Artículo de método

Aislamiento y evaluación por citometría de flujo de las interacciones neuroinmunes en un modelo murino de mini-ictus

DOI:

10.3791/68308

⸱

20 de junio de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la función de las células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico utilizando el análisis de citometría de flujo en un modelo de mini-accidente cerebrovascular. Este método permite un examen detallado de las interacciones neuroinmunes y puede adaptarse para el estudio de otras enfermedades neurodegenerativas, mejorando nuestra comprensión de las respuestas inmunes en la patología del ictus.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte y discapacidad a largo plazo en todo el mundo, y el accidente cerebrovascular isquémico representa la mayoría de los casos. Después de un accidente cerebrovascular isquémico, las células inmunitarias residentes e infiltrantes se activan, lo que contribuye a un mayor daño neuronal. Sin embargo, las funciones del sistema inmunitario en la patología del ictus isquémico no se comprenden completamente, en gran parte debido a la regulación compleja y dinámica de las respuestas inmunitarias en reacción a los cambios en el microambiente durante la neuroinflamación. Por lo tanto, es fundamental monitorizar y analizar la activación de las células inmunitarias residentes e infiltrantes a lo largo del tiempo tras un ictus isquémico. En este estudio, presentamos un protocolo para evaluar la función de estas células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico mediante análisis de citometría de flujo en un modelo de mini-accidente cerebrovascular. Microdiseccionamos el tejido cerebral infartado en puntos de tiempo específicos y luego lo disociamos en una suspensión unicelular utilizando métodos mecánicos y enzimáticos. Las células se pasan a través de un filtro celular de 70 μm y se marcan con cócteles de anticuerpos marcados con fluorescencia antes de ser cuantificadas mediante análisis de citometría de flujo. Si bien este ensayo se desarrolló específicamente para investigar las interacciones neuroinmunes después de un accidente cerebrovascular isquémico, también se puede adaptar fácilmente para estudiar los mecanismos neuroinmunes en otras enfermedades neurodegenerativas, como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El accidente cerebrovascular es una causa predominante de mortalidad y discapacidad a largo plazo en todo el mundo, siendo el accidente cerebrovascular isquémico el que representa la gran mayoría de los casos 1,2,3. El objetivo general de este método es mejorar nuestra comprensión de las interacciones neuroinmunes que ocurren después de un accidente cerebrovascular isquémico al proporcionar un enfoque refinado para evaluar la activación de las células inmunitarias residentes e infiltrantes en un modelo murino de mini accidente cerebrovascular 4,5. La intrincada interacción entre estas células inmunitarias y el microambiente neuronal es crucial para comprender la fisiopatología del accidente cerebrovascular isquémico. Sin embargo, los mecanismos precisos que subyacen a estas interacciones neuroinmunes siguen estando poco dilucidados, principalmente debido a la naturaleza dinámica y multifacética de las respuestas inmunitarias desencadenadas por la neuroinflamación6. Esta técnica tiene como objetivo dilucidar la compleja dinámica de las respuestas inmunitarias en el contexto de la neuroinflamación y su posterior impacto en el daño neuronal y los resultados de recuperación.

La razón de ser del desarrollo de esta técnica se deriva del papel fundamental que desempeñan las células inmunitarias en la exacerbación del daño neuronal y en la recuperación tras un evento isquémico. Los métodos tradicionales de estudio de estas interacciones a menudo carecen de la resolución necesaria para capturar los matices temporales y espaciales de la activación de las células inmunitarias. Al emplear el análisis de citometría de flujo en suspensiones unicelulares derivadas de tejido cerebral infartado microdisecado, este protocolo ofrece una evaluación más detallada y dinámica de los perfiles de células inmunitarias a lo largo del tiempo 7,8. Este enfoque permite la identificación de poblaciones específicas de células inmunitarias y sus estados funcionales, que son fundamentales para comprender la fisiopatología del accidente cerebrovascular isquémico.

En comparación con técnicas alternativas como la tinción histológica o la secuenciación masiva de ARN, que pueden proporcionar información limitada sobre las contribuciones individuales de los tipos de células inmunitarias, este método de citometría de flujo presenta varias ventajas. Por ejemplo, estudios previos han demostrado que la citometría de flujo permite el análisis de alto rendimiento de múltiples marcadores simultáneamente, lo que facilita una caracterización más completa de los fenotipos y funciones de las células inmunitarias 9,10,11,12,13. Además, la capacidad de este método para adaptarse a una variedad de afecciones neurodegenerativas, como la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, demuestra su versatilidad y relevancia en el cuerpo más amplio de la literatura que aborda las interacciones neuroinmunes.

Para los investigadores que están considerando la aplicación de este método, es esencial evaluar los objetivos específicos de su estudio. Esta técnica es especialmente adecuada para investigaciones que requieren un análisis temporal detallado de las respuestas inmunitarias en el contexto de un accidente cerebrovascular isquémico o enfermedades neurodegenerativas relacionadas. Se recomienda que los usuarios posean una comprensión básica de la citometría de flujo y experiencia con modelos murinos para implementar este protocolo de manera efectiva e interpretar los datos resultantes. Al proporcionar un marco sólido para el estudio de las interacciones neuroinmunes, este método contribuye significativamente a los esfuerzos en curso para delinear las complejidades de la participación inmune en la patología del accidente cerebrovascular.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital de la Amistad de Beijing, Universidad Médica de la Capital. Recomendamos que todas las soluciones se sometan a filtración estéril y que todos los tubos utilizados sean estériles.

1. Preparación de reactivos y tampón

  1. Mezcla de enzimas para la digestión: Disolver la colagenasa IV para obtener una concentración del 0,25% y diluir la DNasa I para alcanzar una concentración final de 2 U/mL.
  2. Tampón de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS): Disuelva la albúmina sérica bovina (BSA) y el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para alcanzar concentraciones de 0,5% y 2 mM en 1x PBS, respectivamente.

2. Modelo de ictus isquémico focal

NOTA: Se emplearon ratones C57BL/6 J (8-10 semanas de edad) para establecer un modelo de accidente cerebrovascular isquémico focal, como se describió anteriormente14. Los ratones pueden ser anestesiados alternativamente utilizando una solución de avertina al 1,25% a una dosis de 0,2 mL por 10 g de peso corporal.

  1. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 3%, manteniendo una dosis del 1,5% con un aparato de anestesia gaseosa. Mantenga la temperatura corporal a 37 °C durante todo el procedimiento con una almohadilla térmica.
    NOTA: Este estudio enfatiza la importancia de verificar el logro del plano quirúrgico previo al inicio del procedimiento. Este paso es crucial para garantizar un acceso óptimo al área objetivo y minimizar las posibles complicaciones durante la cirugía.
  2. Recorta el pelaje en la región entre el ojo derecho y la oreja derecha con una maquinilla de afeitar eléctrica. Cree una incisión vertical en el área designada adyacente a los ojos bajo un microscopio de disección.
  3. Separe suavemente todos los tejidos para exponer el cráneo e identificar la rama distal de la arteria cerebral media derecha (ACM), caracterizada por una estructura vascular vertical en forma de "Y". Utilice un taladro eléctrico para penetrar en el cráneo, teniendo cuidado de extraerlo con cuidado.
  4. Extirpar delicadamente las meninges con micropinzas.
  5. Exponga la rama distal de la arteria cerebral media (ACM) derecha y luego realice una ligadura permanente de la rama distal de la ACM derecha con una sutura 10-0.
  6. Vuelva a colocar el tejido a su estado original y cierre la incisión de la piel del rostro con adhesivo para tejidos.
  7. Coloque el ratón en decúbito supino y recorte el pelaje de la zona del cuello con una maquinilla de afeitar eléctrica.
  8. Cree una incisión horizontal en la región del cuello y separe suavemente las glándulas submandibulares.
  9. Diseccionar cuidadosamente la vaina carotídea con micropinzas, identificando la arteria carótida común y separándola del nervio vago.
  10. Pase una sutura 4-0 a través de la arteria carótida común y asegúrela con un nudo corredizo.
  11. Repita el paso 10 en la arteria carótida común contralateral. Ocluya temporalmente las arterias carótidas comunes bilaterales (CCA) durante 7 min.
  12. Vuelva a colocar el tejido de la glándula submandibular a su posición original y cierre la incisión del cuello con adhesivo para tejidos.
    NOTA: El grupo de operación simulada se sometió a procedimientos idénticos a los del grupo de accidente cerebrovascular, con la única excepción de que el ACM distal y el CCA permanecieron sin ligar.
  13. Monitoree al ratón durante y después del procedimiento quirúrgico, incluyendo su respiración y temperatura corporal. Mantenga el mouse en una almohadilla térmica hasta que esté completamente despierto.

3. Perfusión y disección cerebral

  1. Prepare una jeringa de 50 ml y coloque una aguja de 26 g en su extremo. Llene la jeringa con solución salina.
  2. Administrar una dosis doble de avertin al 1,25% para conseguir una anestesia profunda en el ratón.
    NOTA: Se debe confirmar minuciosamente que el ratón está completamente anestesiado antes de continuar con el siguiente paso.
  3. Coloque el ratón en decúbito supino sobre una tabla de espuma, extendiendo sus extremidades delanteras y traseras, asegurándolas en su lugar con agujas de 26 G.
  4. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, agarre la piel abdominal con pinzas oftálmicas y haga una incisión lateral para revelar el hígado. Proceda a cortar a lo largo de ambos lados de las costillas para exponer el corazón.
  5. Inserte la aguja de 26 g en el ventrículo izquierdo y corte la aurícula, luego presione la jeringa para permitir que la sangre fluya.
  6. Continúe el proceso de perfusión hasta que la sangre que drena de la aurícula parezca clara.
  7. Decapita al ratón justo por encima de la médula espinal con unas tijeras quirúrgicas rectas.
  8. Realiza una incisión posterior-anterior en la piel de la cabeza para descubrir el cráneo. Hacer dos incisiones laterales en la unión de las paredes laterales y la base del cráneo.
  9. Corta el cráneo a lo largo de la sutura sagital y haz una incisión entre las órbitas.
  10. Utilice fórceps para extraer el cráneo que cubre cada hemisferio, exponiendo así el cerebro, y transfiéralo a una matriz cerebral de acero de ratón. Posteriormente, corte el cerebro en cortes coronales consecutivos de 2 mm de grosor.

4. Digestión de tejido cortical en suspensión unicelular y tinción de anticuerpos para citometría de flujo

  1. Introduzca 500 μL de mezcla de enzimas para la digestión en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
  2. Separe delicadamente el tejido del infarto y transfiéralo a la mezcla de enzimas de digestión utilizando micropinzas (Figura 1).
  3. Fragmentar minuciosamente el tejido en los trozos más pequeños posibles con una tijera oftálmica e incubar a 37 °C durante 20 min.
  4. Empleando una pipeta P1000, aspire suavemente y dispense la solución 10 veces para disociar el tejido en células individuales, luego pase la solución a través de un filtro de células de 70 μm. Enjuague continuamente tanto la placa de 12 pocillos como el filtro de celdas con HBSS helado que contenga calcio y magnesio.
  5. Centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 5 min, luego desechar cuidadosamente el sobrenadante.
    NOTA: Dado que los gránulos producidos están bastante sueltos y se desprenden fácilmente, absténgase de perturbarlos para evitar cualquier pérdida de células.
  6. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de 1x PBS y repita el paso 5. Posteriormente, vuelva a suspender el pellet en 150 μL de 1x PBS y transfiera la suspensión a una placa de 96 pocillos con un fondo redondo. A continuación, vuelva a centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 5 min.
  7. Sujete firmemente la placa de 96 pocillos e inviértala rápidamente para desechar el sobrenadante.
  8. Diluya el colorante de fluorescencia de viabilidad celular en una proporción de 1:100 en 1x PBS, luego vuelva a suspender el pellet en una alícuota de 150 μL. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente (RT), protegido de la luz.
  9. Centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante. Diluir el cóctel de anticuerpos de la superficie celular en tampón MACS. Sin lavar las células, añadir el cóctel de anticuerpos de superficie celular e incubar durante 15-20 minutos más a 4 °C.
  10. Centrifugar a 500 × g a 4 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 150 μL de tampón MACS.
  11. Repita el paso 4.10 y transfiera la suspensión a tubos de centrífuga de 1,5 ml o a tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL.

5. Análisis y clasificación por citometría de flujo

  1. Diseñe un panel de citometría de flujo multicolor según la configuración del instrumento, utilizando técnicas manuales o una herramienta de diseño en línea, para optimizar la selección de fluoróforos conjugados con anticuerpos y minimizar la superposición espectral.
    NOTA: Se deben tener en cuenta varias consideraciones fundamentales al diseñar un panel de citometría de flujo multicolor. En primer lugar, es esencial familiarizarse con la configuración del instrumento en uso, incluidos los láseres y los filtros, antes de comenzar. En segundo lugar, emplee etiquetas de fluoróforos brillantes en los anticuerpos para los antígenos de baja abundancia, mientras que opta por etiquetas de fluoróforos tenues en los anticuerpos dirigidos a antígenos altamente expresados. Por último, es imperativo incluir un tinte de viabilidad celular en el panel para excluir eficazmente las células no viables y los residuos de los datos. En particular, para garantizar una compuerta adecuada de antígenos de baja abundancia o mal caracterizados, se deben utilizar controles de fluorescencia menos uno (FMO)15. Los controles FMO abarcan todos los marcadores de linaje excepto el de interés, lo que facilita la delimitación precisa entre las células teñidas positiva y negativamente16.
  2. Ajuste la configuración de los detectores de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) para garantizar que las celdas de interés se muestren correctamente en la escala y se puedan compuerta según sea necesario.
  3. Ajuste meticulosamente FSC y SSC para eliminar residuos o ruido extraño. Diferencie los dobletes de las celdas individuales dentro de un diagrama de puntos que ilustra tanto el área como la altura de FSC. Aísle las células viables en función de la señal negativa de colorante de fluorescencia de la viabilidad celular.
    NOTA: Los ajustes de varios instrumentos pueden presentar ligeras variaciones. Por ejemplo, algunos clasificadores de células emplean la anchura y la altura de FSC para distinguir los dobletes de las células individuales, mientras que otros utilizan el área y la altura de FSC para el mismo propósito.
  4. Ajuste la compensación para cada canal.
    NOTA: Tanto las muestras celulares como las perlas de compensación disponibles en el mercado pueden emplearse con el fin de compensar el derrame fluorescente.
    1. Compare el control de autofluorescencia (células no teñidas) con los controles positivos de células teñidas para asegurarse de que las células teñidas se escalan adecuadamente para cada parámetro. Además, ajuste la compensación mediante el análisis de muestras de células multicolores, la supervisión de diagramas de puntos de 2 colores y el ajuste de la configuración de compensación hacia arriba o hacia abajo para garantizar que las poblaciones de células estén alineadas vertical u horizontalmente entre sí.
    2. Utilice las señales CD45 y CD11b para distinguir entre linfocitos (CD11b-CD45alto), microglía (CD11b+CD45int), células mieloides (CD11b+CD45alto) y astrocitos (CD11b-CD45- GLAST+)17,18.
    3. Emplear tejido cerebral simulado como control de autofluorescencia y referencia para discriminar linfocitos. Si se está examinando un objetivo específico, utilice un control FMO con tejido cerebral posterior al accidente cerebrovascular.
  5. Comience la recopilación de datos de control y muestra y asegúrese de que se guarden.
    NOTA: Dado que el modelo de mini-accidente cerebrovascular descrito aquí da como resultado un infarto pequeño, por lo general se recolectan menos células que el modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). En general, la recolección de 5 × 105 células produce aproximadamente 5 × 103 microglias y 1 × 105 astrocitos, respectivamente.
  6. Seleccione y clasifique las poblaciones celulares deseadas en tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL o tubos de centrífuga cónicos de 15 mL.
    NOTA: Agregue 500 μL de PBS y enjuague meticulosamente el tubo para garantizar la viabilidad de las células y ayudar en la formación de la pellet.

6. Análisis de la expresión génica en poblaciones celulares seleccionadas

NOTA: La extracción de ARN total puede realizarse alternativamente utilizando kits comerciales siguiendo las pautas del fabricante.

  1. Centrifugar las células del paso 5.6 a 500 × g a 4 °C durante 3 min, luego desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de reactivo TRIzol.
    NOTA: El número de células clasificadas es considerablemente menor en comparación con las células o tejidos cultivados. En consecuencia, una velocidad de centrifugación más alta puede ayudar a formar un pellet de celda más compacto. Las células obtenidas de este paso se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como el cultivo celular o las tuberías de secuenciación de ARN de una sola célula.
  2. Deje que la muestra permanezca en RT durante 5 min para facilitar la disociación de los complejos de nucleoproteínas.
  3. Añada 0,2 mL de cloroformo a la muestra y asegure el tubo. Agite los tubos vigorosamente durante 15 s, luego incube durante 2 min a RT.
  4. Centrifugar las muestras a 10.000 g durante 15 min a 4 °C. El ARN permanecerá únicamente en la fase acuosa superior.
  5. Transfiera con cuidado la fase acuosa superior a un tubo limpio, teniendo cuidado de no alterar la interfaz.
    NOTA: El volumen de la fase acuosa debe ser de aproximadamente 500 μL.
  6. Precipitar el ARN de la fase acuosa introduciendo 0,5 mL de isopropanol y mezclando suavemente invirtiendo el tubo varias veces. Incubar las muestras en RT durante 10 min.
  7. Centrifugar las muestras a 10.000 g durante 10 min a 4 °C para recoger el ARN.
  8. Decantar el sobrenadante y eliminar a fondo cualquier líquido residual por aspiración.
  9. Lave el pellet de ARN una vez con etanol al 75%, agregando un mínimo de 1 mL de etanol al 75%. Mezclar bien la muestra y, a continuación, centrifugar a 7500 × g durante 5 min a 4 °C.
  10. Elimina todo rastro de etanol. Seque al aire el pellet de ARN durante 5 min.
  11. Disuelva el ARN en 10 μL de agua libre de ARNasa pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  12. Proceda a realizar PCR en tiempo real de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, presentamos un protocolo refinado para evaluar la funcionalidad de las células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico, empleando análisis citométrico de flujo dentro de un modelo de mini-accidente cerebrovascular. El mini-accidente cerebrovascular fue inducido por la ligadura permanente de la rama distal de la arteria cerebral media derecha (ACM), seguida de una oclusión de 7 min de las arterias carótidas comunes (CCA) bilaterales. Esta metodología produce un accidente cerebrovasc...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, presentamos un protocolo detallado para evaluar la función de las células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico, utilizando el análisis de citometría de flujo en un modelo de mini-accidente cerebrovascular. Los pasos críticos de este protocolo incluyen el establecimiento de un accidente cerebrovascular isquémico focal a través de la ligadura permanente de la rama distal de la arteria cerebral media derecha (ACM) junto con una oclusión de siete mi...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 82201622) y la Fundación de Ciencias Naturales de Mongolia Interior (n.º 2020MS03017).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mlNIDO 615601Material de laboratorio
1&veces; PBSCorning21-040-CMReactivo
Microplaca tratada con TC de fondo redondo transparente de 96 pocillosCorning3799Material de laboratorio
APC anti-ratón CD19Bioleyenda152410Anticuerpo
APC/Cianina7 anti-ratón CD45Bioleyenda103116Anticuerpo
Avertin (1,25%)Nanjing Aibei Biotechnology M2920Reactivo
BD FACSAria IIBD642510Equipo
Violeta Brillante 421 anti-ratón CD4Bioleyenda100437Anticuerpo
Violeta Brillante 605 anti-ratón / humano CD11bBioleyenda101237Anticuerpo
BSASigma-AldrichA1933-1GQuímico
Colagenasa IVSigma-AldrichC4-28-100MGEnzima
ADNasa ILaboratorios biológicos de Nueva InglaterraM0303LEnzima
EDTASigma-AldrichEDS-100GQuímico
Tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo Falcon de 5 mlCorning352052Material de laboratorio
Halcón  Tubos de centrífuga cónicos de 15 mlCorning352095Material de laboratorio
FlowJo V10BDSoftware
GLAST (ACSA-1) Anticuerpo, PEMiltenyi Biotec130-118-344Anticuerpo
IsofluranoCiencias de la vida RWDR510-22-10Reactivo
PE/Cianina7 anti-ratón CD3Bioleyenda100220Anticuerpo
PE/Dazzle 594 anti-ratón NK-1.1Bioleyenda156518Anticuerpo
Reactivo TRIzolThermo Fisher Scientific Inc.15596026Reactivo
Agua destilada sin DNasa/RNasa UltraPureThermo Fisher Scientific Inc.10977015Reactivo
Adhesivos tisulares Vetbond3M1469SBMaterial de laboratorio
Kit de viabilidad reparable Zombie AquaBioleyenda423102Colorante fluorescente reactivo a las aminas

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleindorfer, D. O., et al. 2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  2. Pu, L., et al. Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030. Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).
  3. Cheng, Y., et al. Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021. J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).
  4. Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown. Front Immunol. 12, 784098(2021).
  5. Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke. J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).
  6. Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases. Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).
  7. Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke. Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).
  8. Garcia-Bonilla, L., et al. Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke. Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).
  9. Stevens, S. L., et al. The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22 (1), 72-85 (1998).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  12. De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  13. Mcdonough, A., Weinstein, J. R. Neuroimmune response in ischemic preconditioning. Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).
  14. Wang, S., et al. Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke. Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).
  15. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).
  16. Siddiqui, S., Livak, F. Principles of advanced flow cytometry: A practical guide. Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).
  17. Sousa, C., et al. Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures. EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).
  18. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. 124, e55781(2017).
  19. Zhang, W., et al. Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke. Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).
  20. Mao, J. H., et al. Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions. Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).
  21. Shui, X., et al. Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges. J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).
  22. Feng, Y., et al. Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models. J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).
  23. Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression. Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).
  24. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  25. Leelatian, N., et al. Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).
  26. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).
  27. Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research. Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).
  28. Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration. Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).
  29. Rui, W., et al. Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).
  30. Rauber, S., et al. Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies. J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).
  31. Rayaprolu, S., et al. Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Ictus isqu micocitometr a de flujomodelo de mini ictusactivaci n de c lulas inmunitariasdisociaci n de tejido cerebralsuspensi n de c lulas nicascuantificaci n de c lulas inmunitariasneuroinflamaci nmodelo murino de ictus

Artículos relacionados