Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .
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Artículo de método
In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos
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Resumen
Resumen
Las imágenes de calcio son una herramienta importante para monitorear los mecanismos de señalización que ingresan Ca2+ en el citosol o liberan Ca2+ de las reservas intracelulares de Ca2+ . El uso de ratones Pirt-GCaMP3, que tienen el sensor Ca2+ GCaMP3 insertado aguas abajo de la región promotora de Pirt y expresado en casi todas (>95%) neuronas sensoriales primarias, permite el monitoreo simultáneo de la actividad de >3,000 neuronas a través de imágenes de Ca2+ de neuronas sensoriales primarias del ganglio del trigémino (TG). Esto permite a los investigadores estudiar las respuestas de las redes neuronales a estímulos nocivos y respuestas somatosensoriales y hormonales in vivo, que de otro modo serían muy difíciles de detectar utilizando otros métodos.
Específicamente, la capacidad de monitorear el área TG que inerva la cara y otras áreas de la cabeza por separado permite monitorear las neuronas sensoriales primarias activadas por estímulos del área de la cara antes de las capas posteriores de procesamiento de neuronas. También se puede observar el número de neuronas que generan transitorios de Ca2+ y la amplitud de los transitorios de Ca2+ , que indican su sensibilidad a diferentes modalidades sensoriales. Además, los investigadores pueden medir el diámetro de las neuronas, que es un indicador del tipo de fibra activada (mecanofibras no nocivas frente a fibras nociceptivas nocivas, fibras Aβ, Aδ y C). Por lo tanto, las imágenes de calcio Pirt-GCaMP3 de TG serían una herramienta poderosa para diseccionar modalidades sensoriales específicas y tipos de células neuronales para estudiar el dolor de origen trigémino (dolor orofacial y craneofacial, dental y/o dental, dolor de cabeza, migraña, dolor de la articulación temporomandibular, neuralgia del trigémino), picazón y tacto y cualquier otra somatosensación, así como respuestas hormonales.
Introducción
Las neuronas sensoriales primarias inervan directamente los tejidos, incluida la piel, y transmiten señales sensoriales al sistema nervioso central (médula espinal o tronco encefálico). Las neuronas del ganglio del trigémino (TG) inervan la cabeza y responden a estímulos sensoriales, incluido el dolor de los dientes, la región periorbitaria, las regiones orofacial y craneofacial, la articulación temporomandibular 1,2 y las meninges 3,4,5. Las neuronas TG varían en tamaño, nivel de mie....
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos en este documento se realizan bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. La cirugía no es de supervivencia. Las secciones 1 y 2 de este procedimiento deben realizarse inmediatamente después de su inicio. La sección 3 puede realizarse en una fecha posterior.
1. Fijación y cirugía del ratón para la obtención de imágenes TG del lado derecho
NOTA: Los ratones Pirt-GCaMP3 C57BL/6J18 necesitan tener un tamaño corporal adulto (generalmente de 8 semanas o más), independiente....
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Resultados
Obtención de imágenes de un gran número de neuronas y ramas específicas del trigémino mediante exploración confocal del ganglio del trigémino Pirt-GCaMP
Después de la exposición quirúrgica a TG en ratones Pirt-GCaMP3, la microscopía confocal permite obtener imágenes de más de >3.000 neuronas simultáneamente (Figura 4). Esto proporciona la poderosa ventaja de observar miles de neuronas TG simultáneamente en su contexto fisiológico normal. Los transitorios espontáneos de.......
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Discusión
Los trastornos del dolor de la articulación temporomandibular y la periodontitis apical afectan aproximadamente al 5%36 y al 30-70%37,38 de la población general, respectivamente. Las neuronas sensoriales primarias detectan estímulos nocivos en la piel, la mucosa oral, los dientes y las regiones periorbitarias, y su plasticidad contribuye al dolor persistente. El cultivo celular y los explantes se pueden ut.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01NS0128574 y R01DE031477 (a YSK) y un premio Rising STAR del sistema de la Universidad de Texas (YSK).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Inyección anasada (xilacina) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| Objetivo Flurar 5x/0.25 M27 | Cal Zeiss | 420130-9900-000 | |
| Aplicadores con punta de algodón | Mckesson | 24-106-1S | |
| Hemostático curvo | Herramientas de ciencia fina | 13007-12 | |
| Controlador de temperatura de CC | FHC | 40-90-8D | |
| Almohadilla térmica del controlador de temperatura de CC | FHC | 40-90-2-05 | |
| Pinzas recubiertas de cerámica Dumont | Herramientas de ciencia fina | 11252-50 | |
| Controlador de temperatura FHC DC | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (Isoflurano) | MWI Salud Animal, Grupo Piramal | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Herramientas de ciencia fina | 16221-14 | |
| Espuma de gel | Pfizer | 09-0353-01 | |
| ImagenJ | Institutos Nacionales de Salud | ij153 | |
| Ketaset (ketamina) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Modelo 923-B Soporte para cabeza de anestesia con gas para ratones (ratón adulto) | Instrumentos Kopf | 923-B | |
| Cinta de escenario verde luminiscente | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Sistema de pieza de mano de laboratorio eléctrico compacto M35 | Fabricación dental de Buffalo Co., Inc. | M35 | |
| Matrx VIP 3000 Vaporizador de isoflurano | Marca media | 91305430 | |
| Tijeras de micro disección | Roboz | RS-5882 | |
| Tijeras de resorte de microdisección | Herramientas de ciencia fina | 15023-10 | |
| Tijeras de resorte de microdisección | Roboz | RS-5677 | |
| Mini sonda de termistor rectal | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Tijeras de operación | Roboz | RS-6812 | |
| Ratones Pirt-GCaMP3 C57/BL/6J | Universidad Johns Hopkins | N/A | Cualquiera de los sexos puede ser imaginado igualmente bien. Los ratones deben tener al menos 8 semanas de edad debido a la expresión débil o intermitente del promotor Pirt en ratones más jóvenes. |
| Cloruro de potasio | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Marco estereotáxico | Kopf Modelo 923-B | 923-B | |
| Mascarilla esterotáctica (activa) para ratones < 30g con tubos | Ciencias de la vida RWD | 68663 | |
| Fresa TNT de fisura cónica (31P) | Fabricación dental de Buffalo Co., Inc. | 31P-ORO | |
| ratones td-Tomato C57BL/6J | Laboratorio Jackson | 7909 | |
| Placa superior, 6in x 10in | Newport | 290-TP | |
| Pipeta de transferencia, 3 ml | Cole Parmer | UX-06226-23 | |
| Ratones TrpV1-Cre C57BL/6J | Laboratorio Jackson | 17769 | |
| Microscopio confocal Zeiss LSM 800 | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Edición Azul) 2.6 |
Referencias
- Kuramoto, E., et al. Three-dimensional topography of rat trigeminal ganglion neurons using a combination of retrograde labeling and tissue-clearing techniques. J Comp Neurol. 532 (2), e25584(2024).
- Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S.
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Reimpresiones y permisos
