Interfaces eléctricas y optoelectrónicas bidireccionales en corazones de rata ex vivo sanos e isquémicos

Resumen

Este protocolo describe la fabricación avanzada de materiales y los métodos ex vivo de corazón de rata para la biointerfaz bidireccional óptica y eléctrica, lo que permite una estimulación cardíaca precisa, registro y modelado de infartos para la investigación bioelectrónica.

Resumen

Los estudios electrofisiológicos son fundamentales para explorar las interacciones entre los materiales y las biointerfaces cardíacas. Los avances recientes han introducido varios materiales conductores y semiconductores novedosos para interfaces bidireccionales con modelos cardíacos, lo que facilita la estimulación de baja intensidad junto con registros de alta relación espacio-temporal y alta relación señal-ruido (SNR). El modelo de corazón de roedor ex vivo sirve como una plataforma eficaz para validar las funcionalidades de nuevos materiales y dispositivos, uniendo los hallazgos in vitro con los conocimientos traslacionales y minimizando las preocupaciones éticas y administrativas. En este protocolo, detallamos el aislamiento y la perfusión ex vivo de corazones de ratas adultas utilizando un aparato Langendorff, estableciendo una estimulación y registro bidireccional precisos con semiconductores y conductores de alto rendimiento, que incluyen silicio nanoporoso, carbono nanoporoso y matrices de microelectrodos flexibles tipo malla. Además, presentamos un modelo de infarto de miocardio inducido por lesión por isquemia-reperfusión (I/R), evaluado mediante registro y mapeo multicanal, así como tinción de infarto, lo que permite estudios relevantes para la enfermedad cardíaca y posibles exploraciones terapéuticas. Esta metodología ofrece información valiosa sobre la investigación de la interfaz materiales-bio y el desarrollo de la bioelectrónica cardíaca de próxima generación.

Introducción

El campo de la bioelectrónica cardíaca avanza a pasos agigantados, impulsado por la necesidad de desarrollar materiales y dispositivos que permitan comunicaciones bidireccionales precisas y eficientes con el corazón 1,2,3,4. Los estudios electrofisiológicos desempeñan un papel fundamental en este esfuerzo, ya que proporcionan información crítica sobre cómo los materiales interactúan con las biointerfaces cardíacas a través de la modulación y la detección. Si bien los modelos in vitro, como las líneas celulares HL-1 cultivadas y los cardiomiocitos primarios de roedores, ofrecen un entorno controlado para las evaluaciones iniciales ^5,6,7,8, su simplicidad a menudo no logra replicar las condiciones complejas y dinámicas de un corazón vivo. Estos modelos carecen de la arquitectura 3D del corazón, crucial para la conducción eléctrica coordinada y la generación de fuerza mecánica, y no pueden imitar los ciclos rítmicos de contracción-relajación o la dinámica de perfusión crítica para^{el suministro de} oxígeno y nutrientes. Por el contrario, los modelos in vivo proporcionan los conocimientos fisiológicamente más relevantes, pero conllevan importantes desafíos éticos, administrativos y técnicos, como la necesidad de una amplia formación, configuraciones quirúrgicas sofisticadas y el cumplimiento de estrictos marcos normativos¹⁰.

Para cerrar esta brecha, los modelos de corazón ex vivo, como el corazón de rata adulta perfundido con Langendorff, ofrecen una alternativa convincente a la investigación científica^11,12. Estos modelos combinan la relevancia fisiológica de los sistemas in vivo con la capacidad de control y accesibilidad de las configuraciones in vitro. Al aislar el corazón y mantenerlo en un estado funcional, el aparato de Langendorff permite a los investigadores realizar estudios de alta fidelidad sobre la electrofisiología cardíaca en condiciones controladas con precisión. La ausencia de variables sistémicas, como las entradas neuronales y las hormonas circulantes, simplifica la interpretación de los resultados al tiempo que preserva aspectos clave de la fisiología cardíaca. Además, los modelos ex vivo mitigan muchas preocupaciones éticas y reducen la carga de recursos, lo que los convierte en una plataforma versátil y práctica para la investigación traslacional¹³.

Además de su potencial traslacional, este protocolo establece un punto de referencia para la evaluación del rendimiento de los materiales. Al incorporar estrategias materiales representativas, como plataformas optoelectrónicas para la fotoestimulación inalámbrica y sistemas electrónicos para la estimulación y el registro por cable, establece un marco reproducible para estudios comparativos. Esta estandarización no solo facilita la innovación, sino que también mejora la reproducibilidad y la fiabilidad de los hallazgos en todos los grupos de investigación. En el pasado, muchos fotoelectrodos y electrodos de alto rendimiento han demostrado ser muy prometedores para los estudios bioeléctricos, como PEDOT: PSS¹⁴, MXene¹⁵, óxidos de iridio¹⁶, platino¹⁷, molibdeno¹⁸, silicio 19,20,21, puntos cuánticos 22,23,24 y semiconductores orgánicos²⁵. Aquí, este protocolo presenta materiales representativos y de última generación, incluyendo silicio nanoporoso²⁶, carbono nanoporoso²⁷ y matrices flexibles de multielectrodos de oro (MEAs)^28,29, que se integran en el protocolo para demostrar sus capacidades en interfaces cardíacas bidireccionales. Estos materiales permiten la estimulación supraumbral de baja intensidad, alta resolución espacio-temporal y registros de alta SNR, lo que muestra su potencial para el avance de la bioelectrónica cardíaca. Además, la inclusión de un modelo de infarto de miocardio inducido por lesión I/R proporciona un marco sólido para estudios y exploraciones terapéuticas relevantes para la enfermedad.

Este trabajo presenta métodos detallados para la fabricación y aplicación de materiales avanzados para la fotoestimulación sin cables y la estimulación eléctrica y la detección con corazones de rata ex vivo (Figura 1A). Las membranas de silicio nanoporosas se fabricaron mediante patrones de fotolitografía, grabado iónico reactivo (RIE) y liberación de ácido fluorhídrico (HF) tamponado de obleas de silicio sobre aislante (SOI) con una capa de dispositivo de 5 μm, seguido de grabado con tinción y transferencia a membranas blandas de polidimetilsiloxano (PDMS)²⁶. Para la estimulación eléctrica y el registro, se desarrolló el carbono nanoporoso mediante ablación láser de sustratos de celulosa incubados en sal, seguida de transferencia en fase acuosa y laminación térmica, ofreciendo capacidades mejoradas de almacenamiento de carga e inyección en comparación con los electrodos de oro^{tradicionales.} Además, se fabricaron MEAs flexibles en obleas de Si recubiertas de poliimida utilizando fotolitografía, metalización por haz de electrones, grabado, encapsulación y procesos de liberación para permitir el registro y mapeo epicárdico resuelto espacialmente^28,29.

Más allá de la fabricación, el protocolo proporciona un protocolo paso a paso para el aislamiento, la perfusión, el monitoreo y la interfaz del corazón de ratas adultas con dispositivos ópticos y eléctricos. Los dispositivos se probaron en corazones aislados, demostrando resultados representativos en la estimulación y el registro para la evaluación electrofisiológica. Este protocolo también introduce un método para crear un modelo de infarto de miocardio a través de I/R, validado por registros fisiológicos, tinción y evaluaciones morfológicas. Esta metodología integral establece un marco reproducible para la evaluación de materiales y dispositivos en biointerfaces cardíacas. La Figura 1B-D describe los flujos de trabajo de la fabricación de materiales para su evaluación en este modelo cardíaco ex vivo. La Figura 2A-C muestra los resultados esperados en imágenes de los dispositivos tal como se fabricaron.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago (número de protocolo 72378).

1. Fabricación de membranas de silicio nanoporoso (Figura 1B, Figura 2A, Figura 3)

1. Diseñe el patrón de fotomáscara en el software AutoCAD (Figura 3). Asegúrese de que el tamaño del dispositivo coincida con la escala de longitud del objetivo biológico. Para el corazón de rata, use un tamaño de dispositivo de 2 a 10 mm. En el diseño, agregue matrices de orificios pequeños de 20 a 100 μm de diámetro para facilitar la liberación de la capa del dispositivo de Si en HF amortiguada. Haga los tres orificios grandes de 200 a 1000 μm de diámetro, formando una letra L quiral para ayudar a identificar el lado correcto de la membrana.
2. Limpie la oblea SOI con acetona y alcohol isopropílico (IPA) durante 3 minutos cada uno en el baño ultrasónico. Realice la deshidratación horneando a 200 °C durante 20 min en la placa caliente.
3. Aplicar una capa de centrifugado con la resistencia positiva gruesa AZ40XT-11D a 3000 rpm durante 45 s, horneando a 115 °C durante 3 min. Tenga cuidado de no verter demasiada fotorresistencia en la oblea. Después del recubrimiento de centrifugado, limpie los residuos en la parte posterior de la oblea con hisopos de acetona.
   NOTA: AZ40XT-11D es un fotorresistente positivo muy viscoso.
4. Utilice el escritor directo Heidelberg MLA150 para exponer el patrón de fotorresistencia a 375 nm y una dosis de 800 mJ/^cm2. Realice el horneado posterior a la exposición a 110 °C durante 2 min.
5. Desarrolle el patrón en revelador AZ 300MIF durante 2 min. Enjuague la oblea con agua desionizada (DI) durante 60 s y luego seque con aire N₂ .
6. Grabe el SOI descubierto utilizando un proceso RIE SF₆/CHF₃ (20 sccm:50 sccm) durante 12 min utilizando plasma acoplado inductivamente a 600 W y una radiofrecuencia de 60 W en un grabador de fluoruro de plasma acoplado inductivamente con una presión de cámara de 10 mT, lo que da como resultado una tasa de grabado de aproximadamente 660 nm/min.
7. Retire la fotorresistencia con AZ NMP en un baño ultrasónico a 80 °C durante 10 minutos y limpie la oblea en un baño ultrasónico durante 3 minutos en acetona, seguido de 3 minutos en IPA, y seque con nitrógeno comprimido.
8. Sumerja la muestra en HF tamponado a temperatura ambiente para eliminar las capas de óxido enterradas. El dispositivo se libera en 4 - 8 h. Aumente ligeramente la temperatura de la solución (40 °C) para facilitar la liberación.
9. Transfiera con cuidado las membranas liberadas con papel de filtro de 1 cm x 1 cm a dos baños de agua DI separados secuencialmente para eliminar cualquier HF residual.
   NOTA: El experimento se puede pausar aquí. Remoje la membrana en un baño de IPA para almacenarla a 4 °C.
10. Transfiera la membrana con papel de filtro a una placa de Petri con agua desionizada (DI). La membrana flotará en la superficie del agua debido a la hidrofobicidad y la tensión superficial.
    NOTA: Las membranas de silicona pueden pasar rigurosamente del IPA al agua gracias al efecto Marangoni³⁰.
11. En una placa de Petri aparte, prepare la solución de grabado de manchas que contenga una proporción de volumen de 100:1 de HF concentrado y ácido nítrico concentrado (por ejemplo, 10 mL de HF y 0,1 mL de HNO₃). Mézclalo bien antes de grabar.
12. Transfiera la membrana con papel de filtro a la solución de grabado y grabe durante 30 s. Preste atención al lado de la membrana de Si observando la orientación de la letra L formada por los tres orificios principales. La membrana de Si debe flotar en el grabador, donde solo está grabado un lado de la membrana.
13. Transfiera la membrana con papel de filtro a dos platos de agua desionizada separados para lavar el residuo de HF.
    NOTA: El experimento se puede pausar aquí. Transfiera la membrana a IPA para su almacenamiento a 4 °C.
14. Haga un sustrato de soporte con PDMS delgado. Mezcle la parte A (polímero base) y la parte B (agente de curado) en una proporción de peso de 10:1 y desgasifique durante 30 min.
15. Capa de sacrificio de PMMA (495 A6) sobre carro de vidrio a 2.000 rpm durante 45 s. Hornear a 180 °C durante 60 s.
16. Laminación de PDMS a 4.500 rpm durante 45 s en el vidrio recubierto de PMMA, lo que debería dar como resultado un espesor de 10 a 20 μm. Curado en horno o placa caliente a 80 °C durante 2 h.
    NOTA: Para mitigar el daño mecánico, se utilizó PDMS como sustrato blando para acomodar las membranas de silicio nanoporoso, proporcionando protección contra posibles daños por la manipulación directa con pinzas.
17. Transfiera la membrana de Si grabada con tinción de IPA a PDMS. Use un pañuelo limpio para eliminar el exceso de IPA, y la membrana de Si se adherirá firmemente al PDMS después de que el IPA se evapore. Preste atención al lado de la membrana de Si identificando la orientación de la letra L formada por los tres orificios principales. El Si poroso grabado debe mirar hacia el exterior, y el Si no grabado debe interactuar con el PDMS.
18. Corte el PDMS circunferencialmente con una cuchilla de afeitar que contenga la membrana de Si. Deje suficiente espacio y tenga cuidado de no dañar la membrana de Si.
19. Remoje el dispositivo en acetona hasta que se libere el Si/PDMS. Evite remojar durante demasiado tiempo, ya que puede causar hinchazón de PDMS. Enjuáguelo con agua desionizada y séquelo con N₂. Realizar un tratamiento con plasma de_O2 a 400 W durante 10 min.

2. Fabricación de matrices de microelectrodos flexibles (Figura 1C, Figura 2B, Figura 4)

1. Diseñe la estructura de MEAs flexibles en AutoCAD (Figura 4). Presentamos dos diseños diferentes que presentan la misma área de proyección del electrodo pero diferentes estructuras de sustrato (Figura 2B, Figura 4).
2. Limpie el sustrato de la oblea de silicona en acetona e IPA durante 3 minutos cada uno en un baño ultrasónico.
   NOTA: Este protocolo no requiere un tratamiento superficial adicional para mejorar la adhesión entre la poliimida (PI) y la oblea de Si para facilitar la liberación del dispositivo. El tratamiento con plasma de oxígeno se puede utilizar para mejorar la adherencia si es necesario.
3. Vierta 4 mL de la solución precursora PI de poli (dianhídrido piromelítico-co-4,4′-oxidianilina) en la oblea. Centrifugar la oblea a 1.500 rpm durante 45 s. Use NMP o acetona para eliminar el precursor en la parte posterior de la oblea.
4. Prehornee a 110 °C durante 3 minutos, luego a 180 °C durante 3 minutos. Cura la oblea recubierta de PI en el horno resistente con un modo de perfil. Comience a temperatura ambiente, caliente hasta 250 °C a una velocidad de rampa de 4 °C/min y mantenga durante 30 minutos. A continuación, caliente la oblea a 350 °C a una velocidad de rampa de 2,5 °C/min, y manténgala a 350 °C durante 60 min, luego enfríe lentamente hasta RT. El resultado es una película PI de aproximadamente 5 μm de grosor.
5. Aplicar una capa de centrifugado a la oblea recubierta de PI con AZ nlof 2020 a 2.000 rpm durante 45 s. Hornea la oblea a 110 °C durante 2 min. Utilice el escritor directo Heidelberg MLA150 para exponer el patrón de fotorresistencia a 375 nm y una dosis de 200 mJ/^cm2.
6. Realice el horneado posterior a la exposición a 110 °C durante 2 min. Desarrolle el patrón en AZ 300MIF Developer durante 1 min. Enjuague la oblea con agua desionizada durante 60 s y luego séquela con aire N₂ .
7. Deposite 10 nm de titanio y 200 nm de oro utilizando un evaporador de haz de electrones. Retire la fotorresistencia con AZ NMP en un baño de 80 °C durante 3 h y limpie la oblea en un baño ultrasónico durante 3 minutos en acetona, seguido de 3 minutos en IPA y secado con nitrógeno comprimido.
8. La capa de centrifugado de la resistencia positiva gruesa AZ40XT-11D a 3.000 rpm durante 45 s. Limpie la fotorresistencia en la parte posterior de la oblea con acetona. Hornea la oblea a 115 °C durante 3 min.
9. Utilice el escritor directo Heidelberg MLA150 para exponer el patrón de fotorresistencia a 375 nm y una dosis de 800 mJ/^cm2. Realice el horneado posterior a la exposición a 110 °C durante 2 min.
10. Desarrolle el patrón en AZ 300MIF Developer durante 3 min. Enjuague la oblea con agua desionizada durante 60 s y luego séquela con aire N₂ .
11. Grabe el PI descubierto utilizando un proceso RIE SF₆/CHF₃ (20 sccm:50 sccm) durante 20 min con plasma acoplado inductivamente a 600 W y una radiofrecuencia de 60 W en un grabador de fluoruro de plasma acoplado inductivamente con una presión de cámara de 10 mT.
12. Retire la fotorresistencia con AZ NMP en un baño de 80 °C durante 10 minutos y limpie la oblea con una sonicación suave durante 3 minutos en acetona, seguido de 3 minutos en IPA y seque con nitrógeno comprimido.
    NOTA: Utilice ultrasonidos de baja potencia para evitar que el dispositivo se desprenda. Evite la sonicación si el PI muestra signos de desprendimiento.
13. Procese la oblea en un horno de hexametildisilazano (HMDS) para aplicar el tratamiento HMDS. Spin coat SU-8 2002 a 2.000 rpm durante 45 s. Esto da como resultado un espesor de SU8 de aproximadamente 2,5 μm.
14. Hornea la oblea a 95 °C durante 20 min. Utilice el escritor directo Heidelberg MLA150 para exponer el patrón fotorresistente a 375 nm y una dosis de 950 mJ/^cm2.
15. Desarrolle el patrón en SU-8 Developer durante 1 min. Enjuáguelo con alcohol isopropílico y agua desionizada, y séquelo con gas N₂ . Si aparecen manchas blancas en la oblea durante el enjuague del IPA, remoje la oblea en el revelador SU8 hasta que desaparezcan las manchas blancas.
16. Realice un horneado duro a 160 °C durante la noche. Utilice tiempos de horneado más cortos (~30 min) para experimentos agudos. No hornee a menos de 150 °C ni a más de 200 °C. Despegue el MEA flexible soportado por PI del sustrato.

3. Fabricación de carbono nanoporoso (Figura 1D, Figura 2C, Figura 5)

1. Diseñe el patrón de película de carbono en el software de diseño (Figura 5).
   NOTA: Este método contiene el protocolo de fabricación para dos tipos de electrodos: electrodo de estimulación nanoporoso basado en carbono y electrodo de detección.
2. Impregnar el papel de filtro en soluciones acuosas de borato de sodio (0,15 M, pH 9,4) durante 1 h y luego secar a 60 °C durante la noche (Figura 1D).
   NOTA: El papel de filtro Whatman de grado 1 sirvió principalmente como sustrato poroso representativo a base de fibra. El borato de sodio se incorpora a las fibras de celulosa después del proceso de impregnación y secado. La sal actúa como catalizador que facilita la carbonización fotoquímica bajo síntesis láser²⁷.
3. Realice la síntesis láser utilizando un láser de CO₂ con patrones prediseñados (Figura 5A). Realice patrones en modo ráster con parámetros optimizados: potencia = 1,8 W; velocidad = 1,6 cm/s; puntos por pulgada = 1000.
4. Prepare una película de tereftalato de polietileno (PET) con un grosor de 50 μm y limpie la película con acetona y alcohol isopropílico (IPA) durante 3 minutos cada uno en el baño ultrasónico.
5. Deposite 5 nm de titanio y 100 nm de oro utilizando un evaporador de haz de electrones. Aplique el procedimiento de transferencia en fase acuosa para transferir el MEA a la película de PET (12,5 μm).
   NOTA: La transferencia de la fase acuosa se llevó a cabo utilizando dos procesos consecutivos: la separación de la fase acuosa y la transferencia capilar.
6. Sumerja los sustratos de papel gradualmente en agua desionizada para la delaminación durante la separación en fase acuosa.
   NOTA: La energía de deformación inducida por la hinchazón de la celulosa facilitó la separación de la membrana de carbono del sustrato de soporte en menos de un segundo, haciendo que flotara en la superficie del agua.
7. Utilice el sustrato de soporte, por ejemplo, una película de PET, para transferir los patrones en el medio acuoso durante la transferencia capilar. Sumerja el sustrato en agua y póngalo en contacto con un extremo de la membrana de carbono deseada para formar una línea de contacto (el frente de transferencia). Luego, sostenga el sustrato con la mano y muévalo en dirección inclinada o vertical a baja velocidad.
   NOTA: Para sustratos de soporte hidrofóbicos, se puede aplicar fuerza externa o tratamiento con plasma de_O2 para ayudar a formar la línea de contacto.
8. Después de la transferencia, aplique aproximadamente 20 μL de solución polimérica de ácido perfluorosulfónico (PFSA) (con una concentración de ~5% en una mezcla de alcoholes alifáticos inferiores y agua) a los patrones de carbono y deje secar en condiciones de temperatura ambiente (23 °C) y presión (1 atm) para la fijación.
9. Asegure el electrodo de estimulación nanoporoso a base de carbono conectándolo a un cable de Cu con adhesivo de plata conductor. Encapsule la unión expuesta entre el cable de Cu y el electrodo con adhesivo de silicona para garantizar el aislamiento y la estabilidad. Después de un curado de 3 h a temperatura ambiente, el electrodo de estimulación está listo para su uso. El experimento se puede pausar aquí.
10. Diseñe el patrón de carbono y MEA en AutoCAD (Figura 5B). Fabrica matrices de microelectrodos de 4 x 4 en una película PI de 25 μm utilizando el procedimiento de fotolitografía estándar como se describe en el paso 2.
    NOTA: La película PI se puede crear a través de un precursor de PI o laminando una película PI comercial en una oblea de Si utilizando fotorresistencia AZ2020. El protocolo para la fotolitografía y la deposición de metales es el mismo que el paso 2.
11. Cree una membrana de carbono monolítica (2 cm x 2 cm) sobre un sustrato de papel después de la impregnación de sal y la escritura láser, como en los pasos 3.1-3.3. Transfiera el patrón de carbono a una película de soporte de PET prediseñada utilizando un método estándar de transferencia en fase de agua, como en los pasos 3.6-3.9.
12. Aplique una solución de polietileno-acetato de vinilo (EVA) al 10% en peso en hexano sobre el patrón de carbono y espere a que se seque en condiciones de temperatura ambiente (23 °C) y presión (1 atm). Diseñe y corte con láser una plantilla de PET de 10 μm de espesor (con un recubrimiento de EVA en la parte inferior) con 16 orificios alineados con el patrón MEA, que sirve como capa de encapsulación.
13. Alinee el MEA, la capa de encapsulación de PET y la membrana de carbono en el soporte de PET. Presione el conjunto utilizando una laminadora en caliente comercial a una temperatura de procesamiento de 120 °C para la transferencia y el encapsulado.
14. Enfríe el electrodo de detección de carbono nanoporoso a temperatura ambiente, elimine los residuos y enjuáguelo con etanol y agua 3 veces antes de usarlo.

4. Aislamiento, perfusión y monitorización del corazón de rata (Figura 6)

1. Prepare a las ratas antes de la extracción del corazón (Figura 6A). Este protocolo utilizó ratas macho CD/SD de 3 a 4 meses de edad, obtenidas del río Charles.
2. Prepare la solución de Tyrode del ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES) disolviendo los productos químicos de acuerdo con la Tabla 1. Ajuste el pH a 7,2-7,4 con 2M NaOH. Preoxigenar burbujeando gas oxígeno durante 0,5-1 h y continuar la oxigenación hasta el final de los experimentos.
3. Coloque tres tubos de la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, sin calcio, sin magnesio) sobre hielo. Prepare instrumentos quirúrgicos limpios (tijeras afiladas, tijeras dobladas, dos hemostáticos, pinzas afiladas, dos pares de pinzas pequeñas).
   NOTA: La cirugía no es para la supervivencia, por lo que la esterilidad no es necesaria.
4. Recoja ratas macho adultas CD/SD que pesen entre 400 y 500 g del animalario. Administrar 0,5 mL de heparina (1000 UI/kg) por vía intraperitoneal en la parte inferior del abdomen. Usa guantes gruesos para sujetar a la rata y protegerla.
5. Agarra a la rata por la parte superior de la espalda, de modo que el abdomen quede expuesto. Sujeta a la rata con firmeza, pero sin forzar excesivamente para no lastimar al animal. Inyecte la solución de heparina de forma rápida y precisa. Espere 20-30 min. Mientras tanto, prepare el aparato Langendorff.
   NOTA: La rata puede ser anestesiada con anticipación para asegurar el paso adecuado de la preparación del procedimiento quirúrgico.
6. Antes de rellenar la solución de Tyrode de HEPES, lave la bolsa de terapia intravenosa (IV) con agua y séquela completamente para garantizar la composición final adecuada. Llene la bolsa con la solución preoxigenada de HEPES Tyrode.
7. Encienda el termostato y la circulación del agua en el aparato Langendorff a 37 °C (Figura 6A). Prepare la cánula, la sutura y coloque la placa de Petri en la compresa fría para seccionar el tejido. Prepare la cánula con HBSS helado antes de seccionarla.
8. Prepárese para realizar la toracotomía en ratas (Figura 6B). Anestesiar al animal con isoflurano en una configuración de campana. Coloque de 8 a 10 mL de isoflurano en un tubo de 50 mL lleno con una gasa. Encierre al animal con el tubo abierto (con isoflurano) en un recipiente.
9. Observe el progreso de la anestesia probando el reflejo de pellizco del dedo del pie. Los animales serán anestesiados y perderán el conocimiento en 2-3 minutos. Vigile cuidadosamente el estado de la rata y transfiérala a la junta quirúrgica inmediatamente después de que pierda el conocimiento. La anestesia prolongada puede provocar la muerte de la rata.
10. Transfiera el animal a la placa de operaciones. Colóquelo boca arriba y coloque 5 mL de isoflurano en un tubo de 50 mL lleno de una gasa sobre la boca de la rata. Confirme la anestesia general pellizcando una de las patas. Continúe solo si no se observó ninguna respuesta.
11. Asegure la parte superior e inferior de los brazos a la tabla quirúrgica con agujas. Haga una incisión (~ 5 cm) para abrir la caja torácica de la rata justo debajo del pecho. Corta con cuidado el diafragma para exponer el corazón y los pulmones.
12. Corta las costillas de ambos lados para abrir completamente la caja torácica y proporcionar un acceso completo. Asegure la caja torácica en el esternón con un hemostático. Sostenga la vena cava desde debajo del corazón usando un hemostático. Retire el corazón cortando debajo del hemostático con unas tijeras desafiladas dobladas lo más cerca posible de la parte inferior de la caja torácica.
13. Transfiera el corazón a HBSS helado. Minimice la duración del paso para evitar la interrupción prolongada del suministro de oxígeno al corazón que se contrae.
14. Prepárese para realizar la perfusión y monitorización de Langendorff. Llene la cánula y la placa de Petri completamente con HBSS helado. Asegúrese de que no haya burbujas en el sistema.
15. Transfiera el corazón a la placa de Petri precargada con HBSS para seccionar. Con pinzas y tijeras, extraiga los pulmones y otros tejidos conectivos (figura 6C).
    NOTA: Se recomienda la disección roma para el procedimiento de seccionamiento para prevenir cualquier daño potencial al corazón. Para seccionar los tejidos adyacentes, use dos tijeras y separe el tejido con cuidado.
16. Localiza la aorta presionando el corazón y trazando el camino de la sangre a medida que sale. Cortar debajo de la primera arteria ascendente y canular la aorta si el arco aórtico se conserva durante la extracción (Figura 6D). Asegure la aorta a la cánula con un nudo doble.
    NOTA: Evite insertar la cánula demasiado profundamente para asegurarse de que la válvula permanezca cerrada. No coloque la sutura demasiado abajo, ya que esto puede obstruir las arterias coronarias.
17. Prepare el aparato Langendorff con una solución de trabajo preoxigenada. Abra el flujo tampón y conecte la cánula al aparato (Figura 6E). Asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire. El corazón comienza a contraerse en este paso.
    NOTA: Inicialmente, es posible que salga algo de tampón de los ventrículos, pero no se espera una fuga excesiva. Ajuste la sutura según sea necesario para evitar fugas del tampón. No se observará fibrilación cardíaca en este paso si la cirugía y la preparación se llevan a cabo correctamente.
18. Corta las aurículas. Desinfle el globo antes de insertarlo en el ventrículo izquierdo, luego llénelo con agua con la jeringa conectada.
19. Conecte las sondas BP-100 a la línea de perfusión y a los balones llenos de agua para monitorear la perfusión y la presión ventricular izquierda (LVP), respectivamente (Figura 6F).
    NOTA: Las sondas BP-100 necesitan calibración antes de su uso. Las burbujas en los globos deben expulsarse para garantizar una detección precisa de la presión.
20. Monitoree la presión de amortiguación del HEPES Tyrode y la línea de base de LVP. Asegúrese de que la presión del tampón se mantenga dentro del rango óptimo de 80-100 mmHg. Ajuste el LVP basal a aproximadamente 20 mmHg modificando el volumen de agua inyectado en el globo (Figura 6F).
21. Conecte los electrodos de ECG. Conecte a tierra la cánula y coloque el electrodo en los lados, la parte superior o el ápice según sus preferencias (Figura 6F).
22. Amplifique todas las señales (perfusión, presión ventricular izquierda y ECG) utilizando un amplificador IA-400D e interconectado con una computadora usando un digitalizador con software Clampex (Figura 6F).

5. Creación de infarto de miocardio mediante el proceso IR (Figura 6G, Figura 7)

1. Llene la cámara calentada con tampón HEPES Tyrode precalentado a 37 °C. Sumerja el corazón en el tampón dentro de la cámara calentada y ajuste la llave de paso para detener el flujo del tampón, induciendo isquemia global. Ajuste la duración de la isquemia en función de los objetivos específicos del experimento.
2. Gire la llave de paso para restaurar el flujo tampón hacia el corazón después de 30 minutos de isquemia, iniciando la reperfusión. Permitir la reperfusión del corazón durante 45 min antes de finalizar el experimento para la tinción para evaluar el tamaño del infarto (Figura 6G).
   NOTA: El tiempo de isquemia o reperfusión se determina en base a los objetivos experimentales.
3. Verifique la inducción exitosa de la isquemia mediante la observación de la reducción de la frecuencia cardíaca y los patrones irregulares del ECG (Figura 7A). Se observará arritmia o fibrilación ventricular.
4. Administre lentamente 10 mL de HBSS a 4 °C a través del puerto lateral de la llave de paso para detener el corazón. Extraiga el corazón de la columna de perfusión, recorte cualquier tejido auricular restante y coloque el corazón en una matriz de corte de tejido.
5. Cubra la matriz con una película transparente y congele el corazón a -80 °C durante unos 8 minutos o hasta que alcance una consistencia similar a la de un malvavisco. Retire la matriz de corte de pañuelos del congelador e inserte hojas de afeitar para cortar el corazón en secciones de 2 mm de grosor.
6. Retire las rodajas de tejido de la matriz de corte una por una y guárdelas a -80 °C hasta que sean necesarias para experimentos bioquímicos.
7. Realizar la tinción de infarto (Figura 7B). Incubar los trozos de corazón en 10 mL de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 1% p/v a 37 °C durante 30 min.
8. Transfiera la rodaja de tejido a formol tamponado al 10% y deje que se fije a temperatura ambiente durante la noche. Para obtener los mejores resultados, retire el corazón de la formalina y obtenga una imagen del tejido dentro de las 24 horas. Minimice la exposición a la luz durante este paso para evitar la degradación de la mancha.
9. Fotografíe el corte manchado y utilice software como ImageJ para estimar el tamaño del infarto.

6. Establecimiento de interfaces optoeléctricas bidireccionales entre los dispositivos y el tejido cardíaco (Figura 8, Figura 9)

1. Coloque la membrana optoelectrónica de silicona en el lugar deseado para la estimulación. La membrana de silicio se autoadhiere al epicardio con fuerza capilar (Figura 8A). Si la fijación es difícil, use adhesivos de tejido húmedo para ayudar con la fijación.
   NOTA: La reducción de la tasa de perfusión podría reducir la cantidad de agua en la superficie del corazón, lo que facilita la unión. Una vez adherida a la superficie del corazón, la membrana de silicona normalmente se adhiere a la posición predeterminada durante el funcionamiento.
2. Conecte los electrodos a los sistemas RHD u otras plataformas electrofisiológicas para el registro de datos. Los MEA cuentan con almohadillas de E/S de 16 canales con un paso de 0,5 mm en un extremo, que se conectan a través de un conector de fuerza de inserción cero (ZIF) a una placa adaptadora. A continuación, la placa adaptadora se conecta a la cabecera a través de un conector Omnetics.
3. Coloque los MEAs flexibles en las superficies ventriculares del corazón de rata aislado (Figura 8A). Coloque los MEA dentro de la ventana si utiliza una membrana de silicona en forma de ventana (Figura 8B).
4. Programe la fuente láser de 635 nm con la frecuencia deseada (por ejemplo, 4 Hz) y el ciclo de trabajo (por ejemplo, 0,4%, duración de pulso de 1 ms) utilizando señales de lógica de transistor-transistor (TTL). Enfoque el punto láser en la membrana de silicona, con un tamaño de punto de alrededor de 1 mm. Use gafas protectoras de seguridad láser. Comience con baja intensidad para concentrarse.
5. Inicie el protocolo de grabación y estimulación. Aumente gradualmente la intensidad del láser hasta que se observe un ritmo de anulación ininterrumpido (Figura 8C).
   NOTA: En los estándares de este protocolo, se define la intensidad del umbral en la que el láser permite 10 segundos de estimulación ininterrumpida.
6. Programe el perfil láser con diferentes duraciones de pulso para obtener el perfil de intensidad frente a duración para comparar el rendimiento del dispositivo (Figura 8D). La configuración permite el registro multicanal de ECG, TTL y LVP (Figura 8E).
7. Cambie la ubicación de la membrana de silicona o la ubicación del punto de luz y repita el paso 6.3-6.6 para estudiar cómo las diferentes ubicaciones de estimulación afectan las formas de onda estimuladas y la conducción cardíaca (Figura 9A).
8. Identifique los picos QRS marcados de cada sitio de registro para construir el mapa de retardo de activación o isócrono. Identifique el pico más temprano de QRS y establezca esa ubicación como retardo cero para trazar el mapa de retardo de activación (Figura 9B-C).
   NOTA: Si bien el mapa de retraso de activación en ritmo sinusal (sin estimulación) puede servir como referencia, su patrón puede variar significativamente dependiendo de las condiciones cardíacas y la ubicación de MEA^18,30. Los resultados son más significativos cuando hay una fuente de estimulación clara, como el estimulación externa.

7. Establecimiento de interfaces eléctricas bidireccionales entre los dispositivos y el tejido cardíaco (Figura 10)

1. Conecte los electrodos de estimulación (0,5 cm x 0,5 cm) en una configuración de dos electrodos, colocando el electrodo de trabajo en la pared del ventrículo izquierdo mientras el contraelectrodo está en la pared del ventrículo derecho.
2. Suministre formas de onda de corriente cuadradas (por ejemplo, 1 mA, 1 ms de duración de pulso) a través de un potenciostato hasta que se logre un ritmo exitoso (Figura 10A-B). Realizar pruebas para obtener gráficos de corriente de estimulación vs. duración del pulso y voltaje de estimulación vs. duración del pulso para evaluar la eficacia de la estimulación del material (Figura 10C-D).
3. Realice la grabación eléctrica utilizando una guía de microelectrodos de 4 x 4 (espaciado de 2 mm entre electrodos) y registre utilizando una tarjeta de interfaz USB RHD y una cabecera de grabación de entrada RHD de 16 canales. Registre las señales a 10 kS/s en el ancho de banda de 0,1-100 Hz.
4. Mida el ruido de cada electrodo de registro (Figura 10E). Calcule la SNR utilizando la siguiente ecuación (Figura 10F):
   o
   donde Signal es la amplitud de la señal y_{el ruido} estándar es la desviación estándar de los niveles de ruido. En la grabación, el filtro de muesca de 60 Hz está desactivado para reflejar los resultados sin procesar.
5. Realice análisis adicionales y trace mapas isócronos de la propagación eléctrica utilizando Python.
6. Determine una marca de tiempo de la deflexión máxima (complejo QRS con ritmo) para cada contracción y calcule el promedio de varias señales. Utilice la interpolación gaussiana para la representación de mapas con el fin de mejorar la legibilidad.

Resultados

La electrofisiología de estimulación de una amplia gama de materiales optoelectrónicos y electrónicos se puede validar de manera eficiente utilizando el sistema cardíaco ex vivo , que proporciona una configuración conveniente y controlada (Figura 1A). Los materiales de alta inyección de carga, como el silicio poroso y el carbono poroso, facilitan la modulación bioeléctrica con baja intensidad óptica y estimulación de bajo voltaje, lo que garantiza la seguridad y el funcionamiento capacitivo con carga equilibrada.

El silicio nanoporoso exhibe una generación de fotocorriente significativamente mayor en comparación con las estructuras de silicio convencionales, como las uniones p-n o p-i-n (Figura 11A), debido a su heterounión²⁰ habilitada para la porosidad, la capacidad mejorada de almacenamiento de carga, la impedancia reducida y la absorción óptica mejorada. Estas fotocorrientes, predominantemente capacitivas, permiten una estimulación biosegura y con equilibrio de carga³¹ (Figura 12A-B), logrando un estimulación óptica de corazones de rata ex vivo a 240 lpm con una intensidad de luz de 0,51 mW/^mm2 y una duración de pulso de 1 ms (Figura 8C), o tan bajo como 0,167 mW/^mm2 con una duración de pulso de 10 ms (Figura 11B), valores comparables o inferiores a los métodos optogenéticos y muy por debajo de los umbrales de seguridad del láser^{31, Artículo 32}. Por debajo de estas intensidades, puede producirse una captura parcial o nula de pulsos de luz. Por el contrario, otros materiales, como las membranas de silicio p-i-n o las membranas de silicio p-i-n decoradas con oro, requieren intensidades ópticas significativamente más altas para provocar el ritmo (Figura 11B). La estimulación continua con silicio nanoporoso aumenta la contracción mecánica, como lo indica el LVP elevado (Figura 8E). Además, en su forma monolítica, el dispositivo demuestra la inyección de fotocorriente de alta resolución espacial bajo pulsos de luz localizados, lo que permite estudios de estimulación multicéntrico y de acceso aleatorio potencial²⁶.

En estudios bidireccionales de membrana de silicio en forma de ventana (Figura 3D, Figura 8B), la estimulación multisitio produce distintos perfiles de registro de múltiples electrodos y patrones de conducción cardíaca, validando la originalidad de la propagación de ondas desde cada punto de estimulación (Figura 9). Esta característica destaca la capacidad del sistema para analizar vías de conducción cardíaca complejas con alta precisión y la capacidad de diagnosticar afecciones cardíacas anormales como el infarto de miocardio.

Los MEAs fabricados tienen un espesor aproximado de 10 μm e incorporan estructuras macroporosas o interconexiones serpentinas para minimizar la rigidez a la flexión y mejorar la flexibilidad o la capacidad de estiramiento (Figura 4)^33,34. Los arreglos constan de 16 sitios de grabación independientes dispuestos en una configuración de 4 x 4, cubriendo un área de 6 mm x 6 mm. Estas matrices permiten el registro directo de la señal epicárdica en múltiples sitios de la superficie del corazón. En la Figura 13 se ilustra una grabación representativa de 16 canales. Los mapas isócronos construidos a partir de las grabaciones visualizan la conducción eléctrica a través de la superficie del corazón, con o sin estimulación localizada. La estimulación localizada a menudo induce retrasos en la conducción que anulan el ritmo sinusal intrínseco del corazón ex vivo y las vías de conducción (Figura 9B).

Los materiales de carbono nanoestructurados presentan una solución eficaz para mejorar el rendimiento de los dispositivos bioelectrónicos debido a su alta capacidad de almacenamiento de carga y baja impedancia (Figura 14). Nuestro método de transferencia láser asistido por sal permite la creación de patrones sencillos y la transferencia instantánea de dispositivos de carbono nanoporoso a sustratos flexibles o electrodos de Au tradicionales para mejorar el rendimiento de la bioelectrónica. La caracterización de la impedancia confirmó además que el recubrimiento de carbono redujo sustancialmente la impedancia del electrodo de Au en aproximadamente 2 órdenes de magnitud, de 7244,4 Ω a 63,1 Ω a una frecuencia de 100 Hz pertinente a las señales de ECG (Figura 14A-B). La capacitancia de Helmholtz del electrodo de Au aumentó significativamente después del recubrimiento de carbono, de 0,025 mF/^cm2 a 1,98 mF/^cm2 (Figura 14C). El aumento de la capacitancia utilizando esta estrategia de recubrimiento de microcondensador puede reducir efectivamente el voltaje de polarización en comparación con el electrodo de Au tradicional (Figura 14D).

Este protocolo establece una plataforma nanoporosa basada en carbono para biointerfaces efectivas hacia la modulación eléctrica o la detección de sistemas cardíacos (Figura 10). Para evaluar el rendimiento de la electrónica de carbono nanoporosa para la estimulación cardíaca, el electrodo de Au o Au-C se colocó en la pared del ventrículo izquierdo (VI) para la inyección de carga en formas de onda de corriente cuadrada bifásica³⁵ (Figura 10A). Tras la estimulación de 4 Hz (1 mA), los electrodos de Au y Au-C lograron una estimulación de sobremarcha efectiva (Figura 10B). Sin embargo, se observó una amplitud de ECG notablemente mayor, indicativa de fuerza de contracción, en el grupo Au-C. Ambos electrodos demostraron una disminución exponencial en la corriente umbral para la estimulación con la duración del pulso. Los umbrales de estimulación, que indican los voltajes más bajos para una modulación de frecuencia efectiva, también se midieron en varios anchos de pulso (Figura 10C-D). La curva fuerza-duración se modeló utilizando la ecuación:

donde I(t) se refiere a la corriente de estímulo a la duración del pulso (t),_{I reobase} es la corriente umbral a una duración de pulso infinitamente larga (reobase), y τ es la constante de tiempo de membrana³⁶. El cálculo utiliza la carga mínima necesaria para una estimulación exitosa en la cronaxia como . Q_mín. Los valores se determinaron como 0,79 y 0,71 μC para los electrodos de Au y Au-C, respectivamente (Figura 10C). A una corriente de estimulación de 4 mA/^cm2, se observaron voltajes umbral para una estimulación efectiva a 1,32 V y 0,90 V para los electrodos de Au y Au-C, respectivamente (Figura 10D). La reducción del 30,3% en el voltaje umbral sugiere una disminución potencial del estrés oxidativo durante la estimulación prolongada³¹, lo que facilita aplicaciones bioelectrónicas más seguras con un daño tisular mínimo. Además, se desarrolló un electrodo de Au de 16 canales injertado en carbono para mejorar la detección de la señal de ECG epicárdico (Figura 10E-F). La transferencia de carbono nanoestructurado mejoró notablemente la relación señal-ruido en 8,0 veces en comparación con los electrodos de Au tradicionales, lo que demuestra la eficacia de los recubrimientos nanoporosos basados en carbono para la bioelectrónica de alta fidelidad.

La inducción exitosa de modelos de infarto I/R se validó in situ durante el experimento o post-experimentalmente a través de la monitorización de señales fisiológicas o la tinción TTC, respectivamente. Después del corte y la tinción, el corazón infartado exhibirá una región de color blanco, que representa el daño miocárdico y corresponde al tamaño del infarto (Figura 7B). Por el contrario, un corazón sano carecerá de regiones blancas después de la tinción. Durante el monitoreo en tiempo real, un modelo de isquemia exitoso mostrará una frecuencia cardíaca significativamente reducida, evidente en las lecturas de LVP y ECG. Además, el mapeo MEA del corazón isquémico revelará una disminución de la velocidad de conducción eléctrica a través del epicardio, lo que resulta en un mayor tiempo de retardo³⁷ (Figura 7A).

Figura 1: Ilustración esquemática del protocolo y el flujo de trabajo de fabricación. (A) Ilustración esquemática de la configuración del corazón de rata ex vivo y la interfaz del dispositivo. (B) Proceso de fabricación de membrana de silicio poroso (paso 1). La fabricación de la membrana porosa de Si comienza con una oblea SOI, donde una capa fotorresistente se modela mediante fotolitografía para definir las características hexagonales. RIE elimina selectivamente el silicio expuesto, seguido de un proceso de despegue en HF tamponado para liberar las membranas de Si. La membrana se somete a un grabado con tinción en una solución basada en HF, generando una estructura de Si nanoporosa. La membrana porosa de Si resultante se separa cuidadosamente y se transfiere a un sustrato de PDMS para soporte mecánico. Por último, el tratamiento con plasma modifica las propiedades de la superficie para mejorar las fotocorrientes. (C) Proceso de fabricación de matrices multielectrodos macroporosas flexibles (paso 2). La fabricación de MEA flexibles comienza con el recubrimiento de PI en una oblea de silicio para que sirva como capa de sustrato flexible. El fotopatrón se realiza utilizando fotorresistencia AZ 2020 para definir las áreas de los electrodos. La deposición de metal (Au/Ti) se lleva a cabo a través de la evaporación por haz de electrones para crear trazas conductoras, seguida de otro paso de fotomodelado utilizando AZ 40XT-11D para proteger las regiones seleccionadas de RIE para formar un sustrato macroporoso. Un paso de fotomodelado y horneado duro de SU-8 agrega encapsulación antes de que el proceso de despegue final libere el MEA flexible de la oblea de Si. (D) Flujo de trabajo de modelado y transferencia de membranas de carbono (paso 3), que abarca el procesamiento de fibra a través de la impregnación de sal, la microfabricación a través de la síntesis láser y la transferencia de patrones asistida por agua desde el sustrato de papel a otros soportes. La figura 1D ha sido modificada de^{la 27}. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes ópticas y SEM de los dispositivos tal y como se fabricaron. (A) SEM transversal (arriba) e imagen microscópica óptica (abajo) de Si nanoporoso. (B) Imágenes ópticas de matrices multielectrodos macroporosas con diseños huecos (arriba) y serpentinos (abajo). (C) Imagen microscópica óptica transversal (arriba) y foto (abajo) de sustratos carbonizados. La figura 2A ha sido modificada de²⁶. La figura 2C ha sido modificada de^{la 27}. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diseños CAD del dispositivo de membrana de Si. La figura detalla los parámetros para (A) dispositivos de membrana de silicio en forma de ventana abierta (A) pequeños, (B) medianos, (C) grandes y (D) en forma de ventana abierta. Unidad: mm. Esta cifra ha sido modificada de²⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diseño CAD de los MEAs macroporosos. (A) Los dibujos de diseño y las anotaciones para el MEA de forma hueca. (B) Los dibujos de diseño y las anotaciones para el MEA en forma de serpentina. Unidad: mm. La figura 4A ha sido modificada de²⁶. La figura 4B ha sido modificada de^{la 28}. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Esquemas y diseños de las matrices de electrodos a base de carbono para la interfaz del corazón. (A) Diseño para las interfaces de electrodos estimulantes (paso 3). Durante una estimulación típica, los electrodos de estimulación se conectaron en una configuración de dos electrodos. El electrodo de trabajo (patrón de carbono nanoporoso serpentino) se colocó en la pared del ventrículo izquierdo, mientras que el contraelectrodo se colocó en la pared del ventrículo derecho y se conectó a tierra. Las formas de onda de corriente cuadrada se entregaron a través de un potenciostato. (B) Los MEA de 16 canales para el enmascaramiento y la transferencia de electrodos de carbono (paso 3). La capa 1 indica el patrón de Au de un MEA de 16 canales en un sustrato PI. La capa 2 indica la película de encapsulación de PET. Esta cifra ha sido modificada de²⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Representación esquemática y fotográfica de la configuración ex vivo y el proceso experimental. (A) Aparatos y herramientas utilizados para la instalación ex vivo , incluidos los recipientes de matraces cónicos, instrumentos quirúrgicos, sistemas de perfusión y sistemas de control de temperatura (paso 4). (B) Proceso de extracción de corazón de rata: Anestesiar al animal con isoflurano; Asegura los brazos de la rata; abrir la caja torácica de la rata; Cosecha el corazón de rata. (C) Extracción del tejido graso circundante del corazón extraído para prepararlo para la configuración experimental. D) Fijación del corazón extraído al sistema de perfusión ex vivo . (E) Configuración de perfusión que muestra el corazón conectado al sistema para simular condiciones fisiológicas. (F) Configuración de registro de ECG cardíaco. (G) Los procesos de isquemia-reperfusión (I/R) se demuestran a través de la configuración (paso 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Comparación entre un corazón sano aislado y un corazón I/R. (A) Se registraron retrasos en la propagación de LVP, ECG y ECG en corazones sanos simulados y corazones con isquemia/reperfusión (I/R). (B) Fotografías representativas de secciones de corazón sano y corazón I/R teñidas con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC). El área blanca indica el tamaño del área infartada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Estimulación optoelectrónica bidireccional y registro eléctrico del corazón de rata ex vivo utilizando membrana de silicio poroso y MEAs flexibles. (A) Fotografía que muestra la fijación de la membrana de silicona y la colocación de MEAs en forma de serpentina junto a la membrana de silicona en el corazón. (B) Fotografía que muestra la fijación de una membrana de silicona en forma de ventana abierta y MEAs en forma de hueco instalados dentro de la ventana de Si. (C) Estimulación óptica en el corazón de rata ex vivo que muestra captura sin captura, captura parcial y captura completa a tres intensidades diferentes a 240 lpm y duración del pulso de 1 ms. (D) Gráfico de intensidad frente a duración para evaluar el umbral de estimulación del dispositivo. (E) Perfiles de estimulación óptica con una intensidad de 0,24 mW/mm² y una duración de pulso de 10 ms. La figura 8B-D ha sido modificada de^{la 26}. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Ritmo y mapeo multisitio en interfaces bidireccionales. (A) Posiciones de los sitios de ritmo y registro. (B) El mapa isócrono muestra el retraso en la activación de la señal eléctrica después de la fotoestimulación de ocho ubicaciones diferentes en un dispositivo de Si monolítico estructurado de ventana abierta. (C) El control ejemplar y las trazas de ECG de 16 canales estimuladas en diferentes ubicaciones de estimulación. Al estimular varias localizaciones, la activación espacial indujo retrasos temporales en la evolución del QRS detectado en los tejidos en diferentes sitios de registro. Estos se pueden representar como un mapa de retraso de activación, lo que permite el examen de las vías de conducción en la superficie del corazón. Esta cifra ha sido modificada de²⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10. Bioelectrónica nanoporosa basada en carbono para la estimulación y el registro cardíaco. (A) Imagen óptica de un electrodo de Au (Au-C) injertado en membrana de carbono poroso para la estimulación cardíaca. La imagen insertada muestra la vista ampliada de un microcondensador con estructura de serpentina en el electrodo de Au. (B) Respuesta de ECG de corazón de rata aislado a la estimulación bifásica de forma de onda de corriente cuadrada a una frecuencia de 4 Hz. Bajo la misma densidad de corriente de 4,0 mA/^cm2, el corazón mostró diferentes respuestas de ECG bajo la estimulación de electrodos de Au o Au-C. (C) Las curvas de duración-intensidad de los electrodos de estimulación de Au y Au-C y su ajuste de curva están presentes a una frecuencia de estimulación de 4 Hz. (D) El voltaje umbral aplicado a los electrodos para una estimulación efectiva a diferentes duraciones para los electrodos de Au y Au-C. (E) Curvas de referencia de las señales de ECG registradas con el electrodo de Au y los dispositivos de electrodo de Au-C. (F) La relación señal-ruido (S/N) se calcula a partir de las curvas de ECG registradas. Las figuras insertadas muestran las imágenes ópticas del Au y la guía de electrodos de Au-C utilizada para el registro de ECG (tamaño del electrodo: 1 mm; paso 7.5). Esta cifra ha sido modificada de²⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Comparación de fotocorrientes para diferentes dispositivos de Si y evaluación del umbral de estimulación. (A) Comparación de magnitudes de fotocorriente en cuatro dispositivos basados en Si. Las trazas azules representan las fotocorrientes promediadas de N = 8 dispositivos independientes, y las trazas grises superpuestas ilustran las mediciones individuales de los dispositivos. El gráfico de barras adjunto muestra los valores máximos de fotocorriente (en azul) y las inyecciones de carga integradas (en naranja). Los gráficos de barras se expresan como media ± s.d. Barra de escala, 10 ms. (B) Se realizó estimulación cardíaca ex vivo utilizando los tres dispositivos diferentes. La estimulación se realizó con una frecuencia de 240 b.p.m. y un ancho de pulso de 10 ms. Esta cifra ha sido modificada de²⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Caracterización del balance de carga mediante la integración de la carga inyectada y devuelta. (A) Ilustración del proceso de carga y descarga en la traza de fotocorriente característica. (B) Cálculo de los cargos totales involucrados en la inyección de carga y el retorno de carga. Los resultados mostraron en general un buen equilibrio de carga bajo diferentes duraciones de estimulación. Esta cifra ha sido modificada de²⁶. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13: Las señales eléctricas representativas recogidas por cada electrodo en el MEA de 16 canales. Las señales eléctricas en 16 canales (Ch) muestran la información del electrocardiograma (ECG) del corazón latiendo ex vivo. La cifra ha sido modificada de²⁸. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 14. Propiedades electroquímicas de la bioelectrónica nanoporosa basada en carbono. (A) La interfaz electroquímica entre los tejidos excitables y las interfaces de carbono modeladas. (B) Espectros de impedancia y fase de electrodos de Au y Au-C con curvas ajustadas según el circuito mostrado en A. (C) Medición de CV de patrones de Au y C con la misma geometría, con un rango de voltaje de -0,2 a 0,4 V frente a un electrodo de Ag/AgCl estándar. (D) Cambios de voltaje de los electrodos de Au y Au-C durante un ciclo de estimulación galvanostático bifásico. Esta cifra ha sido modificada de²⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Compuesto	Variedad recomendada	Conc. [mM]	MW	Por 1 L	Por 2 L
NaCl	Sigma (S9625)	126	58.4	7.36	14.7
Kcl	Sigma (P4504)	5.4	74.6	0.4	0.8
Glucosa	Sigma (G7021)	10	180	1.8	3.6
HEPES	Sigma (H4034)	10	238	2.383	4.766
MgCl2.7H2O	Sigma (M9272)	1	203	1 mL	2 mL
				Stock 1 M	Stock 1 M
CaCl2.2H2O	Sigma (C3881)	2	147	1 mL	2 mL
				Stock 2 M	Stock 2 M
NaH2PO4	Sigma (S0751)	0.39	120	1 mL	2 mL
				Existencias 0,39 M	Existencias 0,39 M

Tabla 1: Componentes de la solución de HEPES Tyrode.

Discusión

Este protocolo introdujo la plataforma de corazón de rata ex vivo (Figura 1A) y el modelo I/R para ofrecer estudios de electrofisiología a nivel de órgano rápidos y convenientes para acompañar los esfuerzos y demandas de investigación de rápido crecimiento en bioelectrónica³⁸. Detalló la fabricación y validación de tres sistemas de dispositivos, a saber, silicio nanoporoso, matrices flexibles de electrodos múltiples y carbono nanoporoso (Figuras 1B-D), como punto de referencia para las interrogaciones electrofisiológicas bidireccionales. El silicio nanoporoso permite una estimulación de baja intensidad, capacitiva y espacio-temporal, las matrices flexibles de electrodos múltiples permiten el registro multicanal y el mapeo de las actividades epicárdicas, y el carbono nanoporoso conduce a la estimulación de bajo voltaje y al registro de alta SNR cuando se combina con MEAs²⁷.

La estimulación óptica se ha demostrado previamente utilizando la optogenética, un método que requiere modificación genética para expresar canales iónicos sensibles a la luz en los tejidos diana³³. Si bien es eficaz, la optogenética presenta una complejidad significativa debido a la necesidad de vectores virales o enfoques transgénicos, lo que plantea preocupaciones de seguridad, éticas y regulatorias, particularmente para aplicaciones clínicas. Por el contrario, la bioestimulación no genética basada en semiconductores ofrece una alternativa más sencilla y viable desde el punto de vista traslacional 39,40,40,42. Materiales como el silicio y otros semiconductores orgánicos permiten la modulación optoelectrónica directa de los tejidos sin alteración genética, aprovechando las fotocorrientes capacitivas para una estimulación biosegura y de carga equilibrada. Este enfoque logra un rendimiento comparable o incluso superior a la optogenética en términos de intensidad de estimulación, operando muy por debajo de los umbrales de seguridad del láser para minimizar el daño tisular^31,32 (Figura 8). La naturaleza no genética de la bioestimulación basada en semiconductores elimina las barreras asociadas con la modificación genética, allanando el camino para una adopción más amplia en entornos clínicos y diversas aplicaciones en ingeniería de tejidos y medicina bioelectrónica. Sin embargo, los dispositivos deben diseñarse cuidadosamente para integrarse con el tejido, donde la biocompatibilidad debe considerarse cuidadosamente, así como el lugar de interconexión para una estimulación y registro eficientes (Figura 8A-B). Además, la presencia de material en la superficie del tejido puede impedir la posibilidad de obtener imágenes en tiempo real, a menos que un dispositivo pueda diseñarse para que sea transparente a la ventana de excitación-emisión de ciertos agentes de imagen.

El silicio nanoporoso se destaca entre los fotoestimuladores semiconductores, ya que no requiere un electrodo de retorno artificial, a diferencia de los materiales reportados anteriormente²⁶. Esta propiedad única surge de su capacidad para formar regiones de cátodos y ánodos resueltas espacialmente en función del tamaño y la ubicación del punto de luz. La superficie iluminada sirve como sitio de inyección catódica, mientras que las regiones periféricas circundantes facilitan el retorno de la corriente anódica. Este mecanismo permite la estimulación multisitio en membranas monolíticas sin píxeles, lo que permite una estimulación precisa y localizada. En particular, la estimulación lumínica localizada, en lugar de la iluminación global, es fundamental para crear perfiles de estimulación bipolar eficientes. Además, el tamaño del dispositivo afecta significativamente el rendimiento; Los dispositivos más grandes generan corrientes más altas en las mismas condiciones de estimulación, lo que mejora aún más su versatilidad funcional.

El fracaso de la estimulación óptica puede deberse a varios factores, incluso en modelos biológicos sanos, principalmente relacionados con la integridad del dispositivo y el acoplamiento de la biointerfaz. En primer lugar, es fundamental la caracterización exhaustiva de la fotocorriente antes de la estimulación cardíaca. Las fotocorrientes inferiores a las esperadas pueden surgir de la degradación del material⁴³ pasivación del óxido después de un almacenamiento prolongado, el sobregrabado durante el proceso de grabado de manchas, las fracturas del dispositivo durante la manipulación o transferencia, o la orientación incorrecta del dispositivo durante la interfaz. Para mitigar el daño mecánico, se utilizó PDMS como sustrato blando para acomodar las membranas de silicio nanoporoso, proporcionando protección contra el daño potencial de la manipulación directa con pinzas. En segundo lugar, es esencial establecer una interfaz sin fisuras con el epicardio, que se perfunde con biofluidos en esta configuración. Una capa gruesa de biofluido puede impedir la fijación adecuada y comprometer la eficacia de la estimulación. Para mejorar el acoplamiento de la biointerfaz, se pueden emplear bioadhesivos^42,43 o sutura para estabilizar la conexión y garantizar una estimulación fiable. En particular, el silicio nanoporoso utilizado en nuestro estudio es biodegradable, lo que admite aplicaciones de estimulación temporales, pero degrada su rendimiento en 1-2 días en condiciones fisiológicas. Para la estabilidad a largo plazo, se debe considerar la pasivación de la superficie⁴⁴ o el uso de materiales semiconductores más duraderos.

Durante la estimulación ex vivo, el aumento gradual de la LVP (Figura 8E) a frecuencias más altas (p. ej., 4 Hz) probablemente sea el resultado de una mayor contractilidad miocárdica, la acumulación de calcio y el mecanismo de Frank-Starling⁴⁵. Las tasas de estimulación elevadas mejoran el ciclo del calcio intracelular y la dinámica de llenado ventricular, aumentando la fuerza de precarga y contracción⁴⁶. Si bien esto puede aumentar la demanda miocárdica de oxígeno y el riesgo de arritmia, estos efectos pueden mitigarse con una preoxigenación suficiente, una monitorización estrecha del ECG y parámetros de estimulación controlados. En nuestros experimentos, no se observaron efectos adversos significativos.

En el registro de electrodos múltiples, la especificación de las ubicaciones de los electrodos en el corazón y sus posiciones relativas con respecto al electrodo de estimulación es crucial para un análisis significativo. Es esencial eliminar la diafonía entre electrodos para garantizar la captura de distintas formas de onda y patrones resueltos temporalmente. Las guías de electrodos flexibles suelen establecer una buena interfaz con el epicardio; Sin embargo, la adhesión puede mejorarse aún más utilizando recubrimientos adhesivos conductores de iones, como capas delgadas de hidrogel^28,43 para mejorar la estabilidad y la calidad de la señal.

Los materiales nanoestructurados de grafeno/carbono, con grandes superficies para el almacenamiento y la inyección de carga, pueden mejorar el rendimiento de los dispositivos bioelectrónicos al reducir la impedancia en las uniones electrodo-solución salina y aumentar las capacidades de inyección de carga³⁵. Los métodos actuales para modelar materiales de grafeno en electrodos flexibles (por ejemplo, Au) incluyen la electrodeposición, el recubrimiento por rotación y la serigrafía⁴⁷. Sin embargo, estos métodos suelen estar asociados a procesos de fabricación complejos, capacidades limitadas de modelado y un rendimiento reducido debido al volumen muerto de los aglutinantes. Se utilizó un método de síntesis láser para generar patrones de carbono nanoestructurados en sustrato de celulosa y luego transferirlos a otras películas blandas para crear una biointerfaz compatible, que presenta una forma fácil y efectiva para la fabricación de bioelectrónica. La combinación de recubrimientos de carbono modelados con tamaños geométricos pequeños hasta el nivel de una sola celda, que aumentaría el campo eléctrico localizado, y estructuras altamente porosas de membrana de carbono para disminuir la resistencia en la interfaz electrodo-tejido, logrará sinérgicamente una estimulación y registro biológicos eficientes en el futuro⁴⁸.

Si bien es un modelo de enfermedad conveniente, el modelo I/R ex vivo de Langendorff carece de interacciones sistémicas, aislando al corazón de las respuestas neurohormonales e inmunitarias, y se basa en la perfusión artificial con tampones, que pueden alterar las condiciones fisiológicas como el suministro de oxígeno y la función endotelial. Su limitada viabilidad limita los estudios a eventos agudos. No obstante, el modelo ofrece un entorno altamente controlado con ajustes precisos de los parámetros y una buena reproducibilidad. También permite la medición de la función cardíaca en tiempo real, lo que la convierte en una herramienta valiosa para explorar nuevas estrategias terapéuticas para la cardiopatía isquémica. Por ejemplo, se podría concebir que los dispositivos electrocéuticos preacondicionen el corazón, entrenándolo para soportar entornos severos de especies reactivas de oxígeno (ROS), o para mitigar los niveles de ROS para una mejor recuperación. La eficacia de estos tratamientos podría evaluarse a través de métricas como los patrones de latidos del corazón, las formas de onda del ECG y la velocidad de conducción. Además, una plataforma de estimulación multisitio podría proporcionar información espacial sobre el infarto de miocardio, lo que permitiría una evaluación más detallada de las regiones afectadas. Este enfoque también podría demostrar la mejora de los umbrales de estimulación, correlacionados con la gravedad del infarto, ofreciendo un marco integral para la evaluación y optimización terapéutica.

Si bien el protocolo destacó el uso de los tres dispositivos en modelos cardíacos bidireccionales ex vivo , su aplicabilidad se extiende mucho más allá de los tejidos cardíacos. Estos dispositivos se pueden adaptar fácilmente para su uso con otros tejidos u órganos eléctricamente excitables, como tejidos neurales, músculos esqueléticos y sistemas gastrointestinales, donde la modulación eléctrica precisa es crítica, lo que los convierte en herramientas versátiles para aplicaciones de investigación y traslacionales en medicina bioelectrónica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cabezal de 16 canales	Tecnologías Intan	C3334
Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio	Sigma Aldrich	T8877-5G	cloruro de trifeniltetrazolio
2-Propanol (IPA)	Fischer Scientific	A451-4
Láser de 635 nm, 500 mW	Resplandor láser	NA
Acetona	Fischer Scientific	A18-4
Evaporador de haz de electrones Angstrom Evovac	Angstrom	NA
AZ 300MIF Revelador	Microquímicos	18441123163	Desarrollador
AZ nlof 2020	Microquímicos	1A002020
AZ NMP	Microquímicos	NA	Removedor de fotorresistencia
AZ40XT-11D	Microquímicos	1000300	Fotorresistencia
HF amortiguado	Thermo Scientific	AA44627K2
CaCl2.2H2O	Sigma Aldrich	(C3881)
Láser de CO2	Sistemas láser universales	VLS 4.60
Pintura conductora de plata	PELCO	16062	Adhesión conductiva entre el electrodo y el cable de Cu de conexión
Alambre de cobre encapsulado 0,1 mm	Amazona	https://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/ B09TNM51S5/ref=asc_df_B09 TNM51S5?mcid=155de761ea4 c389ea86d45ba61a83e8d& etiqueta =hyprod-20& linkCode=df0& hvadid =693675076770& hvpos=& hvnetw =g& hvrand=664358781094905 4431& hvpone=& hvptwo=& hvqmt =& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9021716& hvtargid= pla-1878323158943& psc=1
Digitalizador Digidata 1550	Dispositivos moleculares	NA
Glucosa	Sigma Aldrich	G7021
HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenol	Thermo Scientific	14175095
Escritor directo Heidelberg MLA150	Heidelberg	NA
heparina (1000 UI/kg)	Productos farmacéuticos de sagent	1009655
HEPES	Sigma Aldrich	(H4034)
Hexano	Sigma Aldrich	52750-10ML	Solvente
HF	Fisher Scientific	A513-500	Grado de tracemetal
Horno HMDS Vapor Prime	Sistemas de ingeniería de rendimiento	NA
HNO3	Fisher Scientific	A509P500	Grado de tracemetal
Laminadora en caliente	Depósito de oficinas	L410-A	Encapsulación multicapa
Sistemas Intan RHD	Tecnologías Intan	C3100
ECG iWorx	iWorx	IA-400D
Sonda iWorx LVD	iWorx	BP-100
Preamplificador iWorx	iWorx	C-ISO-256
Kcl	Sigma Aldrich	(P4504)
Globo de látex (talla 4)	Radnoti	170404
MgCl2.7H2O	Sigma Aldrich	(M9272)
NaCl	Sigma Aldrich	(S9625)
Solución que contiene Nafion 117	Sigma Aldrich	31175-20-9	Reactivo de fijación para patrón de carbono nanoporoso
NaH2PO4	Sigma Aldrich	(S0751)
NaOH	Sigma Aldrich	221465
PDMS	Fisher Scientific	NC9285739
Grabador de fluoruro de plasma acoplado inductivamente Plasma-Therm	Plasma-Therm	NA
PMMA (495 A6)	Microquímicos	M130006
poli (dianhídrido piromelítico-co-4,4'-oxidianilina)	Sigma Aldrich	575801	Precursor de PI
Poli (etileno-co-acetato de vinilo)	Sigma Aldrich	437247-250G	Polímero para infiltración
Poli (alcohol vinílico)	Sigma Aldrich	341584-25G
Tereftalato de polietileno (PET)	Amazona	KS-6304-21-11	Hoja de PET transparente tipo D .0005" de espesor x 27" de ancho x 10 pies de longitud 1 pc
Potenciostato	Biológico	SP-200	Estimulación eléctrica
resistir el horno	Envío	LCC1-15-5
Microscopía electrónica de barrido	Carl Zeiss	Esmerejón	Instrumento para la caracterización de la morfología
oblea de silicio	Materiales electrónicos NOVA	HS39626
Adhesivo de silicona	WPI	KWIK-SIL-S	Encapsulación
Borato de sodio	Sigma Aldrich	SX0355
Oblea SOI	Ultrasil	3-10541	Tipo-Oriente: P / B (100) DT: 7 +/- 1um DR: <. 005 Ohmcm HT: 300 +/- 10um HR: 1-30 Ohmcm Caja: 1um +/- 5% UD-13998 / UH-13962
SU-8 2002	Microquímicos	Serie SU-8 2000
Desarrollador SU-8	Microquímicos	Serie SU-8 2000
Adhesivo de tejido húmedo	3M	1469SB
Papel de filtro cualitativo Whatman, Grado 1	Sigma Aldrich	WHA1001150	Sustrato para patrones de carbono