Diseño de sistemas de fermentación en estado sólido para la producción de enzimas extracelulares hidrolíticas poliméricas por hongos filamentosos

Summary

Este protocolo utiliza salvado de trigo en un sistema rotativo de fermentación de estado sólido para mejorar la producción de enzimas. El sustrato, complementado con inductores como la quitina, favorece el crecimiento de hongos en condiciones controladas. Los resultados demuestran que los rendimientos enzimáticos son de 4 a 6 veces mayores en comparación con la fermentación sumergida, lo que demuestra la adaptabilidad y eficacia del método para diversas aplicaciones biotecnológicas.

Abstract

La fermentación en estado sólido (SSF) es un proceso de bioconversión que utiliza un sustrato sólido que no se disuelve en un medio acuoso. Los microorganismos crecen en la superficie del sustrato y penetran en su matriz sólida para extraer nutrientes esenciales para su desarrollo. SSF se caracteriza por un mínimo de agua libre, con un contenido de humedad del sustrato mantenido por encima del 70%, e involucra tres fases interconectadas: gaseosa, líquida y sólida. Este protocolo describe el uso de salvado de trigo, un subproducto agroindustrial, como sustrato base para la producción de enzimas en un sistema rotativo. El sustrato se complementa con un inductor, como quitina, quitosano, almidón o celulosa, para promover la síntesis de proteínas hidrolíticas. El sistema es altamente adaptable, lo que permite el uso de diferentes formas de hongos, incluidos micelio, esporas o gránulos. En la metodología descrita, el inductor y el sustrato se mezclan en una proporción de 1:100 (p/p), se esterilizan en autoclave y se ajustan al nivel de humedad deseado con agua estéril. A continuación, se añade el inóculo fúngico y el sistema rotativo funciona a 10 rpm para garantizar una mezcla y oxigenación adecuadas. El sistema se incuba durante 6-8 días en condiciones óptimas de crecimiento para hongos mesófilos o termófilos/termotolerantes, lo que mejora su versatilidad. Después de la incubación, la enzima se extrae fácilmente utilizando un tampón frío apropiado (por ejemplo, acetato, citrato o fosfato), según el tipo de enzima. El extracto se clarifica mediante centrifugación y filtración para obtener un sobrenadante libre de células. Luego, la enzima se puede concentrar o purificar aún más según sea necesario. Los resultados demostraron un aumento de 4 a 6 veces en la actividad enzimática en comparación con la fermentación sumergida (SmF), lo que pone de manifiesto la eficacia del sistema. Su adaptabilidad a diferentes sustratos, inductores y especies fúngicas lo convierte en una herramienta valiosa para diversas aplicaciones biotecnológicas.

Introduction

La fermentación en estado sólido (SSF) se ha convertido en una tecnología de bioconversión prometedora y sostenible para producir enzimas de alto valor, compuestos bioactivos y metabolitos secundarios. Esta técnica implica el crecimiento de microorganismos sobre sustratos sólidos con un mínimo de agua libre, simulando su entorno natural y permitiendo una actividad metabólica eficiente¹. El objetivo principal de este protocolo es optimizar la producción de enzimas a través de un sistema SSF rotativo que garantiza una mejor utilización del sustrato, difusión de oxígeno y escalabilidad del proceso. El empleo de sa....

Protocol

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del sustrato

NOTA: Utilice una marca comercial de salvado de trigo para minimizar las variaciones significativas en las características del sustrato. Cada lote de salvado de trigo varía debido a múltiples factores, lo que lo convierte en un material heterogéneo y difícil de estandarizar, lo que provoca fluctuaciones en su contenido constituyente. Si se requiere un material estandarizado, elija una matriz alternativa o realice un análisi....

Results

En la Figura 1A se presenta la representación esquemática del mezclador rotativo utilizado en este sistema, que tiene una capacidad para seis tubos cónicos de 50 mL. La Figura 2B ilustra los cambios que ocurren en el salvado de trigo durante el acondicionamiento antes de ingresar al proceso de fermentación en estado sólido. Como se ha observado, no se observaron cambios estructurales significativos.

En la Figura 2.......

Discussion

Este estudio describe un protocolo relevante para optimizar la producción de enzimas a través de sistemas de fermentación en estado sólido (SSF), diseñados específicamente para hongos filamentosos. A continuación, se discuten los aspectos críticos de la metodología, junto con su importancia, limitaciones y posibles aplicaciones.

El éxito del protocolo depende en gran medida de pasos clave como la preparación del sustrato y el inóculo. El lavado y el secado ade.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matraz Erlenmeyer de 125 ml	Sigma-Aldrich	CLS431684	Para cultivar micelio en medio líquido.
Tubo cónico de 50 ml	Sigma-Aldrich	CLS430921	Para almacenar y preparar sustratos e inóculo.
Tampón de acetato, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Para la extracción de quitinasa.
Filtros Centricon	Millipore	UFC905024	Para una mayor purificación de las enzimas.
Cámara de recuento de células	Sigma-Aldrich	Z359629	Se utiliza para contar esporas bajo un microscopio.
Papel de filtro	Whatman	1001-110	Para filtrar el extracto enzimático.
Higrómetro	Todomicro	-	Para medir la humedad relativa del sustrato.
Inductor (por ejemplo, quitina comercial)	Sigma-Aldrich	C9752	Se utiliza para mejorar la producción de enzimas durante la fermentación.
Tampón de fosfato, pH 6,9	Sigma-Aldrich	P5379	Para la extracción de amilasa.
Agar patata-dextrosa	Sigma-Aldrich	P2182	Medio de cultivo para el cultivo de micelio fúngico.
Caldo de patata y dextrosa	Sigma-Aldrich	P6685	Medio de cultivo líquido para el cultivo de micelio fúngico.
Mezclador rotativo	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	Para mantener el sustrato en movimiento durante la fermentación.
Componentes de la solución salina (p. ej., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Múltiple	Para preparar una solución salina estéril, consulte la receta detallada en el protocolo.
Salvado de trigo	Mercado comercial	-	Sustrato para fermentación en estado sólido.