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Artículo de método

Evaluación del impacto del cadmio en el estado redox y el perfil metabólico del erizo de mar Paracentrotus lividus

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DOI:

10.3791/68300

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29 de julio de 2025

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1Higher Institute of Biotechnology - Sidi Thabet, Laboratory of Biotechnology and Valorization of Bio-Geo-Resources, University Manouba, 2Faculty of Sciences of Tunis, Laboratory of Ecology, Biology and Physiology of Aquatic Organisms LR, University Tunis El Manar, 3Laboratory of Mass Spectrometry, National Institute of Research and Physical-Chemical Analysis (INRAP) Biotechpole Sidi Thabet, 4Department of Chemistry, College of Sciences at Bisha, University of Bisha, 5Department of Applied Medical Sciences, Applied College at Bisha, University of Bisha

En este artículo

Resumen

Este protocolo destaca los métodos de extracción y caracterización de compuestos bioactivos del erizo de mar Paracentrotus lividus (Echinoderm), así como la determinación de los parámetros de estrés oxidativo después de la exposición al cadmio.

Resumen

El cadmio (Cd) es uno de los metales pesados más dañinos para los organismos acuáticos y un contaminante generalizado en la biota marina. Debido a su alta biodisponibilidad, persistencia y capacidad de bioacumulación, el cadmio (Cd), un metal pesado tóxico descargado por la escorrentía minera, las descargas industriales y los insumos agrícolas, es uno de los contaminantes más perjudiciales para los organismos acuáticos y un contaminante común en la biota marina. El presente estudio evaluó los efectos potencialmente tóxicos del cadmio sobre los biomarcadores de estrés oxidativo y los perfiles de metabolitos en gónadas de Paracentrotuslividus expuestas a un rango de concentraciones (0,0183, 0,183 y 1,83 mg/L) durante 96 h. Los resultados mostraron que el Cd indujo estrés oxidativo al aumentar los niveles de malondialdehído, peróxido de hidrógeno e hidroperóxido lipídico en comparación con el grupo de control, así como al aumentar las actividades antioxidantes (glutatión y catalasa reducidos). Además, con base en el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas, se identificaron 74 metabolitos en los extractos gonadales de los erizos de mar tratados y el control. El análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales reveló una clara separación de clases y discriminó nueve metabolitos relevantes a través de las puntuaciones VIP. El análisis del mapa de calor realizado destacó la alteración en los niveles de esteroles y compuestos de ácidos grasos como Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)-, Desmosterol y (23S)-etilcolest-5-en-3.beta.-ol y ácido eicosapentaenoico (EPA), así como las defensas antioxidantes como el ácido retinoico y la regulación de esteroides como Pregna-5-en-20-ona, 3-hidroxi-,(3β). En general, nuestros datos revelaron la alta sensibilidad de las gónadas al Cd, incluso a concentraciones relativamente bajas.

Introducción

El medio marino también puede considerarse un sumidero importante para varios productos químicos tóxicos, como los metales pesados. Debido a su lipofilia, estos elementos tienden a unirse con las partículas en suspensión y se acumulan progresivamente en los sedimentos marinos, donde muestran una disminución de la movilidad y la biodisponibilidad. Como resultado, los sedimentos marinos sirven como un importante sumidero de metales pesados1. Entre estos contaminantes, el cadmio (Cd) ha sido reconocido durante mucho tiempo como un importante contaminante mundial del agua que amenaza los ecosistemas y subiota relacionada. Un tercio del Cd presente en los ecosistemas acuáticos proviene de la fabricación y el uso de fertilizantes fosfatados2. Otras fuentes de liberación de Cd al medio ambiente incluyen el sector minero, las empresas de galvanoplastia y los procesos naturales de la corteza terrestre. Este contaminante está muy extendido debido a su capacidad para ser transportado fácilmente a través de medios acuosos y su movilidad comparativamente grande en contraste con otros metales pesados2. Según la literatura, las concentraciones de Cd varían entre 12 y 16 x 10−3 μg/L enel Mar Báltico4, y entre 13,4 x 10−3 y 1,49 μg/L en un emplazamiento muy contaminado a lo largo de las costas gallegas (noroeste de la Península Ibérica)5. Se registraron niveles mucho más elevados de Cd en algunas áreas contaminadas del Mar Mediterráneo, donde las concentraciones pueden alcanzar 80,4 x 10-3 μg/L cerca de la isla de Sicilia (Italia)6, y 48 μg/L en el Golfo de Gabès (Túnez)7. Este metal de transición persistente, bioacumulativo y no esencial es reconocido por su capacidad para causar graves problemas de salud tanto para los organismos humanos como para los acuáticos8. El Cd puede ejercer directamente su toxicidad al unirse a las proteínas, inhibir las actividades enzimáticas e interferir con la homeostasis del calcio9. También puede actuar indirectamente a través de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que provoca daño oxidativo en biomoléculas como lípidos, proteínas y ADN10. Varios estudios científicos han informado que la contaminación por Cd puede desencadenar trastornos estructurales y funcionales en organismos acuáticos11.

Al igual que con los otros invertebrados bentónicos marinos, los erizos de mar están particularmente expuestos a la contaminación marina. A pesar de su capacidad para acumular altos niveles de metales pesados, los erizos de mar pueden hacer frente a la contaminación por metales y resistir en ambientes contaminados12. Así, son comúnmente reconocidos como organismos centinela y son ampliamente utilizados como modelos para estudios ecotoxicológicos y ambientales13. Numerosos estudios han investigado el impacto de la exposición al Cd en varias especies de erizos de mar en diferentes etapas de la vida, incluidos organismos adultos, embriones y larvas13. Se encontró que la exposición al Cd puede resultar en una variedad de efectos adversos que van desde la reducción de la tasa de fertilización del óvulo, anomalías en el desarrollo de embriones y larvas, estrés oxidativo, hasta apoptosis y autofagia13. La mayor parte de la literatura disponible se centra en el efecto del Cd en los embriones en desarrollo de erizos de mar13,14; Sin embargo, solo se han realizado unos pocos estudios15para comprender los efectos de este metal en el perfil metabólico de los erizos de mar adultos, y no se dispone de información sobre el metabolismo de los lípidos.

La exposición continua de embriones de Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816) a concentraciones subagudas / subletales de cadmio causa un desarrollo anormal con defectos en el alargamiento y el patrón del esqueleto, junto con una reducción general de la síntesis de proteínas y la expresión diferencial de metalotioneína16.

El método propuesto mejora la evaluación de la toxicidad del cadmio (Cd) y el estrés oxidativo en organismos marinos mediante la combinación de ensayos bioquímicos con perfiles metabolómicos dirigidos y no dirigidos mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). En comparación con los enfoques tradicionales que se basan únicamente en biomarcadores únicos, como la peroxidación lipídica o las actividades enzimáticas antioxidantes (p. ej., SOD, CAT), la adición de la detección de metabolitos basada en GC-MS proporciona una huella bioquímica completa del estado fisiológico del organismo17. Esta integración permite una detección más sensible y sistémica de los efectos subletales, incluso a bajas concentraciones de Cd, y puede detectar perturbaciones tempranas en el metabolismo energético, el recambio de aminoácidos y las vías oxidativas que ocurren antes del daño toxicológico observable. Es importante destacar que este método complementa las evaluaciones toxicológicas existentes al proporcionar datos de mayor resolución y permitir la identificación de nuevos biomarcadores que los ensayos tradicionales pueden pasar por alto18. También promueve la comprensión mecanicista a través del análisis a nivel de vía, lo que mejora los modelos predictivos de ecotoxicología19. Este método detecta la exposición al cadmio en el rango de 1-100 μg/L, lo que es relevante para los sistemas costeros y estuarinos contaminados20. El enfoque es más apropiado para exposiciones controladas de laboratorio o estudios de campo moderadamente complejos. Sin embargo, la interpretación puede ser difícil en matrices altamente contaminadas donde múltiples factores estresantes (por ejemplo, metales pesados, HAP, contaminantes emergentes) interactúan y potencialmente confunden la especificidad del biomarcador. A pesar de esto, cuando se diseña adecuadamente, la robustez y especificidad de GC-MS, combinadas con el análisis de datos multivariados (por ejemplo, PCA, PLS-DA), proporcionan un fuerte poder discriminatorio para resolver los efectos superpuestos.

Esta plataforma bioquímica-metabolómica integrada es particularmente útil para el seguimiento de especies centinela y las evaluaciones de riesgos ecológicos en marcos como la Directiva Marco sobre la Estrategia Marina (DMEM) y es coherente con los esfuerzos actuales para avanzar en el seguimiento ambiental basado en ómicas21.

En el presente estudio, utilizamos el erizo de mar púrpura P. lividus, que es una de las especies más explotadas y económicamente significativas en toda la costa atlántica y mediterránea22, para evaluar el efecto de la contaminación por Cd sobre el estado redox y el perfil metabolómico de las gónadas.

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Protocolo

1. Muestras y diseño experimental

  1. Recoger un total de 40 ejemplares adultos de erizos de mar P. lividus (20 machos y 20 hembras, longitud media: 45 ± 4 mm, edad media: 2,0 ± 0,5 años, peso medio: 22,54 ± 2,50 g) por buceadores en el rango de profundidad de 5-7 m en mayo de 2023 en las costas de Bizerta (Mar Mediterráneo, Túnez).
  2. Transfiera los erizos de mar recolectados P. lividus de sexo mixto, edad estimada aproximadamente 12-18 meses según el tamaño al laboratorio y manténgalos en agua de mar natural aireada de 16 ± 1 ° C con salinidad natural de ~ 38 PSU, pH de 7.8-8.0 y fotoperíodo de 12:12. Monitoree los parámetros diariamente durante todo el período de exposición para garantizar la estabilidad ambiental y minimizar la variación externa.
  3. Inyecte 1 ml de KCl 0,5 M en la región periestomal para inducir el desove e identificar visualmente los gametos. Enjuague a los individuos con agua de mar filtrada y aclimate durante 3 días en condiciones controladas sin provisión de alimentos.
  4. Divida aleatoriamente los erizos de mar en cuatro grupos de nueve individuos (tres individuos por tanque por triplicado) y asígnelos en acuarios de vidrio de 50 L. Determinar el tamaño de la muestra en base a estudios publicados previamente23,24 que evaluaron biomarcadores de estrés oxidativo y respuestas metabolómicas en invertebrados marinos y utilizar réplicas biológicas comparables o menos.
    NOTA: Este nivel de replicación garantiza una fuerte representación biológica y resultados estadísticamente significativos.
  5. Exponer a los animales durante 96 h durante 96 h a un rango de concentraciones de cloruro de cadmio (CdCl2) de la siguiente manera: Grupo I (Ctrl): erizos de mar mantenidos en agua no CdCl2; Grupo II (Tr1): erizos de mar expuestos a una concentración de CdCl2de 0,0183 mg/L; Grupo III (Tr2): erizos de mar expuestos a una concentración de CdCl2de 0,183 mg/L; Grupo IV (Tr3): erizos de mar expuestos a una concentración de CdCl2de 1,83 mg/L.
  6. Para mantener la estabilidad del agua durante el experimento, cambie el 50% del agua cada 24 h, retire el agua con cuidado con un sifón y reemplácela con agua recién preparada manteniendo las concentraciones de CdCl2.

2. Preparación de tejidos

  1. Realizar, utilizando el protocolo descrito por Telahigue et al.23, la preparación de los homogeneizados de tejido de erizo de mar.
  2. Diseccionar en hielo los erizos de mar de cada grupo al final del experimento. Use tijeras estériles para hacer un corte circular alrededor de la boca para abrir la prueba.
  3. Retire con cuidado las cinco gónadas con una espátula y guárdelas para un análisis posterior. Lavar con agua destilada fría para eliminar los residuos y los contaminantes de la superficie
  4. Homogeneizar utilizando un sonicador de sonda ajustado al 40% de amplitud, en 3 ráfagas de 10 s cada una con 20 s de descanso entre ráfagas, 300 mg de fracciones de gónadas con tampón Tris-HCl (20 mM, pH 7,4) en condiciones de frío.
  5. Divida cada muestra de gónada en dos porciones: una para análisis bioquímico (fresca) y otra para análisis metabolómico (liofilizada).
  6. Centrifugar a 10.000 x g durante 20 min. Almacenar los sobrenadantes a - 80 °C para el análisis de parámetros bioquímicos.
  7. Liofilizar otras fracciones de gónadas usando un liofilizador antes del análisis GC-MS. Mantener durante 48 h a -50 °C con un vacío inferior a 0,1 mbar hasta que se haya completado el secado total.
  8. Utilice el método de Lowry para determinar el contenido total de proteínas de cada muestra utilizando BSA como estándar. Determine el nivel de LOOH a 560 nm y expréselo como mmol / mg de proteína.
    NOTA: Esta cuantificación se realizó antes de todos los ensayos bioquímicos para normalizar los niveles de biomarcadores.

3. Ensayo de glutatión reducido

  1. Estimar el contenido reducido de glutatión (GSH) según el método de Ellman25, basado en la absorbancia del ácido 2-nitro-5-mercaptúrico resultante de la reducción del ácido 5-50-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB) por el grupo tiol (SH) del glutatión.
  2. Centrifugar a 1600 x g durante 15 min una mezcla de homogeneizados de tejido en tampón fosfato y ácido sulfosalicílico (4%).
  3. Tome un volumen de 500 μL del sobrenadante obtenido y agréguelo al reactivo de Ellman (DNTB) con 0,025 mL. Lea a 412 nm la absorbancia de la mezcla resultante.
  4. Evalúa el contenido de GSH en mg por g de tejido. Exprese el contenido total de GSH como μg/mg de tejido. Calcule los niveles de GSH utilizando una curva de calibración estándar basada en concentraciones conocidas de glutatión reducido.
    NOTA: El objetivo es cuantificar el glutatión reducido (GSH) en homogeneizados gonadales como marcador de estrés oxidativo después de la exposición al cadmio.

4. Actividad catalasa

  1. Realice la configuración de la reacción de acuerdo con el método de Aebi26. Preparar el medio de reacción compuesto por 2,9 ml de tampón de fosfato 100 mM (pH 7,4) y 20 μl de sobrenadante de tejido gonadal. Preequilibre el medio de reacción a temperatura ambiente.
  2. Inicie la reacción añadiendo 80 μL de solución de peróxido de hidrógeno 0,5 M (H2O2) recién preparada a la cubeta. Mezcle inmediatamente bien el contenido y registre la disminución de la absorbancia a 240 nm durante 1 mi a intervalos de 10 s utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.
  3. Calcule la actividad CAT en función de la tasa de descomposición de H2O2, determinada mediante el monitoreo de la disminución de la absorbancia a 240 nm a lo largo del tiempo. Utilice la siguiente fórmula: Actividad CAT = (ΔA / min x V) / (ε x l x C)
    donde: ΔA/min = cambio en la absorbancia por minuto a 240 nm, V = volumen total del ensayo (en L), ε = coeficiente de extinción molar de H2O2 (43,6 M-1/cm), l = longitud del trayecto de la cubeta (generalmente 1 cm), C = concentración de proteína en mg/mL.
  4. Utilice el coeficiente de extinción molar de 43,6 M/cm. Exprese la actividad de CAT como nmol H2O2 descompuesto por minuto por mg de proteína (nmol H2O2 / min / mg de proteína).
    NOTA: El objetivo es cuantificar la actividad de la catalasa en homogeneizados gonadales de P. lividus como una medida de la respuesta enzimática antioxidante a la exposición al cadmio.

5. Medición de la generación de peróxido de hidrógeno

  1. Medir los niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2) en las gónadas de P. lividus utilizando el ensayo de oxidación ferrosa-xilenol naranja de acuerdo con el método descrito por Ou y Wolff27.
  2. Determine la concentración de H2O2en el sobrenadante usando un espectrofotómetro a 560 nm. Exprese los resultados como nmol/mg de proteína.

6. Ensayo de malondialdehído

  1. Prepare muestras como se describe en el método de Draper y Hadley28. Mezclar 500 μL de homogeneizado de gónadas con 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) al 10%. Centrifugar a 2500 x g durante 10 min a 4 °C.
  2. Transfiera 1 ml del sobrenadante resultante a un tubo nuevo y agregue 1 ml de solución TBA al 0,67%. Incubar la mezcla en un baño de agua a 100 °C durante 15 min.
  3. Enfríe las muestras a temperatura ambiente. Mida la absorbancia a 532 nm con un espectrofotómetro.
  4. Reste la absorbancia de fondo utilizando un reactivo en blanco (TBA + TCA sin extracto de tejido). Prepare una curva estándar usando 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP) y exprese la concentración de MDA como proteína nmol/mg.

7. Medición de hidroperóxido lipídico

  1. Medir el hidroperóxido lipídico (LOOH) en tejidos de gónadas utilizando el ensayo de oxidación ferrosa en naranja xilenol, como se describe por el método de Jiang et al.29.
    NOTA: El objetivo es evaluar los niveles de peroxidación lipídica en los tejidos gonadales mediante la cuantificación del malondialdehído (MDA), un subproducto del daño oxidativo de la membrana.

8. Extracción de compuestos bioactivos de gónadas y cribado analítico

  1. Realice la extracción metanólica de compuestos lipofílicos por triplicado del tejido gonadal seco de cada grupo por triplicado sumergiendo el material en metanol de grado analítico (≥99,8%; 1:25 p/v) en un agitador rotatorio a 150 rev/min a temperatura ambiente.
  2. Centrifugar todos los extractos durante 15 min a 700 x g, 4 °C, después de la evaporación de las fracciones de MeOH por evaporación rotativa a una temperatura de baño de agua de 40 °C y una velocidad de rotación ajustada a 100 rpm. Vuelva a suspender el extracto crudo en 1 ml de MeOH y guárdelo en viales sellados a 4 °C.

9. Cromatografía de gases-análisis de espectrometría de masas de extractos gonadales

  1. Hacer una alícuota de 500 μL en un vial utilizando el extracto metanólico que se ha almacenado.
  2. Realizar análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) en un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas. La columna de GC fue de 5 %-fenil-metilsiloxano: 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm de espesor de película.
  3. Utilice helio como gas portador a un caudal constante de 1 ml/min. Ajuste el volumen de inyección a 1 μL en el modo dividido en una proporción de 100:1. Programe la temperatura del horno de 4 a 280 °C a 5 °C/min.
  4. Opere el espectrómetro en modo de impacto de electrones (EI), la energía de ionización fue de 72 eV, la temperatura de la fuente de iones fue de 250 ° C, el tiempo de escaneo de 1 s y el rango de masa de 45-550 uma.
  5. Realice la identificación de compuestos mediante la comparación de sus espectros de masas con los de la Biblioteca NIST98MS y la Base de Datos Willy Library275.

10. Análisis estadístico

  1. Evalúe primero el conjunto de datos para determinar la normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk y la homogeneidad de las varianzas mediante la prueba de Levene.
  2. Preprocese los datos con MetaboAnalyst 6.030, utilizando procedimientos de normalización estándar, transformación de logaritmos y escalado de Pareto para cumplir con los supuestos de ANOVA, como la distribución normal y la homogeneidad de la varianza.
  3. Realice un análisis estadístico multivariado utilizando Metaboanalyst, utilice el método de tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg para la corrección de múltiples pruebas para tener en cuenta los errores de tipo I relacionados con numerosas comparaciones bioquímicas y garantizar la solidez estadística.
  4. Utilice el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar los resultados entre grupos. Las diferencias entre medias se consideraron significativas cuando p <0,05.
  5. Utilice el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) para discriminar entre grupos comparables. Determine la importancia de la variable en la proyección (VIP) para todos los compuestos.
  6. Calcule los valores p utilizando la prueba t de Student pareada para el análisis estadístico unidimensional de variables estandarizadas.

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Resultados

La validez y eficacia de nuestros métodos se garantizaron mediante el uso de réplicas biológicas y técnicas, lo que permitió mediciones consistentes y confiables. Los ensayos demostraron una baja variabilidad, con desviaciones estándar típicamente inferiores al 10%, lo que indica una alta repetibilidad. Para garantizar una cuantificación precisa de los metabolitos, los análisis de GC-MS incluyeron curvas de calibración y patrones internos. Todas las técnicas utilizadas se basan en protoco...

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Discusión

Este estudio se planificó para evaluar el efecto tóxico del Cd en las gónadas de P. lividus del erizo de mar mediante el análisis de biomarcadores bioquímicos y metabolitos activos. La exposición de P. lividus a diferentes concentraciones de Cd produjo una respuesta de estrés oxidativo. Estos hallazgos son similares a informes anteriores que indican correlaciones cercanas entre el aumento de los niveles de antioxidantes en los terrenos de erizos de mar y los niveles de ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Decanato de Estudios de Posgrado e Investigación Científica de la Universidad de Bisha por apoyar este trabajo a través del Programa de Apoyo a la Investigación de Vía Rápida.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Liofilizador Liofilizador LiofilizadorBiobaseBK-FD12PTLiofilización
Cromatógrafo de gases Cromatógrafogases HP 6890Agilent TechnologiesDetector de ionización de llama (FID)
Columna GCAgilent TechnologiesHP-5 (5%-fenil)-metilsiloxanoNo polar  columna  que ofrece un rendimiento excelente en una amplia gama de aplicaciones
Espectrómetro de masasAgilent TechnologiesEspectrómetro de masas HP 5973Cuadrupolo MS
de de

Referencias

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