Flujo de trabajo que utiliza un microscopio criogénico de fluorescencia coincidente, electrones y haz de iones para la molienda dirigida de células

Resumen

Este flujo de trabajo permite la producción de láminas dirigidas a estructuras biológicas marcadas con fluorescencia que son pequeñas (<1 μm de extensión axial) y raras (1 copia por célula) utilizando una plataforma de imágenes criogénicas tricoincidentes. Esta plataforma integra microscopía de fluorescencia, fresado por haz de iones enfocado y microscopía electrónica de barrido en una sola posición focal y permite la microscopía de fluorescencia simultánea durante el fresado.

Resumen

La fresación criogénica por haz de iones focalizados con microscopía electrónica de barrido (CryoFIB-SEM) se ha convertido en el enfoque dominante para preparar láminas de células de menos de 200 nm de espesor para tomografía electrónica criogénica (CryoET). Recientemente, la microscopía de fluorescencia se ha incorporado a los sistemas CryoFIB-SEM para guiar la producción de láminas hacia objetivos marcados con fluorescencia. Sin embargo, en la mayoría de las implementaciones, los sistemas de imágenes ópticas y de haz de iones tienen planos focales distintos en diferentes regiones de la cámara de vacío, funcionando eficazmente como dos microscopios separados. Esta configuración requiere el registro de imágenes entre modalidades, que a menudo carece de la precisión necesaria para apuntar de manera confiable a estructuras pequeñas y raras in situ. Presentamos un flujo de trabajo basado en una plataforma de imágenes tricoincidente personalizada que permite obtener imágenes de fluorescencia simultáneas y fresado por haz de iones enfocado. Esto permite una retroalimentación de fluorescencia en tiempo real que se puede utilizar para determinar cuándo terminar el fresado con el fin de preservar las estructuras de interés marcadas con fluorescencia en la lámina final. Usando este enfoque, nos dirigimos al centro organizador de microtúbulos (MTOC) en macrófagos vitrificados y logramos una tasa de éxito del >60%, confirmada por tomografía electrónica criogénica posterior y microscopía óptica y electrónica correlativa.

Introducción

La tomografía electrónica criogénica (CryoET) permite la visualización de muestras biológicas en un estado casi nativo con una resolución macromolecular 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Sin embargo, el grosor de las células eucariotas, a menudo de varias micras, excede el camino libre medio (~ 300 nm) de electrones de 300 kV, lo que limita la profundidad de penetración de los electrones no dispersos y, por lo tanto, restringe el espesor utilizable de la muestra. Para abordar esto, se puede usar un haz de iones enfocado (FIB) para extirpar la mayor parte de la célula preservada criogénicamente en un proceso conocido como molienda CryoFIB, produciendo laminillas lo suficientemente delgadas para imágenes CryoET 12,13,14,15,16.

En los flujos de trabajo informados anteriormente, las muestras se conservan primero en hielo vitrificado mediante congelación por inmersión 17,18,19 y luego se cargan en un instrumento de doble haz equipado con un CryoFIB y un microscopio electrónico de barrido (SEM). Las imágenes SEM se pueden utilizar para identificar características subcelulares de interés, como orgánulos e incluso algunas estructuras proteicas^20,21. Esta información se puede utilizar para dirigir el proceso de molienda de CryoFIB, donde la muestra se ablaciona de manera escalonada con el objetivo de producir una lámina de menos de 200 nm de espesor adecuada para CryoET 13,14,22. Sin embargo, este enfoque presenta dos desafíos clave que aborda el presente protocolo. En primer lugar, a menudo es necesario obtener CryoET de estructuras proteicas específicas, pero el SEM puede ser perjudicial y la mayoría de las estructuras proteicas no son discernibles por el SEM cuando se obtienen imágenes de material biológico no teñido. ¿Cómo se puede guiar con precisión la molienda a regiones subcelulares específicas o regiones que contienen biomoléculas específicas de una manera libre de daños? En segundo lugar, incluso después de la producción de laminillas delgadas y CryoET posterior, puede ser un desafío identificar biomoléculas específicas en las reconstrucciones finales debido a la resolución insuficiente, la relación señal-ruido y / o el contraste necesarios para la identificación inequívoca. ¿Cómo se pueden determinar las posiciones espaciales de estas biomoléculas dentro de las reconstrucciones crio-ET?

Para abordar ambos desafíos, el campo se ha volcado cada vez más a la microscopía de fluorescencia. Las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente o los colorantes exógenos que se unen a las proteínas diana se utilizan de forma rutinaria para etiquetar biomoléculas específicas de interés ^5,23,24. La microscopía de fluorescencia criogénica de células vitrificadas tomada después de la molienda se puede correlacionar con los tomogramas resultantes. Este enfoque, conocido como microscopía criogénica correlativa de luz y electrones (CryoCLEM), está bien establecido y se ha utilizado ampliamente para localizar proteínas específicas dentro de las reconstrucciones CryoET 5,12,23,24. Los avances recientes incluyen el uso de biosensores fluorescentes y métodos de superresolución para mejorar la información complementaria y la precisión espacial 25,26,27,28,29.

CryoCLEM es una forma de superar el segundo desafío identificado anteriormente, lo que permite determinar la ubicación de proteínas específicas dentro de la lámina. Sin embargo, CryoCLEM no hace nada por el usuario si la lámina final no contiene las proteínas de interés. Afortunadamente, la microscopía de fluorescencia también se puede utilizar para dirigir el fresado a regiones de interés marcadas. Si bien el fresado FIB guiado por fluorescencia es un desarrollo más reciente que CryoCLEM, los flujos de trabajo iniciales surgieron hace aproximadamente una década¹², ha encontrado una adopción rápida y generalizada. Los primeros protocolos se basaron en microscopios ópticos externos para adquirir conjuntos de datos de fluorescencia 2D o 3D, que luego se registraron en SEM e imágenes de haz de iones después de transferir la muestra al CryoFIB-SEM. Más recientemente, los microscopios de fluorescencia se han integrado directamente en las cámaras de vacío CryoFIB-SEM. Esta integración reduce la contaminación por hielo durante las transferencias y permite obtener imágenes de la lámina final más fácilmente. Ahora se han desarrollado varias plataformas para combinar la microscopía de fluorescencia con CryoFIB-SEM para la molienda guiada por fluorescencia. Estos se han dirigido con éxito a orgánulos y grandes complejos de proteínas ^5,23,24. Sin embargo, con pocas excepciones³⁰, la trayectoria óptica produce un plano focal separado en una región física diferente de la cámara de vacío del FIB-SEM. Como resultado, todavía se requiere un registro preciso entre las imágenes de fluorescencia e iones para dirigir la molienda, tal como se requiere con el uso de microscopios ópticos independientes.

Este proceso de registro es propenso a la inexactitud debido a tres factores clave: desajustes del índice de refracción (que causan cambios focales aparentes)^31,32, movimiento de la muestra durante el fresado y error de localización. Además, el registro suele contar con la ayuda de fiduciales fluorescentes de tamaño micrométrico que son visibles tanto en las modalidades iónicas como ópticas y se utilizan como pares de puntos de alineación para calcular las transformaciones entre las imágenes iónicas y ópticas. Sin embargo, estas perlas pueden oscurecer o competir con la señal de fluorescencia de la muestra, y su localización y alineación a través de imágenes ópticas e iónicas es lenta y requiere mucho uso del usuario. Juntas, estas limitaciones han obstaculizado la selección rutinaria de características pequeñas y raras. Si bien es difícil definir un límite preciso para las estructuras que se pueden conservar actualmente en láminas delgadas, los enfoques basados en el registro generalmente se consideran ineficaces para capturar objetivos con dimensiones axiales inferiores a una micra³³.

Aquí, informamos el uso de un sistema de imágenes tricoincidentes que integra FIB, SEM y microscopía de fluorescencia en una sola posición focal ^34,35. Esta configuración permite un fresado guiado por fluorescencia más simple y preciso en comparación con las integraciones no coincidentes, al eliminar la necesidad de registrar imágenes ópticas y de iones. En condiciones ideales de fondo bajo y señal alta, se puede lograr una precisión de guía del orden de 10 nm³⁶. También permite la adquisición de datos de microscopía de fluorescencia criogénica multicolor durante todo el proceso de molienda, incluso desde la lámina delgada final, lo que permite el análisis correlativo y la localización de objetivos limitados por subdifracción³⁵. Para lograr esto, empleamos un conjunto de herramientas de transformación de imágenes personalizado para alinear con precisión estas imágenes de fluorescencia con microscopía electrónica de transmisión de bajo aumento para determinar dónde recolectar CryoET, agilizando la recopilación de datos y asegurando la captura del objetivo en las reconstrucciones tomográficas finales.

Para guiar el fresado, explotamos la capacidad del sistema para monitorear los cambios en la intensidad de la fluorescencia en tiempo real. En lugar de tratar de alinear imágenes ópticas e iónicas para encontrar nuestro objetivo, el usuario simplemente observa la señal fluorescente de la muestra. A medida que avanza el fresado, la fluorescencia se comporta de una manera muy característica: primero se vuelve más brillante a medida que se retira la película de soporte de carbono entre el objetivo del microscopio y la muestra marcada con fluorescencia, luego disminuye gradualmente a medida que se muele el material autofluorescente desenfocado y, finalmente, disminuye bruscamente a medida que se elimina parcialmente la estructura marcada. Esta señal en tiempo real determina con precisión dónde se encuentra uno en el proceso de fresado y cuándo detener el fresado, lo que garantiza que el objetivo de interés se mantenga dentro de la lámina final³⁷. En el protocolo detallado, también discutiremos un enfoque más avanzado que utiliza oscilaciones en el brillo de fluorescencia debido a efectos interferométricos para guiar el fresado a objetos que tienen <300 nm de extensión axial.

Demostramos la utilidad de la plataforma dirigiéndonos al centro organizador de microtúbulos (MTOC)³⁸. El MTOC es un orgánulo crítico involucrado en la división y diferenciación celular. En células de mamíferos, la microscopía de fluorescencia de tubulina marcada revela el MTOC como un solo punto fluorescente de aproximadamente 1 μm de diámetro en células vivas. Este enfoque se ha utilizado para localizar con éxito el MTOC con alta fidelidad a laminillas delgadas de células vitrificadas. La organización detallada de los microtúbulos en el MTOC y sus interacciones con otros orgánulos se revelan en reconstrucciones tomográficas posteriores. Este flujo de trabajo permite la microscopía de fluorescencia correlativa de alta precisión y CryoFIB-SEM sin registro, lo que reduce la entrada del usuario y amplía el acceso a estructuras celulares que antes eran prohibitivamente pequeñas para capturar de manera robusta con enfoques no coincidentes.

Definiciones y descripción del instrumento
El microscopio óptico integrado se describe en detalle en Boltje et ^al.35, y se pueden encontrar más detalles sobre el uso del microscopio integrado en un protocolo publicado recientemente³⁴. El objetivo está integrado desde abajo y equipado con capacidades de posicionamiento x, y y z para permitir la alineación con el punto coincidente FIB-SEM. Actualmente funciona con un objetivo de 100x y 0,85 NA con un corrector de cubreobjetos. Las imágenes ópticas se realizan a través de un cubreobjetos, que protege el objetivo del material pulverizado y la irradiación tanto del FIB como del SEM. La iluminación de campo amplio es proporcionada por un conjunto de LED que abarcan múltiples longitudes de onda visibles. La detección de fluorescencia se logra utilizando un detector sCMOS. Hay tres posiciones de etapa definidas: carga: la posición de la etapa donde se carga la muestra; recubrimiento: la posición de la platina para el recubrimiento a través del sistema de inyección de gas; 3-Haz: la posición de la platina para la que se pueden co-alinear los tres microscopios (FIB, SEM y ópticos).

Protocolo

NOTA: El sistema de triple coincidencia utilizado aquí es un componente personalizado de imágenes de fluorescencia criogénica integrado en un sistema FIB-SEM de doble haz disponible comercialmente. El principio y el orden de las operaciones se pueden adaptar generalmente a futuras implementaciones tricoincidentes.

1. Configuración

1. Enfríe el sistema a temperatura criogénica. Controle la temperatura mediante dos sensores: uno ubicado en la platina de muestra y el otro dentro de la cámara. Mantenga la platina de muestra aproximadamente 20 °C más caliente que la cámara (p. ej., platina a ~-170 °C, cámara a ~-190 °C) para minimizar la acumulación de hielo en la muestra. El proceso de enfriamiento suele durar aproximadamente 1,5 h.

2. Carga de muestras

1. Utilice nitrógeno líquido para enfriar manualmente la estación de transferencia una vez que la temperatura del sistema se acerque a la temperatura criogénica (aproximadamente -167,5 °C). La temperatura del sistema se muestra en la esquina superior izquierda del software de microscopía óptica.
2. Cargue un Autogrid recortado en el casete de muestras diseñado para el sistema de microscopía óptica criogénica. El casete consta de un cubreobjetos pegado y un espaciador, con el Autogrid colocado entre ellos. Cierre el casete apretando el tornillo anular y, a continuación, insértelo en la ranura de la estación de transferencia³⁴.
3. Conecte la estación de transferencia al sistema y utilice la cámara de cámara interna para guiar el casete de muestras a la platina de muestras.

3. Sistema de inyección de gas (GIS) para recubrimiento de muestras

1. Abra el software de control de microscopía óptica y mueva la platina de muestra de la posición de carga a la posición de recubrimiento .
2. Inserte la aguja GIS con el software de control FIB-SEM haciendo clic en el icono Snowflake. En Control GIS, elija la opción insertar aguja GIS.
3. Permita la deposición GIS durante 30 s abriendo el flujo de gas.
   NOTA: Esto varía de 20 s a 1 min según el tipo de muestra. El objetivo de este paso es proteger suficientemente la muestra durante el procedimiento de fresado FIB posterior.
4. Retrayendo la aguja GIS, vuelva a mover la etapa de muestra a la posición de carga predefinida.

4. Alineación del sistema de tres vigas

NOTA: Esta sección es una adaptación de Wang³⁹.

1. En el software de microscopía óptica, mueva la platina de muestra de la posición de carga a la posición predefinida de 3 haces .
2. En el software FIB-SEM, haga clic en la ventana superior izquierda y configure el SEM con un aumento de 100x.
3. En la pestaña Alineación del software de microscopía óptica, haga clic en la función Ver para adquirir un atlas SEM de la cuadrícula. Esta imagen del atlas utiliza parámetros previamente establecidos.
4. Identifique un área cuadrada con película de carbón rota y haga doble clic en ella para mover la etapa de muestra a esa ubicación.
5. Regrese al software de control FIB-SEM y ajuste el SEM a un aumento más alto para enfocar el área cuadrada seleccionada, centrada en el campo de visión.
6. Repita los pasos 4.4 y 4.5 según sea necesario hasta que el SEM se enfoque en un patrón distinguible, como el borde afilado de una película de carbono rota.
7. Encienda el microscopio de fluorescencia y ajuste las coordenadas x, y, z para que coincidan con la vista SEM.
8. Fresa un patrón pequeño con el FIB, por ejemplo, un pequeño rectángulo o círculo.
9. Confirme que el patrón sea visible tanto en la vista del microscopio FIB como en la del microscopio fluorescente. Si es necesario, ajuste la alineación siguiendo los pasos 4.3-4.7 si es necesario.
   NOTA: La alineación y el registro de los microscopios ópticos e iónicos están completos.

5. Localización y fresado de objetivos

NOTA: Esta sección es una adaptación de Wang³⁹.

1. Vaya a la pestaña Localización en el software de microscopía óptica y configure los canales fluorescentes activando las condiciones adecuadas de excitación y filtrado. Asigne cada fluoróforo como un canal separado e incluya un canal adicional para luz transmitida (o campo claro).
2. Identifique el objetivo de interés ajustando la potencia del LED y el tiempo de exposición para cada canal fluorescente. Como referencia, al obtener imágenes de SiR-tubulina, use una exposición de 1,2 s con una configuración de potencia LED constante de 30 mW.
   NOTA: Los parámetros pueden variar entre fluoróforos. La intensidad óptica debe permanecer por debajo de ~ 25-50 W / cm² en la muestra. Una intensidad mayor que esta puede resultar en un calentamiento y desvitrificación significativos de la muestra^37,40.
3. Una vez satisfecho con los parámetros, adquiera una pila en z fluorescente de prefresado que pase por la dirección axial. Luego, marque el objetivo como un ROI.
4. Cambie al software FIB-SEM para dibujar una lámina en el ROI.
5. Realice un fresado en bruto para eliminar la mayor parte del material aproximadamente 3 μm por encima y por debajo del ROI. Mientras tanto, mantenga el microscopio de fluorescencia encendido durante el fresado para controlar cualquier disminución de la señal fluorescente.
6. Diluya el ROI a ~2 μm usando el modo de sección transversal de limpieza.
7. Abra el kit de herramientas interferométrico basado en Python desde el terminal para monitorear la señal fluorescente mientras adelgaza la lámina (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)³⁶.
8. Para el fresado y pulido posteriores, siga uno de los dos enfoques descritos a continuación en los pasos 5.9 o 5.10 para dirigir el fresado en función de las dimensiones de los objetivos seleccionados.
   1. Extensión axial del objetivo > 300 nm
      NOTA: Aquí utilizaremos un enfoque semidestructivo para la molienda directa.
      1. En la interfaz gráfica de usuario de Python, seleccione el objetivo de interés en la micrografía de fluorescencia. El software comenzará a trazar automáticamente el brillo en función del tiempo con cada nuevo fotograma.
      2. Monitoree la intensidad de la fluorescencia a través del kit de herramientas de Python. Fresar la muestra en modo de sección transversal de limpieza desde abajo para eliminar cualquier material de película de soporte restante, si corresponde.
         NOTA: Cuando se retira la película de soporte, se debe observar una mejora en la fluorescencia.
      3. Utilice caídas rápidas en la intensidad de la fluorescencia, lo que indica la pérdida de material fluorescente, como una señal de cuándo cambiar las direcciones de fresado. Por ejemplo, si se fresa de abajo hacia arriba y se observa una fuerte disminución de la fluorescencia, detenga el fresado y cambie al fresado de arriba hacia abajo.
         NOTA: Si una estructura se retira demasiado rápido, reduzca la corriente de fresado en el software FIB-SEM para ralentizar la eliminación del objetivo.
   2. Extensión axial del objetivo ≤ 300 nm
      NOTA: Aquí, usaremos el efecto interferométrico para dirigir el fresado³⁶.
      1. En la interfaz gráfica de usuario de Python, seleccione el objetivo de interés en la micrografía de fluorescencia. El software comenzará a trazar automáticamente el brillo en función del tiempo con cada nuevo fotograma.
      2. Comience fresando de arriba hacia abajo a través de un objetivo de prueba. Monitoree el contraste de la franja justo antes de fresar a través del objetivo a través de la intensidad de fluorescencia. El objetivo de fluorescencia se ajusta continuamente a un gaussiano 2D, y el ajuste se utiliza para obtener una intensidad integrada que luego se traza.
      3. Después de fresar el objetivo, ajuste las oscilaciones en el seguimiento de intensidad a la siguiente función del modelo usando la GUI de Python:
         
         Donde A es la amplitud de la oscilación, λ la longitud de onda de excitación, k un término de amortiguación que representa la longitud de coherencia de la fuente de luz, un factor de fase Φ, y d es la distancia al objeto de captura. A partir del objetivo de prueba, todos los términos se pueden predecir dentro de límites razonables de modo que la distancia, d, es la única variable libre utilizada para decirle al usuario dónde está el objeto fluorescente en relación con su fresado. Véase Sica et al. para más detalles³⁶.
         NOTA: Para los objetivos posteriores, el kit de herramientas ajustará en vivo el trazado de intensidad con la misma función del modelo y estimará dónde detener el fresado de arriba hacia abajo. Todos los accesorios se realizan simultáneamente con el fresado. El objetivo es detener el fresado cuando el objetivo se encuentra a una profundidad igual a la mitad del grosor de la lámina deseado debajo de la superficie superior.
      4. Una vez finalizado el fresado de arriba hacia abajo, finalice la lámina fresando de abajo hacia arriba en modo de sección transversal de limpieza hasta lograr el espesor deseado.
9. Tome una imagen de fluorescencia posterior al fresado.

6. Colección de microscopía óptica correlativa y serie de inclinación

1. Después de transferir la muestra a CryoTEM, recopile una descripción general del atlas de la cuadrícula a 182x para permitir una cobertura suficiente de todas las cuadrículas.
2. Con un aumento intermedio apropiado que oscila entre 6.500x y 11.000x, recopile una serie de imágenes de montaje de la lámina final con una inclinación de 0°.
3. Lea las imágenes de fluorescencia multicanal posteriores al fresado y la imagen de proyección del paso 6.2 en un software de transformación proyectiva personalizado para el registro de ROI (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
4. Elija un total de 8-10 pares de puntos de referencia para calcular con precisión la transformación proyectiva de la imagen.
   NOTA: Estos puntos pueden ser características obvias (por ejemplo, bordes laminares, contaminación visible por hielo o agujeros de rejilla abiertos) que están presentes tanto en la microscopía óptica de campo claro como en la microscopía electrónica.

7. Colección de series de inclinación de gran aumento

1. Utilice esta imagen de microscopía electrónica de transmisión y fluorescencia superpuesta como referencia para que los usuarios seleccionen un área de imagen dentro del límite del tamaño del marco de la cámara para la colección de series de inclinación de gran aumento.
2. Seleccione el aumento y los parámetros de la serie de inclinación en función de la cuestión biológica.
   NOTA: Para la demostración, recopilamos datos de 54 ° con incrementos de 2 ° a un tamaño de píxel de 3.5 Å 41,42,43.

Resultados

Marcamos células de macrófagos diferenciadas con el marcador de tubulina SiR-tubulina antes de la congelación. Siguiendo el protocolo, identificamos el MTOC como un único punctum fluorescente de ~ 1 μm de diámetro bajo el microscopio de fluorescencia (Figura 1A). Además, observamos estructuras fluorescentes similares a fibrillas que irradian desde el MTOC hacia la periferia celular, consistentes con la red de microtúbulos (Figura 1A). En la Figura 1B se muestran instantáneas de fresado paso a paso en diferentes espesores de muestra. En particular, cuando la lámina alcanzó un espesor de aproximadamente 800 nm, el único punto MTOC se resolvió en dos motas adyacentes, cada una de aproximadamente 700 nm de diámetro. El análisis posterior confirmó que cada mota correspondía a un centriolo individual.

Las imágenes y el fresado simultáneos nos permitieron monitorear los cambios en la intensidad de la fluorescencia en tiempo real. En particular, observamos un aumento en la fluorescencia después de la eliminación del material no fluorescente a granel y la película de soporte absorbente (Figura 1B-D). A medida que la lámina se adelgazó de 2 μm a 800 nm, la intensidad de la fluorescencia disminuyó drásticamente, lo que refleja la eliminación progresiva de las estructuras marcadas. Esta disminución continuó a medida que la lámina se adelgazaba aún más por debajo de 200 nm (Figura 1B-D). La imagen de fluorescencia correlacionada y el atlas de microscopía electrónica demuestran que nuestro flujo de trabajo permite una orientación precisa para la molienda (Figura 2A). Los tomogramas reconstruidos y los modelos segmentados revelan que los centriolos están compuestos por tripletes de microtúbulos, lo que concuerda con los informes previos 42,43,44,45 (Figura 2A,B). En los casos en los que solo se conserva una mancha fluorescente en la lámina final, observamos un solo centriolo en el tomograma correspondiente (Figura 2B).

Figura 1: Flujo de trabajo de CryoFM-FIB-SEM tricoincidente para una localización precisa del centro organizador de microtúbulos. (A) (izquierda) Microscopía de células vivas y (derecha) CryoFM del MTOC. Barra de escala = 10 μm. (B) Instantáneas paso a paso de CryoFM y CryoFIB para fresado dirigido. La vista FM de primer plano se indica como cuadros discontinuos amarillos. Los centriolos están marcados como flechas amarillas. Barra de escala = 5 μm. (C) Intensidad de fluorescencia del MTOC durante el fresado CryoFIB. (D) Perfil de la línea de fluorescencia a través del MTOC tomado en diferentes etapas durante el fresado CryoFIB. Abreviaturas: CryoFM-FIB-SEM = Microscopía de fluorescencia criogénica con fresado por haz de iones enfocado y microscopía electrónica de barrido; MTOC = centro organizador de microtúbulos; ROI = región de interés. Esta figura es una adaptación de Wang³⁹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Detalles moleculares del MTOC revelados por el flujo de trabajo CryoFM-FIB-SEM tricoincidente. (A) Modelo correlacionado de FM, EM y segmentación del MTOC. (a) Imagen FM posterior al fresado. Esta es la misma imagen del último panel de la Figura 1B marcada como 180 nm pero girada para que coincida con la reconstrucción y segmentación de CryoET. Barra de escala = 5 μm; (b) Vista ampliada del área discontinua en amarillo desde (a). (c) Proyección FM y TEM correlacionada del área discontinua en cian indicada en (2). Barra de escala = 1 μm. (d) Modelo segmentado de reconstrucción tomográfica en la región de interés (amarillo, centriolo; verde, microtúbulo). Barra de escala = 100 nm. (B) Imágenes FM representativas y cortes tomográficos de dos laminillas diferentes que presentan diferentes orientaciones de centriolos. FM: Barra de escala = 5 μm. Corte tomográfico: Barra de escala = 200 nm. Abreviaturas: CryoFM-FIB-SEM = Fresado criogénico por haz de iones focalizados con microscopía electrónica de barrido; MTOC = centro organizador de microtúbulos; FM = microscopía de fluorescencia; ET = transmisión de electrones; TEM = microscopía electrónica de transmisión. Esta figura es una adaptación de Wang³⁹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Nuestros resultados destacan la utilidad de la plataforma de imágenes tricoincidentes, que permite obtener imágenes de fluorescencia y fresado simultáneos. Aprovechando esta retroalimentación, demostramos dos estrategias de fresado guiadas por fluorescencia, semidestructiva e interferométrica, que evitan la necesidad de enfoques engorrosos y basados en el registro que enfrentan limitaciones fundamentales de precisión relacionadas con el desajuste del índice de refracción y el movimiento durante la molienda 12,33,46 . Además, dado que la guía precisa se basa en la microscopía de fluorescencia en lugar de SEM, la radiación óptica no conduce a daños detectables siempre que la intensidad se mantenga por debajo del umbral que conduce a la desvitrificación^37,47. Las capacidades demostradas aquí amplían las muestras biológicas accesibles para incluir objetivos de interés raros y pequeños (<300 nm en extensión axial) al tiempo que agilizan el flujo de trabajo.

El paso clave en este protocolo es determinar cuándo detener el fresado en función de los cambios en el brillo fluorescente de un objetivo de interés. Actualmente, esto implica una rápida intervención manual para detener el fresado en los momentos deseados. Este método ha demostrado ser suficiente para los objetivos actuales que se han explorado, pero una modificación futura podría integrar aún más el kit de herramientas de Python en el sistema FIB para detener directamente el fresado. Esta modificación puede ser necesaria si se requieren velocidades de fresado más rápidas, ya que esto dará menos tiempo para la intervención manual. Alternativamente, si se pueden tolerar velocidades de fresado más lentas, esto dará más tiempo para la intervención manual si es necesario.

Después de la generación de estructuras biológicas de interés que contienen láminas, nuestro software de transformación de imágenes personalizado permite la correlación a nivel de CryoTEM, utilizando resúmenes de atlas de láminas para guiar la recopilación de datos de CryoET. En general, el protocolo presentado aquí es esencial para obtener imágenes de objetivos biológicos marcados con fluorescencia, pequeños y raros mediante tomografía electrónica criogénica en muestras celulares eucariotas gruesas. En comparación con los sistemas Cryo-FIB no coincidentes existentes, como el Aquilos 2 con iFLM, nuestro flujo de trabajo logra una mayor tasa de éxito en la orientación de estas características.

Esta alta precisión de orientación se produce a costa de la eficiencia. Debido a que el fresado es manual en lugar de automatizado, el rendimiento de la generación de láminas es limitado. En una sesión de molienda de 8 h, normalmente producimos 6-8 láminas, con aproximadamente cinco que contienen un objetivo de interés. Sin embargo, creemos que este flujo de trabajo podría automatizarse en el futuro para mejorar el rendimiento. La automatización requeriría scripts personalizados para monitorear continuamente las áreas de fresado activas en la imagen FIB y realizar un seguimiento de la intensidad de la fluorescencia en tiempo real para garantizar la retención del objetivo. Siguen existiendo desafíos clave, incluido el establecimiento de una comunicación efectiva entre todos los scripts personalizados y el software de control tanto para el CryoFIB-SEM como para el microscopio de fluorescencia.

Mirando hacia el futuro, hay mucho trabajo por hacer para incorporar otras técnicas avanzadas de microscopía de fluorescencia discutidas anteriormente, incluidos biosensores fluorescentes, imágenes de superresolución y microscopía confocal. No obstante, anticipamos que las geometrías tricoincidentes se convertirán en estándar en los instrumentos futuros y que las imágenes de fluorescencia simultáneas durante el fresado se convertirán en rutina. Si es así, este protocolo puede servir como una guía valiosa para los investigadores que buscan capturar detalles a escala molecular de las estructuras biológicas pequeñas y raras, que a pesar de su tamaño y abundancia, son fundamentales para la biología celular.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Criofibrilación Aquilos 2	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m & gad_source=1&; gad_campaignid=12 764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9&; gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB
Caja de criogrid compatible con Autogrid	Ciencias de la Microscopía Electrónica		https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box?srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Anillos de autorejilla y clips en C	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
CLEM Software Suite	Grupo de Investigación Dahlberg en Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Dragonfly 2022.1	Sistemas de Investigación de Objetos		https://dragonfly.comet.tech/
ENZEL	Delmic B. V.		El sistema ENZEL es un instrumento personalizado y actualmente no está disponible comercialmente
IMOD 4.12	Universidad de Colorado		https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 nitrógeno líquido dewar	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Herramienta manipuladora de tapas de pasadores	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Kit de herramientas de Python	Grupo de Investigación Dahlberg en Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, malla 200, cuadrícula EM Au	Ciencias de la Microscopía Electrónica		https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
Serial EM	Universidad de Colorado Boulder		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Buque estándar Spearlab (transferencia dewar)	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
Pinzas	Ciencias de la Microscopía Electrónica		https://www.emsdiasum.com/style-3sa