Técnica de biopsia conjuntival e inmunofluorescencia directa para el diagnóstico de penfigoide de mucosa

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para la recolección y procesamiento de la biopsia conjuntival para identificar el penfigoide de la membrana mucosa.

Resumen

El penfigoide de la membrana mucosa ocular (MMP) se presenta como una conjuntivitis cicatrizante crónica que, si no se trata, puede causar ceguera. El diagnóstico oportuno y la terapia inmunosupresora previenen la progresión de la enfermedad. La tinción directa con inmunofluorescencia (DIF) de la biopsia conjuntival para el depósito de complejos inmunitarios en la membrana basal es diagnóstica de MMP. La tasa de positividad de la biopsia depende de las características de la biopsia, la lateralidad, la edad avanzada y la actividad de la enfermedad. El presente artículo de métodos describe la técnica de recolección de la biopsia conjuntival y el uso de cartuchos de carga media a temperatura óptima de corte para la transferencia de muestras y la preparación de bloques. Una biopsia se realiza a partir de una región de la conjuntiva sin cicatrices, no comprometida o relativamente menos comprometida en ambos ojos. El tamaño habitual de la biopsia es de 4-5 mm de largo, 2-3 mm de ancho, y debe tener un pequeño tejido subconjuntival subyacente para que no se pierda la membrana basal. Recomendamos realizar la tinción de Schiff con ácido peryódico para confirmar la presencia de la membrana basal. Utilizando un protocolo específico, las criosecciones de las biopsias se tiñen con anticuerpos conjugados fluorescentes IgG, IgM, IgA y factores del complemento C3c y C4c. Una biopsia positiva muestra la fluorescencia verde positiva en la membrana basal, e incluso si uno de los anticuerpos es positivo, es MMP positivo. Una biopsia negativa no descarta penfigoide; sin embargo, un resultado positivo confirma la MMP y la diferencia de la conjuntivitis cicatrizante inducida por fármacos o del pseudopemphigoide.

Introducción

El penfigoide de la membrana mucosa (MMP) es una enfermedad conjuntival cicatrizante crónica de etiología autoinmune y afecta a las membranas mucosas del organismo ^1,2. La conjuntivitis cicatrizante crónica tiene diferentes etiologías, siendo necesaria la diferenciación de la MMP del SJS, la sarcoidosis, la neoplasia escamosa ocular y el pseudopenfigoide, ya que la primera requiere inmunosupresión sistémica ^3,4. Además, la MMP es una enfermedad potencialmente cegadora en la que los pacientes a menudo se presentan tarde y son diagnosticados erróneamente inicialmente ^1,2,5. Solo la afectación ocular sin afectación sistémica puede observarse en el 27,4% de los pacientes con MMP ocular⁶. El diagnóstico de MMP requiere una biopsia conjuntival para mostrar la presencia de autoanticuerpos en la membrana basal ^2,5. La inmunofluorescencia directa (DIF) es una herramienta diagnóstica fundamental para identificar enfermedades autoinmunes que afectan a la conjuntiva, como la MMP. DIF ayuda a detectar la deposición in situ de inmunoglobulinas y componentes del complemento en la zona de la membrana basal (BMZ), una característica de la MMP. Las tasas de positividad del DIF varían del 30% al 80%^1,5. Sin embargo, algunos pacientes pueden tener una biopsia negativa, especialmente aquellos con MMP ocular solamente, pero la documentación clínica de la progresión de la enfermedad se trata de manera similar a los casos de MMP ocular con biopsia positiva ^7,8. Por lo tanto, Dart et al. enfatizaron la necesidad de criterios diagnósticos separados para la MMP⁸ solo ocular.

Las razones propuestas para la baja tasa de positividad en todos los estudios son la enfermedad avanzada con cicatrices extensas en la superficie ocular, técnicas inadecuadas de procesamiento de tejidos o tinción, y una variante de la enfermedad negativa para biopsia 8,9,10,11. Un análisis retrospectivo de las biopsias de 27 pacientes con sospecha de MMP ocular reveló solo una tasa de positividad del 30%, y el 63,7% solo tenía afectación ocular¹². DIF requiere un protocolo específico; No todos los laboratorios de diagnóstico están en sintonía con eso. Existen diferencias en cuanto al sitio de la biopsia, si se debe realizar una biopsia de uno o ambos ojos, y las soluciones de transferencia de muestras 13,14,15. En un análisis retrospectivo de las biopsias conjuntivales en nuestro centro, la tasa de positividad del DIF fue del 54,1%, con más positivos cuando se biopsiaron bilateralmente (59% vs. 45%)⁸. Aunque la biopsia es fundamental, los signos clínicos y la cicatrización progresiva de la superficie ocular ayudan a confirmar el diagnóstico de MMP. Es más fácil de diagnosticar cuando hay un sitio extraocular comprometido, como la oral o la piel, reportado en el 40% y el 18% de los pacientes, respectivamente⁵.

Existen variaciones en la literatura existente, y el protocolo presentado aquí puede servir como guía de referencia con las modificaciones introducidas para reducir la necesidad de un medio de transferencia único¹⁴. Las biopsias se transfieren en un medio de temperatura óptima de corte (OCT) y se congelan a presión en el mismo cartucho de transferencia en el laboratorio de patología, lo que evita la necesidad de un medio de transferencia adicional. El presente artículo describe la metodología para la tinción DIF de tejido conjuntival, la recolección de tejido y el protocolo de transferencia de muestras.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices del comité de ética de investigación en humanos del comité de ética de investigación en humanos del Instituto Oftalmológico LV Prasad.

1. Técnica de biopsia conjuntival

1. Biopsia planificada de ambos ojos del paciente con sospecha de penfigoide bajo anestesia tópica o local y microscopio quirúrgico.
2. Obtener el consentimiento informado del paciente y enumerar los posibles efectos secundarios del sangrado, la cicatrización y la necesidad de comenzar a tomar esteroides tópicos después de la cirugía.
3. Coloque 1-2 gotas de proparacaína al 0,5% en ambos ojos y espere 5 minutos antes de comenzar el procedimiento.
4. Asegúrese de que el paciente no sienta dolor al tocar la conjuntiva con pinzas finas. Si el paciente sigue sintiendo dolor después de aplicar proparacaína tópica, inyecte 0,2 mL de lidocaína subconjuntival al 2% con una jeringa de tuberculina de 1 mL.
5. Coloque un espéculo en el ojo derecho o izquierdo, lo que se elija primero.
6. Examine la superficie ocular en busca de áreas de cicatrización y queratinización. Seleccione el área de la biopsia que no esté comprometida y que no esté cicatrizada ni queratinizada.
   NOTA: En este estudio, se prefiere la conjuntiva bulbar superior alejada del limbo como sitio de la biopsia, seguida de la conjuntiva bulbar inferior.
7. Utilice las pinzas de Lim para levantar la esclerótica de la conjuntiva y extraiga linealmente con las tijeras de Westcott, que miden 4-5 mm de largo y 2-3 mm de ancho.
8. Transfiera toda la biopsia inmediatamente a un medio de corte óptimo (OCT).
   NOTA: Se pueden transferir biopsias en solución salina normal o en un medio de transporte Michel.
9. Toma un cartucho y un molde de pañuelo de plástico con un pocillo en el centro, límpialo con solución salina y sécalo al aire.
10. Llene el cartucho con medio OCT por separado para el ojo derecho y el izquierdo. Sumergir el tejido conjuntival extirpado en el medio OCT y enviarlo a patología.
11. Repita también los pasos similares para el lado contralateral.

2. Transferencia del tejido

1. Incrustar las muestras de biopsia de la conjuntiva en un medio OCT para preservar la arquitectura del tejido y la antigenicidad si se reciben en el medio de transporte de Michel o en solución salina normal.
2. Congele las muestras incrustadas con nitrógeno líquido o hielo seco y almacene a -80 °C durante la noche.

3. Preparación y corte de tejidos

1. Divida el tejido congelado en rodajas de 4-6 μm (7 en número) utilizando un criostato a -20 °C a -25 °C.
2. Monte las secciones en portaobjetos de microscopio recubiertos de polilisina cargados positivamente para garantizar la adhesión y almacene a -80 °C hasta la tinción en papel de aluminio.

4. Tinción inmunofluorescente

1. Descongele los portaobjetos a temperatura ambiente (RT) durante 10 min y fíjelos en acetona fría (100%) durante 10 min para preservar los antígenos y prevenir el daño tisular.
2. Enjuague con 1x PBS tres veces, cada vez durante 5 minutos para eliminar el exceso de medio OCT y acetona.
3. Aplique anticuerpos conjugados anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM y anti-C3 diluidos (Fibrinógeno-1:10 [control positivo], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) sobre portaobjetos.
   NOTA: Los anticuerpos se diluyen en 1x PBS.
4. En el caso de los controles negativos, omita la aplicación de anticuerpos conjugados y siga los pasos restantes que se mencionan a continuación.
5. Siga las pautas del fabricante para diluir los anticuerpos y estandarice con controles positivos y negativos conocidos.
6. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada a 37 °C durante 45-60 min.
7. Lave los portaobjetos con PBS (3× durante 5 minutos cada uno) para eliminar los anticuerpos no unidos.
8. Contratinción con medio de montaje que contiene DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidol) para la visualización nuclear.
9. Coloque un cubreobjetos sobre los portaobjetos y déjelos curar durante 20 minutos.
10. Examine los portaobjetos utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con filtros apropiados para los fluoróforos utilizados (filtro verde de excitación para 488 nm).
11. Documente los hallazgos con micrografías digitales.

5. Ácido periódico rápido - Tinción de Schiff

1. Preparación de ácido peryódico Schiff (PAS)
   1. Disuelva 1 g de fuschin básico en 100 ml de agua destilada caliente.
   2. Añade 10 ml de ácido clorhídrico y 2 g de disulfito de potasio para decolorar el tinte.
   3. Después de enfriar, agregue 0,5 g de carbón activado, revuelva y filtre la solución para obtener un reactivo de Schiff de ácido peryódico claro. Guárdalo en una botella oscura.
      NOTA: Para probar el reactivo de Schiff, vierta 10 mL de formalina al 37% en un vidrio de reloj y agregue unas gotas de Schiff's para la prueba. Un buen reactivo de Schiff se volverá rápidamente de un color rojo púrpura. Un reactivo de Schiff deteriorado causará una reacción retardada y el producto será de un azul púrpura intenso.
2. Técnica de tinción PAS
   1. Hidratar los toboganes en el agua.
   2. Oxidar en una solución de ácido peryódico al 0,5% durante 5 min.
   3. Enjuague con agua destilada.
   4. Coloque en el reactivo de Schiff durante 15 minutos (las secciones se ven de color rosa claro durante este paso)
   5. Lavar con agua tibia del grifo durante 5 minutos (las secciones se vuelven de color rosa oscuro).
   6. Contratinción en hematoxilina de Mayer durante 1 min.
   7. Lavar con agua del grifo durante 5 min.
   8. Deshidrate los portaobjetos en las siguientes soluciones: Una vez en alcohol etílico al 80% durante 1 min, dos veces en alcohol etílico al 90% durante 1 min, dos veces en alcohol etílico al 100% durante 1 min.
   9. Deshidrata los portaobjetos tres veces en xileno durante 1 minuto cada uno.
   10. Coloque un cubreobjetos sobre los portaobjetos utilizando un medio de montaje sintético (por ejemplo, un soporte DPX)
   11. Observe los resultados del PAS bajo el microscopio de campo claro.

Resultados

La interpretación del DIF requiere la confirmación de la presencia de la membrana basal en los cortes de tejido (Figura 1). En los portaobjetos teñidos con PAS, la membrana basal aparecerá como una membrana de color rosa brillante situada en la región basal del epitelio conjuntival (Figura 1C). La continuidad y arquitectura de la membrana basal también debe ser comentada. La positividad de DIF se verá como BM de color verde brillante (Figura...

Discusión

La técnica de biopsia conjuntival aquí descrita utiliza el medio OCT como medio de transferencia, obviando la necesidad de un medio de transferencia adicional y evitando el manejo de la biopsia para transferirla al medio OCT para la criosección. Un molde de cartucho de plástico lleno de medio y biopsia se congela directamente para hacer bloques de tejido y luego se secciona. Las ventajas de la OCT son que se congela rápidamente con un daño mínimo por la formación de cristales y encapsula...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 N ácido clorhídrico	Finar  química Limited	7647-01-0
Acetona	Qualigens	Pregunta 33517
Albúmina	DAKO	F0117
Fucsina básica	Qualigens	Pregunta 39402
C3c	Biosistemas de diagnóstico	F003
C4c	Biosistemas de diagnóstico	F005
Cartucho	Policiencias	25376-500
Activado por carbón vegetal	Sigma	C-5260
Criostato	Leica	CM1860UV
Cuchillas criotomas	Leica	818
DAPI	Abcam	AB104139
Fibrinógeno	Biosistemas de diagnóstico	F006
Microscopio de fluorescencia	Olimpo	CX43
Fórceps	Joja quirúrgica	JS1528A
Cámara de humedad	Biosistemas de diagnóstico	SM365
IgA	Biosistemas de diagnóstico	F007
IgG	Biosistemas de diagnóstico	F008
Igm	Biosistemas de diagnóstico	F009
IHC Portaobjetos adhesivos de vidrio	Tomo	33140455
Fórceps de Lim	Pista de carreras	S-7223
Medio tansport de Michel	Cinítica Fisher	NC0253304
Cubierta microscópica	Estrella azul	https://www.bluestarslides.com
OCT Medio	Criomatriz	6769006
PBS	DAKO	DM831
Ácido peryódico	Sigma	375810-25G
Disulfito de potasio	Sigma	P2522-500G
Proparacaína 0,5%	Sunway Privado	G/1118A
Tijeras de Westcott	Pillig Gurgical Intruments	423480