraparenquimatosa es un procedimiento invasivo y provoca daño tisular adyacente a la región de interés. Por lo tanto, este método de inyección de virus no es adecuado para algunas tareas experimentales. Por ejemplo, el marcaje extensivo de las células es muy deseable en experimentos destinados a estudiar las funciones de las neuronas corticales en animales que se mueven libremente, incluso con el uso de microscopía de uno o dos fotones 29,30,31,32.

Aquí, describimos una nueva técnica de inyección de virus adenoasociados que utiliza la infusión de virus subaracnoideo para proporcionar una transducción generalizada de neuronas neocorticales en ratones adultos y preservar el tejido cerebral para registros ópticos o electrofisiológicos posteriores de la actividad neuronal. Este método no solo garantizó la transducción generalizada de neuronas en las capas neocorticales superficiales, sino que dio lugar a la expresión del transgén en una gran población de neuronas piramidales de la capa cinco con alta especificidad, incluso cuando se utilizó un promotor fuerte y no selectivo como el CAG.

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Protocolo

Los experimentos se realizaron en ratones adultos C57Black/6, de 2 a 4 meses de edad, de ambos sexos (Centro de Cría de Pushchino, Sucursal del Instituto de Química Bioorgánica Shemyakin-Ovchinnikov de la RAS). Los ratones se alojaron en un vivero a temperatura controlada (22 °C ± 2 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 h, luces encendidas a las 08.00 h) con comida y agua ad libitum. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices ARRIVE y la Directiva 2010/63/UE para experimentos con animales. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la IHNA RAS (protocolo N1 del 01.02.2022). Se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento de los animales y garantizar la fiabilidad de los resultados.

1. Preparación para la cirugía

  1. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos antes del inicio de la cirugía. Limpie el área quirúrgica con etanol al 70%.
  2. Verifique el nivel de isoflurano en el sistema de anestesia y llénelo si es necesario. Coloque una toalla de papel limpia en el fondo de la cámara de inducción.
  3. Coloque una almohadilla térmica en el marco estereotáxico. Cubra la almohadilla con una toalla de papel limpia.
  4. Prepare un frasco con lejía al 2% para recoger puntas de micropipetas, tubos, bastoncillos de algodón y otros artículos que entren en contacto con el virus.
  5. Retire una alícuota de AAV del congelador a -80 °C y colóquela sobre hielo para descongelar.

2. Preparación de la jeringa

  1. Limpie una microjeringa Hamilton de 5 μL con una aguja RN roma de 33 G. Aspire y luego dispense etanol al 70%. Repita 3 veces con etanol fresco. Enjuague la jeringa con agua destilada para eliminar el exceso de etanol. Repita 3 veces.
  2. Saque el émbolo y llene el barril con aceite de vaselina a través de la brida con una jeringa de insulina. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la microjeringa.
    NOTA: El aire atrapado es compresible y afecta la exactitud y precisión de la jeringa.
  3. Vuelva a colocar el émbolo en la microjeringa y dispense una gota de aceite. Coloque la jeringa en el inyector estereotáxico de modo que la escala sea visible para controlar el volumen de solución dispensada.

3. Preparación de ratones para cirugía

  1. Pesa un ratón. Coloque el ratón en la cámara de inducción de anestesia conectada al isoflurano. Encienda el vaporizador de isoflurano al 5% y ajuste el caudal a 250 mL/min. Una profundidad adecuada de la anestesia se logra en 5 a 7 min.
  2. Para verificar el nivel quirúrgico de anestesia, verifique la ausencia de reflejos de batido y retirada durante un pellizco doloroso de la pata trasera, y la ausencia de parpadeo al contacto visual.
  3. Cambie la válvula de salida del vaporizador de la cámara de inducción a la máscara estereotáxica. Reduzca el isoflurano a 1,8%-2,0% y ajuste el caudal de acuerdo con el peso del ratón (70-90 mL/min para ratones que pesan entre 25 y 35 g).
  4. Retire el ratón de la cámara de inducción y colóquelo en el aparato estereotáctico encima de una almohadilla térmica (37 °C) para evitar la hipotermia durante la anestesia quirúrgica. Coloque los dientes frontales en la barra de dientes y luego monte la máscara del animal.
  5. Coloque con cuidado al animal en las barras de las orejas. La posición correcta de la cabeza en el aparato estereotáxico permite el movimiento vertical pero no lateral de la cabeza. Asegúrese de que la posición del animal no cause angustia. Controle cuidadosamente la profundidad de la anestesia, la respiración de los animales y la temperatura corporal durante toda la operación.
  6. Afeita la cabeza desde los ojos hasta detrás de las orejas. Limpie la superficie afeitada de la cabeza con un hisopo con etanol al 70%, seguido de un hisopo con una solución de alcohol al 5% de yodo.
  7. Aplicar gel oftálmico para evitar la sequedad de los ojos. Aplique solución de lidocaína al 4% por vía tópica y dexametasona (0,02 mL a 4 mg/mL) por vía subcutánea para prevenir el dolor relacionado con la cirugía y reducir la posible respuesta inflamatoria.
  8. Con una hoja de bisturí estéril y unas tijeras, haga una incisión de 4-5 mm de largo a lo largo de la línea media de la cabeza para abrir el cuero cabelludo. Comience con una pequeña incisión entre las orejas y luego expándala con unas tijeras para evitar daños en el cráneo.
  9. Frote la superficie del cráneo con una pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno al 3% para visualizar los puntos de referencia estereotáxicos: bregma y lambda. Detenga la reacción con solución salina de NaCl al 0,9% inmediatamente. Raspe los tejidos de la parte superior del cráneo con un raspador de huesos.
  10. Monte el inyector motorizado preparado previamente con la jeringa Hamilton en el brazo estereotáxico. Dirija una fuente de luz quirúrgica sobre el cráneo expuesto y enfoque el microscopio en el frotma.
  11. Mirando a través del microscopio, manipule el brazo del aparato estereotáctico para centrar la parte superior de la aguja directamente sobre el bregma.
  12. Con la punta de la aguja, alinee el bregma y la lambda horizontalmente y luego mueva el brazo de nuevo al bregma y registre las coordenadas. Utilice estas coordenadas bregma y las coordenadas del atlas de la región de interés para calcular las coordenadas relativas del área objetivo.
  13. Mueva la aguja al área objetivo. Baje la aguja en las nuevas coordenadas y marque esta posición. Seleccione el sitio para la microinyección viral muy cerca del área objetivo mientras se considera la propagación del virus.
    NOTA: Esto evitará dañar el tejido en la región de interés. Se utilizaron las siguientes coordenadas para la región de interés: AP-3.4, ML -2.0, y para la microinyección viral: AP-2.0, ML -1.4. Las coordenadas anteriores son óptimas si se van a infectar las neuronas primarias de la corteza visual.
  14. Si es posible, evite las regiones con vasos sanguíneos grandes. Bajo un microscopio quirúrgico, iluminación con luz fría y brillante, e inmersión salina de NaCl al 0,9%, los vasos sanguíneos grandes en el cráneo y en la superficie del cerebro deben hacerse evidentes.

4. Inyección de virus

  1. Tome una fresa dental estéril (de 0,5 a 0,8 mm de diámetro). Al observar la superficie del cráneo a través del microscopio quirúrgico, perfore una pequeña craneotomía manualmente (a mano) o con un microtaladro. Tenga cuidado de no ejercer una presión excesiva sobre el cráneo.
  2. Mueva el brazo para evitar daños en la aguja de la microjeringa durante la perforación de la craneotomía (orificio). Aplique una inmersión salina de NaCl al 0,9% y haga una pausa intermitente para evitar calentar el hueso y dañar la duramadre. Use aire presurizado para soplar el polvo de los huesos.
    NOTA: Los siguientes tipos de fresas dentales de carburo son adecuados: en forma de pera (preferiblemente), cilíndricas redondeadas y redondas.
    1. Al adelgazar el hueso con la fresa, asegúrese de que el adelgazamiento sea uniforme en toda la circunferencia. Esto hará que sea más fácil extraer el hueso sin dañar la duramadre. Para hacer esto, use una fresa con una punta redonda inicialmente y luego una fresa con una punta plana. Mantenga la fresa perpendicular al hueso; de lo contrario, un lado será más delgado que el otro.
      NOTA: Además, cuanto menor sea el tamaño de la fresa y menor sea la craneotomía realizada, más compleja será la manipulación. Se recomienda realizar una craneotomía de menor diámetro (0,5-0,6 mm) cuando se utilice posteriormente el animal para el trabajo in vivo . Si planea utilizar el cerebro del animal para el trabajo ex vivo , es aceptable un diámetro de craneotomía mayor para simplificar el procedimiento.
  3. Cuando el hueso adelgazado esté blando y transparente, deje de perforar. Cuando se forma una hendidura suficientemente grande en el hueso, detenga con frecuencia la rotación y controle el grosor del hueso. La aparición de grietas en el hueso indica que el adelgazamiento es suficiente.
  4. Bañe el orificio con solución salina estéril y luego retire el exceso de solución salina con un hisopo de algodón. Retire la capa restante de hueso con una aguja de 27 g con punta en forma de gancho y/o con pinzas de punta fina. Evite dañar la duramadre.
  5. Cubra la superficie del cráneo con un pedazo estéril de toalla de papel humedecida con solución salina. Coloque un pedazo de película limpia y transparente sobre la superficie del cráneo del ratón sobre el papel.
  6. Mueva el brazo estereotáxico hacia atrás y coloque la aguja de la microjeringa en su lugar directamente encima de la película. Dispense el exceso de aceite hasta alcanzar un volumen de 2 μL.
    NOTA: El volumen final del aceite puede variar según el volumen de la micro jeringa. Utilizamos una microjeringa Hamilton 75-RN de 5 μL.
  7. Pipetear un volumen de virus igual al volumen inyectado + 2 μL sobre un trozo de película transparente.
  8. Mirando a través del microscopio quirúrgico, baje el brazo hasta que la punta de la aguja esté en el centro de la gota del virus. Cargue el virus en la microjeringa con un inyector motorizado. Deseche la punta de la micropipeta y la película transparente en el frasco con lejía al 2%.
  9. Retire el papel humedecido con solución salina de la superficie del cráneo y seque el cráneo con un hisopo de algodón. Utilice el brazo estereotáxico para colocar la aguja por encima del sitio de inserción.
  10. Dispense una gota del virus para asegurarse de que la aguja no esté obstruida. Haz una pequeña hendidura en la duramadre con una aguja de 30 g con punta en forma de gancho.
    NOTA: Es importante hacer la menor hendidura posible en la duramadre, permitiendo que la aguja entre sin dejar un espacio entre la aguja y la duramadre, por el cual podría filtrarse el virus.
  11. Baje la aguja de la jeringa hasta la duramadre y haga los cálculos adecuados para la profundidad. Calcule la profundidad cortical de la inserción en relación con el punto en el que la aguja tocó por primera vez la superficie de la corteza.
  12. Inserte lentamente la punta de la aguja en la corteza hasta una profundidad de 300 μm. Espere 2-3 minutos para permitir que la duramadre se adhiera a la aguja y, a continuación, retraiga lentamente la aguja hasta una profundidad de 200 μm. Espere otros 2-3 minutos para permitir que el tejido cerebral se asiente. Esto hace que la aguja tire de la duramadre hacia arriba, creando un espacio subdural para que el virus se propague.
    NOTA: Para minimizar el daño cortical, utilice una aguja de 33 G o agujas de G inferior. Tenga en cuenta que cuanto menor sea el diámetro interior de la punta, mayor será la posibilidad de que el reflujo de tejido la obstruya. Es importante usar una aguja roma en lugar de biselada porque una aguja roma expulsa una gota más controlada de solución viral.
    1. Si la aguja no pasa a través de la duramadre cuando se baja a 150-200 μm y, en cambio, la dobla, deje de bajar. Levante la aguja y haga una incisión un poco más grande en la duramadre, luego intente bajar la aguja nuevamente.
    2. Si el líquido cefalorraquídeo comienza a gotear activamente de la incisión mientras se baja la aguja, espere hasta que deje de gotear; De lo contrario, es difícil controlar el paso de la aguja a través de la duramadre. Seque el exceso de líquido cefalorraquídeo con una punta de tejido. Una vez que el líquido deje de fluir, levante la aguja y vuelva a intentarlo.
  13. Comience a inyectar la suspensión viral a una velocidad de 0,06 μL/min mientras controla el volumen dispensado. Inyecte 1 μL de virus. Inyecte el virus a una sola profundidad para no romper el sello entre la aguja y el tejido de la corteza.
    1. Solución de problemas: Al comienzo de la inyección, puede producirse un reflujo del virus a la superficie del cerebro. Deje de inyectar, espere 2-3 minutos y luego continúe con la inyección del virus. Repita estas acciones (pasos) hasta que se detenga el reflujo del virus. El virus y los líquidos cefalorraquídeos se adherirán a la aguja y evitarán el reflujo.
    2. Otra forma de detener el reflujo del virus, poner una pequeña cantidad de agarosa en la superficie de la corteza. Suprimirá la pulsación de la corteza y también ayudará a sellar la aguja. Pero asegúrese de que la pipeta no esté obstruida por la agarosa.
    3. Dado que es posible que la aguja no pase completamente a través de la duramadre cuando se baja, sino solo parcialmente, es posible que un lado de la aguja no encaje firmemente contra la duramadre, lo que puede causar reflujo del virus. En este caso, retire lentamente la aguja del pañuelo e intente bajarla de nuevo.
  14. Una vez completada la infusión, mantenga la aguja en el lugar objetivo durante 10 minutos más. Esto permite que el virus se disperse lejos del lugar de la inyección. Retraiga la aguja fuera del cerebro lentamente para evitar que el virus vuelva a salir del tracto de la aguja.
  15. Una vez completada la extracción de la aguja, compruebe que no esté obstruida dispensando una pequeña gota de virus. Cierre la incisión cutánea con suturas 5-0 reabsorbibles o no absorbibles.

5. Cuidados postoperatorios

  1. Después de cerrar la incisión, aplique un ungüento antibacteriano por vía tópica. Inyectar una mezcla de solución salina (5 mL/kg) y glucosa al 5% (5 mL/kg) por vía subcutánea para prevenir la deshidratación y facilitar la recuperación después de la anestesia. Inyectar ketoprofeno por vía intramuscular (2,5 mg/kg) para reducir el dolor.
  2. Coloque al animal en una jaula fresca encima de una almohadilla térmica y vigile hasta que se recupere de la anestesia. Después de que el ratón esté reactivo, coloque al animal en su jaula de casa.

6. Histología

  1. No antes de 21 días después de la inyección del virus, anestesiar profundamente a los ratones con isoflurano como se describe en el paso 3.
  2. Realice una incisión en la línea media (10 -15 mm) a lo largo de la región torácica con unas tijeras estrechas y exponga la cavidad torácica. Separe con cuidado el diafragma y abra el cofre con unas tijeras.
  3. Inserte una aguja 22G 1 1/2 en el ventrículo izquierdo y haga una incisión en la aurícula derecha con unas tijeras. Perfundir con 50 mL de solución salina tamponada (PBS) de fosfato (PBS) preenfriada de 100 m, seguida de 100 mL de formalina tamponada al 10% preenfriada.
  4. Extrae con cuidado todo el cerebro del ratón. Para ello, haz una incisión sagital a lo largo del centro del cuero cabelludo con unas tijeras. A continuación, retire el hueso craneal pieza por pieza con unos alicates para huesos con puntas planas que comiencen en la intersección de las suturas sagital y lambdoidea y avancen hasta el hueso nasal. Cuando el cerebro esté expuesto, corte a través de los bulbos olfativos, extraiga el cerebro con una espátula curva y colóquelo en un tubo de 50 ml que contenga un 10% de formalina tamponada.
  5. Arregla el cerebro de la noche a la mañana. Monte el tejido cerebral en una plataforma metálica de un vibratomo usando adhesivo para tejidos. Corte secciones frontales con un grosor de 50 μm con cuchillas de acero al carbono.

7. Inmunotinción

  1. Día 1
    1. Lave las rodajas de cerebro 3 veces durante 5 minutos cada una con 1x PBS que contenga 0.3% de Triton X-100 (PBS-T). Incubar las secciones en PBS-T durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
    2. Bloquee la unión inespecífica durante 1 h en RT utilizando un tampón de bloqueo compuesto por un 5% de suero de cabra normal (NGS) y un 0,3% de Triton X-100 en 1x PBS.
    3. Incubar las secciones durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra parvalbúmina o calbindina diluidos 1:500 en el tampón de bloqueo (5% NGS y 0,3% Triton X-100 en 1x PBS).
  2. Día 2
    1. Lave las secciones 3 veces durante 10 minutos en PBS-T. Incubar en la oscuridad durante 2 h en RT con anticuerpos secundarios (anticuerpo secundario de adsorción cruzada Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 546) diluidos 1:500 en el tampón de bloqueo (5% NGS y 0,3% Triton X-100 en 1x PBS).
    2. Lave las secciones 3 veces durante 5 minutos cada una en 1x PBS. Transfiera los trozos de cerebro a portaobjetos de vidrio con un cepillo suave.
    3. Agregue inmediatamente 0.1 mL de medio de montaje antidecoloración a cada sección. Cubra las rodajas con un cubreobjetos de 22 mm x 50 mm.
    4. Configure el microscopio confocal con un aumento de 20x o 60x (A/1,4, aceite). Utilice láseres de longitud de onda de 488 nm y 594 nm para adquirir imágenes multicanal de las regiones cerebrales de interés.

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Resultados

En una serie piloto de experimentos, utilizamos el método tradicional de inyección intracortical para transducir neuronas piramidales de la capa cinco en el neocórtex del ratón por AAV2 que transporta el gen de la canalrodopsina rápida (oChIEF) fusionado con la proteína fluorescente EGFP bajo el promotor CaMKII. En consonancia con el rasgo característico de AAV212, obtuvimos un área de infección relativamente pequeña, que no superaba 1 mm de ancho (Figura 1A)...

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Discusión

Hemos desarrollado un nuevo método para transducir neuronas neocorticales de ratón mediante la inyección de una suspensión de partículas virales AAV2 en el espacio subaracnoideo del cerebro. Esto proporciona una distribución generalizada del virus, casi cuatro veces mayor que el volumen de tejido infectado cuando se inyecta la misma cantidad de virus directamente en el parénquima cerebral.

La inyección de vectores virales directamente en el líquido cefalorraqu...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

El trabajo se llevó a cabo con el apoyo financiero de la Fundación Rusa para la Ciencia, subvención 20-15-00398P.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Equipo
10 µ Jeringa hermética a gas L modelo 1701 RN (microjeringa Hamilton de 5 uL 75 RN)Compañía HamiltonParte/REF # 7634-01, Hamilton o cat no. HAM7634-01, Merck
Aguja RN de 33 G, estilo de punta 3Compañía HamiltonRef. # 7803-05, Hamilton
Microscopio binocularNikon o MicromedModelo MC-4 ZOOM
Microscopio confocal de barrido láser basado en CernaThorLabs
Fuente de luz fríaRWDModelo 76312
Leica VT1000 S Micrótomo de cuchilla vibratoriaLeica Biosystems76001-014
Sistema de anestesia de bajo flujo con kit de inicioCorporación Científica Kent13-005-111 (Modelo SomnoSuite)
Pipeta mecánica 0.1 – 2.5 µ L Eppendorf Research plusEppendorf3123000012
Pipeta mecánica 10 – 100 µ L Eppendorf Research plusEppendorf3123000047
Afeitadora de ratonesRWDModelo CP-5200
Microtaladro con brocas (0,5 mm, redondo)RWD78001, 78040
o Desctop Instrumento estereotáxico digital, máscara de anestesia de ratón, barras de oreja de ratón (60 grados)RWDModelos 68027, 68665, 68306
Compresor de aireBambiBB8
Pipeta manual monocanal 0,5-10 µ LRAINN17008649
Instrumento estereotáxico para animales pequeñosKOPFModelo 962
Inyector estereotáxicoEncorvado10-000-004
Instrumentos quirúrgicos (herramientas)
Aguja dental de 30 g (Ni-pro)Biodent Co. Ltd.Para cortar la duramadre
Raspador de huesosHerramientas de ciencia fina10075-16
Alicates para huesosHerramientas de ciencia fina16025-14Para extirpar el hueso craneal
Espátulas curvasFábrica de suministros médicos de MozhaiskPara extraer el cerebro de la bóveda craneal
Fresa dentalDRENDEL + ZWEILINGPara craneotomía; Forma: cilindro de extremo redondo / en forma de pera / redondo; Diámetro de la punta: 0,55-0,8 mm de diámetro
Portaagujas (Halsey Micro Needle Holder)Herramientas de ciencia fina12500-12
Sutura quirúrgica de polipropileno o sutura quirúrgica Vicryl (5-0, absorbible)Productos Walter (Ethicon)S139044 (W9442)
Mango de bisturí (#3) con hojas de bisturí (#11)Herramientas de ciencia fina10003-12, 10011-00
Tijeras (tijeras extra estrechas)Herramientas de ciencia fina14088-10para cortar la piel
Tijeras (tijeras finas)Herramientas de ciencia fina14094-11para cortar la sutura
Sutura quirúrgica PROLENE (Poliproptleno)Ethicon (Johnson & Johnson)
Pinzas (Fórceps #5)Herramientas de ciencia fina11252-20
Pinzas (pinzas de acero inoxidable pulido)Herramientas de ciencia fina11210-20
desechables
Jeringa de insulina de 1 mlSITEKMEDPara cargar aceite de vaselina en una microjeringa, para administrar medicamentos
Placa de cultivo celularCiencias de la vida SPL
Bastoncillos de algodón
CubrevasosFisher Scientific12-545E
Aguja de jeringa de insulina (27 G)SITEKMEDPara extraer restos de un orificio (craneotomía)
Toallitas sin pelusa CLEANWIPERNetLink
Portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-550-15
Toallas de papelLuscan
ParafilmLaboratorio de estadísticasSTLPM996
Guantes quirúrgicos estérilesDermagrip
Filtro de jeringa estéril (0.2 μ m)Corning431229
Medicamentos/Productos químicos (reactivos)
10% de formalina tamponada o 4% de paraformaldehídoProductos químicos Thermo ScientificJ61899. AK
Solución alcohólica de yodo (5%))Renovación
Ungüento antibiótico Baneocina (bacitracina + neomicina)SandozAgente antibacteriano para uso externo
Aqua PolymountPoliciencias18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (Gel oftálmico)BAUSCH+LOMB (Santen)
Microesferas FluoSphere modificadas con carboxilato (rojo)Thermo Fisher ScientificF-8801
Dexametasona (4 mg/ml)Ellara (KRKA)Glucocorticoide sintético
H2O destilado
Etanol (70%)
Flexoprofeno al 2,5% (Ketoprofeno)VICMedicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE)
Solución de glucosa al 5%Solopharm
Cabra anti-conejo IgG (H+L) de adsorción cruzada, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA-11010
IsofluranoKarizoo
Solución de lidocaína (2 % / 4%)Solopharm
Suero de cabra normal (NGS)Abcamab7481
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Eco-servis
Anticuerpo anti-parvalbúmina de conejoMerck MilliporeAB15736
Anticuerpo monoclonal anti-calbindina recombinante de conejoAbcamAB108404
Solución salina (0,9% de NaCl en H2O)Solopharm
Tritón X-100Sigma-Aldrich50-178-1844
Aceite de vaselinaGenel

Referencias

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