Diseño de sistemas de fermentación en estado sólido para la producción de enzimas extracelulares hidrolíticas poliméricas por hongos filamentosos

Summary

Este protocolo utiliza salvado de trigo en un sistema rotativo de fermentación de estado sólido para mejorar la producción de enzimas. El sustrato, complementado con inductores como la quitina, favorece el crecimiento de hongos en condiciones controladas. Los resultados demuestran que los rendimientos enzimáticos son de 4 a 6 veces mayores en comparación con la fermentación sumergida, lo que demuestra la adaptabilidad y eficacia del método para diversas aplicaciones biotecnológicas.

Abstract

La fermentación en estado sólido (SSF) es un proceso de bioconversión que utiliza un sustrato sólido que no se disuelve en un medio acuoso. Los microorganismos crecen en la superficie del sustrato y penetran en su matriz sólida para extraer nutrientes esenciales para su desarrollo. SSF se caracteriza por un mínimo de agua libre, con un contenido de humedad del sustrato mantenido por encima del 70%, e involucra tres fases interconectadas: gaseosa, líquida y sólida. Este protocolo describe el uso de salvado de trigo, un subproducto agroindustrial, como sustrato base para la producción de enzimas en un sistema rotativo. El sustrato se complementa con un inductor, como quitina, quitosano, almidón o celulosa, para promover la síntesis de proteínas hidrolíticas. El sistema es altamente adaptable, lo que permite el uso de diferentes formas de hongos, incluidos micelio, esporas o gránulos. En la metodología descrita, el inductor y el sustrato se mezclan en una proporción de 1:100 (p/p), se esterilizan en autoclave y se ajustan al nivel de humedad deseado con agua estéril. A continuación, se añade el inóculo fúngico y el sistema rotativo funciona a 10 rpm para garantizar una mezcla y oxigenación adecuadas. El sistema se incuba durante 6-8 días en condiciones óptimas de crecimiento para hongos mesófilos o termófilos/termotolerantes, lo que mejora su versatilidad. Después de la incubación, la enzima se extrae fácilmente utilizando un tampón frío apropiado (por ejemplo, acetato, citrato o fosfato), según el tipo de enzima. El extracto se clarifica mediante centrifugación y filtración para obtener un sobrenadante libre de células. Luego, la enzima se puede concentrar o purificar aún más según sea necesario. Los resultados demostraron un aumento de 4 a 6 veces en la actividad enzimática en comparación con la fermentación sumergida (SmF), lo que pone de manifiesto la eficacia del sistema. Su adaptabilidad a diferentes sustratos, inductores y especies fúngicas lo convierte en una herramienta valiosa para diversas aplicaciones biotecnológicas.

Introduction

La fermentación en estado sólido (SSF) se ha convertido en una tecnología de bioconversión prometedora y sostenible para producir enzimas de alto valor, compuestos bioactivos y metabolitos secundarios. Esta técnica implica el crecimiento de microorganismos sobre sustratos sólidos con un mínimo de agua libre, simulando su entorno natural y permitiendo una actividad metabólica eficiente¹. El objetivo principal de este protocolo es optimizar la producción de enzimas a través de un sistema SSF rotativo que garantiza una mejor utilización del sustrato, difusión de oxígeno y escalabilidad del proceso. El empleo de salvado de trigo, un subproducto agroindustrial abundante, como sustrato base, contribuye a la valorización de los residuos agrícolas y promueve prácticas de bioeconomía circular².

La SSF tiene ventajas significativas sobre la fermentación sumergida (SmF), incluido un menor consumo de energía y agua, una mayor concentración de producto y compatibilidad con una amplia gama de residuos agrícolas económicos como el salvado de trigo, la cáscara de arroz y el bagazo de caña de azúcar³. A diferencia del SmF, que requiere grandes volúmenes de agua y costosos medios nutritivos, los sistemas SSF aprovechan matrices sólidas que no solo sirven como superficies de crecimiento microbiano, sino que también proporcionan nutrientes esenciales para la actividad microbiana. Además, el agua libre limitada en SSF minimiza los riesgos de contaminación, lo que la convierte en una opción más robusta para la producción de enzimas en entornos industriales⁴. Además de sus ventajas operativas, la SSF presenta importantes beneficios medioambientales y económicos en comparación con la fermentación sumergida (SmF). Los estudios han informado que SSF reduce el consumo de agua entre un 50% y un 70% y reduce los costos de energía en más del 30% debido a la ausencia de grandes volúmenes de agua que requieren agitación y aireación constantes. Además, el uso de residuos agroindustriales como sustratos minimiza los costos de las materias primas y promueve prácticas de economía circular al reutilizar los subproductos agrícolas ^2,4.

SSF ha sido ampliamente validado por su eficiencia y escalabilidad. Por ejemplo, los estudios han reportado un aumento de 4-6 veces en la actividad enzimática utilizando SSF en comparación con SmF, destacando las ventajas económicas y ambientales de esta técnica ^2,5. Además, el proceso posterior se simplifica, ya que la extracción de enzimas suele requerir menos agua y menos pasos de purificación. Esto hace que SSF sea particularmente atractivo para las industrias que buscan reducir los costos operativos y el impacto ambiental⁶.

El sistema SSF rotativo descrito en este protocolo ofrece varias mejoras con respecto a los métodos SSF estáticos tradicionales. Si bien los sistemas estáticos a menudo enfrentan desafíos como la colonización desigual del sustrato y la limitación de oxígeno, la configuración rotativa garantiza una mezcla y aireación completas, promoviendo un crecimiento microbiano uniforme ^7,8,9. Por ejemplo, este sistema se ha empleado con éxito para producir enzimas hidrolíticas como quitinasas, amilasas y proteasas utilizando especies fúngicas como Aspergillus y Trichoderma².

Una característica clave de este sistema SSF es su adaptabilidad. El uso de salvado de trigo como sustrato base demuestra el potencial de los residuos agroindustriales para una bioconversión rentable³. Además, la suplementación del sustrato con inductores como la quitina, el quitosano y el almidón mejora aún más la síntesis de enzimas al estimular vías metabólicas específicas ^2,10. El sistema también es compatible con diferentes formas de hongos, incluidas esporas, micelio y gránulos, lo que permite a los usuarios adaptar el proceso a^{sus requisitos específicos}.

La SSF ofrece un amplio potencial de aplicación en diversos campos, como la biotecnología alimentaria, la producción de biocombustibles y la remediación ambiental¹¹. Su integración de sustratos rentables, rendimientos enzimáticos excepcionales y alta flexibilidad de proceso establece a SSF como un enfoque esencial para las innovaciones biotecnológicas a escala industrial.

Protocol

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del sustrato

NOTA: Utilice una marca comercial de salvado de trigo para minimizar las variaciones significativas en las características del sustrato. Cada lote de salvado de trigo varía debido a múltiples factores, lo que lo convierte en un material heterogéneo y difícil de estandarizar, lo que provoca fluctuaciones en su contenido constituyente. Si se requiere un material estandarizado, elija una matriz alternativa o realice un análisis químico próximo de cada lote de salvado de trigo para ajustarlo de acuerdo con las necesidades.

1. Lave el salvado de trigo tres veces con agua destilada estéril para eliminar los residuos de materia orgánica, los desechos y el polvo. Esto también elimina los azúcares simples que podrían interferir con la fermentación.
2. Extienda el salvado lavado en una bandeja de aluminio y séquelo en un horno a 60 °C durante 24 h.
3. Una vez seco, coloque el salvado de trigo en un tubo cónico estéril de 50 mL.

2. Preparación del inóculo

NOTA: Este protocolo describe tres métodos para la preparación del inóculo: suspensión de esporas, inoculación directa con discos de micelio y suspensión celular. Establezca la concentración inicial de inóculo y cuantifique los niveles de proteínas para obtener cálculos precisos del rendimiento.

1. Preparación de la suspensión de esporas
   1. Transfiera un disco de agar de 5 mm de diámetro saturado con micelio a una placa de agar dextrosa de papa fresca. Incubar la placa a 28 °C durante 5-7 días, o hasta que el micelio sature el medio. Algunos hongos pueden requerir un tiempo de incubación más largo.
   2. Agregue 5 mL de agua destilada estéril a la placa y separe mecánicamente las esporas usando un asa estéril.
   3. Prepare una dilución 1:100 de la suspensión de esporas. Coloque 10 μL en el centro de una cámara de Neubauer y cuente las esporas bajo un microscopio. Calcule la concentración de esporas (esporas/mL) en función del factor y la dilución de la cámara.
2. Cultivo de micelio en medio líquido
   1. Transfiera un disco de agar de 5 mm saturado con micelio a una placa de agar patata-dextrosa fresca e incube a 28 °C hasta la saturación.
   2. Preparar 25 mL de caldo de patata y dextrosa en un matraz estéril de 125 mL y autoclave.
   3. Transfiera un disco de micelio de 5 mm de la placa saturada al caldo estéril.
   4. Incubar el matraz en un agitador a 125 rpm durante 24-48 h, dependiendo de la cepa fúngica. Prolongar el tiempo de incubación de los hongos de crecimiento lento.
   5. Recoja 2 mL para el inóculo y 2 mL para la determinación del peso seco.
3. Inoculación directa de discos de micelio
   1. Coloque un disco de agar de 5 mm saturado con micelio en un plato de patata-dextrosa-agar fresco. Incubar a 28 °C hasta la saturación.
   2. Utilice un disco de micelio como inóculo y otro para determinar el peso seco.

3. Preparación del sistema SSF

NOTA: Los inductores pueden ser naturales o comerciales. Se prefieren los inductores comerciales purificados para minimizar las impurezas que podrían alterar la eficiencia de la fermentación. Ajuste las adiciones de agua para mantener una humedad relativa de al menos el 90%.

1. Combine los siguientes componentes en un tubo cónico estéril de 50 mL: 5 g de salvado de trigo seco; 0,2 g del inductor (por ejemplo, quitina comercial); 5,5 mL de agua (ajustar en función de la capacidad de absorción de agua del inductor); 5 mL de una solución salina estéril que contiene 16 g/L de fosfato de potasio monobásico, 4 g/L de sulfato de sodio, 2 g/L de cloruro de potasio, 1 g/L de cloruro de calcio, 400 mg/L de cloruro de zinc, 60 mg/L de ácido bórico, 40 mg/L de molibdato de sodio, 150 mg/L de cloruro de magnesio, 100 mg/L de cloruro férrico y 400 mg/L de sulfato de cobre.
2. Mida la humedad relativa con un higrómetro basado en electrodos, asegurando un mínimo de 90% de humedad. Inserte la sonda del electrodo directamente en el reactor a diferentes profundidades para obtener una medición representativa de la distribución de la humedad.
   1. Siga los pasos para ajustar la humedad si está por debajo del 90%:
      1. Añadir gradualmente agua destilada estéril en incrementos de 1 mL por cada 10 g de sustrato. Después de cada adición, mezcle bien para asegurar una distribución uniforme de la humedad.
      2. Deje que el sustrato se equilibre durante 10-15 min. Vuelva a medir el nivel de humedad.
      3. Repita los pasos anteriores hasta alcanzar la humedad objetivo del 90%. Evite humedecer demasiado el sustrato durante todo el proceso.
   2. Siga los pasos para ajustar la humedad si está por encima del 90%:
      1. Extienda el sustrato finamente en un ambiente estéril. Elimine el exceso de humedad (1) exponiendo el sustrato al flujo de aire laminar o (2) colocándolo en una cámara de secado a 30 °C durante 10-15 min.
      2. Alternativamente, mezcle suavemente el sustrato para promover una redistribución uniforme de la humedad. Después del tratamiento, vuelva a evaluar el nivel de humedad.
      3. Repita el paso de secado o mezcla según sea necesario hasta que la humedad alcance el 90%. Proceda con la fermentación solo una vez que se alcance la humedad objetivo.
3. Autoclave el tubo a 15 psi durante 15 min.
4. Después de enfriar, inocule el sustrato con uno de los siguientes: 1 mL de suspensión de esporas (1 x 10^6-1 x 10⁷ esporas/mL), 2 mL de suspensión celular o un disco de micelio de 5 mm.

4. Procedimiento de fermentación en estado sólido (SSF)

NOTA: Para estudios cinéticos o evaluaciones de parámetros en diferentes momentos, prepare tubos separados para cada punto de tiempo para garantizar la representatividad.

1. Evite la aglomeración del sustrato mediante el vórtice de los tubos a máxima velocidad durante 5 minutos en ciclos de 1 minuto.
2. Coloque los tubos en un mezclador giratorio con un eje horizontal. Asegúrese de que el sustrato se mueva libremente dentro de los tubos. Configure el mezclador para que funcione a 10 rpm.
3. Incubar el mezclador en una incubadora a la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo. Mantenga la temperatura informada para una actividad enzimática óptima cuando utilice inductores sensibles al calor.

5. Extracción de enzimas

NOTA: Los fundamentos de la extracción se basan en la solubilidad y la actividad máxima del pH de la enzima extracelular. Como SSF evita el medio acuoso, la enzima extracelular está involucrada en el agua que rodea la matriz sólida, lo que significa que la concentración es mayor que en SmF. En este contexto, la selección del mejor tampón de extracción depende del conocimiento de la actividad deseada. La optimización de las extracciones depende de la concentración final de la enzima y del tipo de tampón de extracción utilizado.

1. Después del período de fermentación deseado, vuelva a suspender el sustrato en 20 mL de tampón preenfriado. Algunos ejemplos son: tampón de acetato 0,1 M, pH 5,6, para la extracción con quitinasa; Tampón de fosfato 0,02 M, pH 6,9, para la extracción de amilasa.
2. Vórtice los tubos en ciclos: 1 min a velocidad máxima, seguido de 1 min en hielo. Repite 10 veces.
3. Filtrar la suspensión mediante filtros de papel y extraer mecánicamente el sobrenadante mediante prensado.
4. Clarificar el sobrenadante centrifugando a 3000 x g durante 15 min a 4 °C.
5. Utilice el extracto crudo directamente o purifique aún más la enzima mediante cromatografía en columna o filtros centrífugos. También se recomiendan estudios cinéticos para determinar la constante de Michaelis (Km) y la tasa máxima de transformación enzimática (Vmax)¹².

6. Proceso de optimización

NOTA: Optimice este protocolo evaluando y ajustando la calidad y concentración de los inductores, así como el tipo y la concentración del inóculo.

1. Determine el tiempo de fermentación ideal y perfeccione los pasos de extracción para mejorar la eficiencia.
2. Controle y ajuste las condiciones ambientales, incluida la temperatura, el pH y la aireación.
3. Pruebe varios tampones y condiciones de extracción para mejorar el rendimiento y la estabilidad de las enzimas.
4. Realizar análisis estadísticos, como la metodología de superficie de respuesta, para identificar las variables más influyentes y lograr una producción óptima de enzimas.

Results

En la Figura 1A se presenta la representación esquemática del mezclador rotativo utilizado en este sistema, que tiene una capacidad para seis tubos cónicos de 50 mL. La Figura 2B ilustra los cambios que ocurren en el salvado de trigo durante el acondicionamiento antes de ingresar al proceso de fermentación en estado sólido. Como se ha observado, no se observaron cambios estructurales significativos.

En la Figura 2...

Discussion

Este estudio describe un protocolo relevante para optimizar la producción de enzimas a través de sistemas de fermentación en estado sólido (SSF), diseñados específicamente para hongos filamentosos. A continuación, se discuten los aspectos críticos de la metodología, junto con su importancia, limitaciones y posibles aplicaciones.

El éxito del protocolo depende en gran medida de pasos clave como la preparación del sustrato y el inóculo. El lavado y el secado ade...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matraz Erlenmeyer de 125 ml	Sigma-Aldrich	CLS431684	Para cultivar micelio en medio líquido.
Tubo cónico de 50 ml	Sigma-Aldrich	CLS430921	Para almacenar y preparar sustratos e inóculo.
Tampón de acetato, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Para la extracción de quitinasa.
Filtros Centricon	Millipore	UFC905024	Para una mayor purificación de las enzimas.
Cámara de recuento de células	Sigma-Aldrich	Z359629	Se utiliza para contar esporas bajo un microscopio.
Papel de filtro	Whatman	1001-110	Para filtrar el extracto enzimático.
Higrómetro	Todomicro	-	Para medir la humedad relativa del sustrato.
Inductor (por ejemplo, quitina comercial)	Sigma-Aldrich	C9752	Se utiliza para mejorar la producción de enzimas durante la fermentación.
Tampón de fosfato, pH 6,9	Sigma-Aldrich	P5379	Para la extracción de amilasa.
Agar patata-dextrosa	Sigma-Aldrich	P2182	Medio de cultivo para el cultivo de micelio fúngico.
Caldo de patata y dextrosa	Sigma-Aldrich	P6685	Medio de cultivo líquido para el cultivo de micelio fúngico.
Mezclador rotativo	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	Para mantener el sustrato en movimiento durante la fermentación.
Componentes de la solución salina (p. ej., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Múltiple	Para preparar una solución salina estéril, consulte la receta detallada en el protocolo.
Salvado de trigo	Mercado comercial	-	Sustrato para fermentación en estado sólido.