Artículo de método

Explorando los eventos celulares secuenciales de fagocitosis desencadenados por Godanti Bhasma en células de mamíferos

DOI:

10.3791/68321

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11 de julio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shobhit Institute of Engineering & Technology

En este artículo

Resumen

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Este estudio dilucida el procesamiento fagocítico de las partículas de Godanti Bhasma (GB) en células de mamíferos, caracterizando su absorción celular, dinámica de vacuolas, acidificación y degradación. Estos hallazgos no solo avanzan en nuestra comprensión de los mecanismos fundamentales de la fagocitosis, sino que también establecen a la GB como un sistema modelo prometedor para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Resumen

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La fagocitosis es un mecanismo celular vital a través del cual las células engullen y degradan partículas extrañas, patógenos o desechos, desempeñando un papel clave en la defensa inmunitaria y el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos. Las interrupciones en este proceso están asociadas con diversas enfermedades. Para explorar los eventos complejos involucrados en la vía de la fagocitosis, son esenciales las partículas inteligentes avanzadas y las técnicas de monitoreo efectivas. Godanti Bhasma (GB), una medicina tradicional india compuesta por partículas bioactivas de sulfato de calcio, se internaliza rápidamente por fagocitosis en células de mamíferos, induciendo una vacuolación citoplasmática significativa. Las etapas clave de la fagocitosis inducida por GB se evaluaron aquí mediante citometría de flujo (FC), imágenes de células vivas y técnicas de tinción específicas. El análisis de citometría de flujo demostró la formación de estructuras fagocíticas en forma de copa asociadas con la internalización de partículas. Las imágenes de células vivas permitieron la observación en tiempo real de los procesos fagocíticos, incluida la absorción de partículas, la formación de vacuolas, la degradación de los materiales engullidos y el recambio vacuolar. Se empleó la tinción con rojo neutro y naranja acridina para evaluar la acidificación vacuolar. Curiosamente, el tratamiento con el inhibidor lisosomal BFA1 en las células tratadas con GB no condujo a la vacuolización, como lo demuestra la falta de absorción de rojo neutro, lo que enfatiza el requisito de un ambiente ácido para que ocurra la vacuolización. Estos hallazgos subrayan el potencial de la fagocitosis inducida por GB como modelo para dilucidar los eventos celulares secuenciales involucrados en este proceso, que es fundamental para comprender las interacciones huésped-patógeno, el tráfico intracelular y el desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras para los trastornos relacionados con la fagocitosis.

Introducción

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La fagocitosis es un proceso celular esencial llevado a cabo por fagocitos profesionales residentes en los tejidos, como macrófagos y células dendríticas, así como fagocitos no profesionales, como células epiteliales y fibroblastos, que engullen y degradan partículas extrañas. Estas células internalizan y eliminan partículas extrañas, patógenos o desechos celulares, contribuyendo significativamente a la defensa inmunitaria y la homeostasisde los tejidos. Este proceso comienza con el reconocimiento de patógenos, desechos o partículas a través de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), como los receptores tipo Toll (TLR), que se unen a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP)2. Este reconocimiento desencadena la formación de una copa fagocítica, donde las protuberancias de la membrana plasmática se extienden alrededor de la partículaobjetivo 3. Los filamentos de actina juegan un papel crucial en este paso, impulsando la remodelación de la membrana necesaria para la envoltura de partículas4. Una vez que la partícula está encerrada en un fagosoma, se forma una vesícula unida a la membrana. El fagosoma experimenta una maduración, caracterizada por la fusión con endosomas tempranos y luego tardíos, seguida de la incorporación de lisosomas que contienen enzimas hidrolíticas5. Estas enzimas, como las catepsinas, la lisozima y las nucleasas, se activan por acidificación dentro del fagosoma, lograda por la ATPasa vacuolar (V-ATPasa), lo que reduce el pH a 4,5-5,5. El proceso degradativo concluye con la exocitosis de los restos de la célula. Las disfunciones en este proceso dinámico y complejo pueden dar lugar a importantes desafíos inmunológicos 6,7,8.

Para evaluar con precisión el complejo proceso celular de la fagocitosis, se necesitan métodos mejorados y sencillos para controlar los principales eventos celulares de la fagocitosis. Tradicionalmente, el método de monitorización para la cuantificación de la fagocitosis implica técnicas como la fijación de fagocitos a intervalos de tiempo predeterminados para la visualización microscópica, la medición de la internalización de los objetivos marcados con colorante mediante imágenes o citometría de flujo o el recuento del número de células diana que quedan después de una duración específica de fagocitosis, sin embargo, estos métodos no capturan las fluctuaciones minuto a minuto que se producen durante el proceso de fagocitosis9. Además, los métodos que se basan en indicadores indirectos, como la absorción de colorante, pueden no reflejar con precisión los eventos fagocíticos reales debido a la posible transferencia pasiva de colorante10.

Los avances recientes en la obtención de imágenes de células vivas, la citometría de flujo y las técnicas de tinción han revolucionado nuestra capacidad para controlar la fagocitosis con alta precisión espacio-temporal. Las imágenes de células vivas, por ejemplo, permiten la observación continua de procesos dinámicos con seguimiento secuencialde eventos 11. La citometría de flujo es ampliamente utilizada para el análisis de células de mamíferos y la detección de biomarcadores en la investigación clínica12. Sin embargo, los métodos tradicionales de FC no están equipados para evaluar las características morfológicas y espaciales de las células individuales12. La citometría de flujo por imágenes (IFC) sirve como una alternativa sólida que permite la recopilación de información detallada de células individuales. IFC combina las capacidades analíticas de la citometría de flujo con imágenes de alta resolución, lo que permite el análisis de una sola célula con detalles morfológicos y espaciales. Varias partículas, incluidas las perlas de látex fluorescentes, zymosan-APC y nanopartículas sintéticas, se utilizan comúnmente para estudiar la fagocitosis, proporcionando información sobre la participación de los receptores, la formación de fagosomas y las respuestas inmunitarias12.

A diferencia de las técnicas bioquímicas convencionales, que normalmente se basan en el análisis de puntos finales, las imágenes de células vivas proporcionan una monitorización continua y dinámica de los procesos celulares. Este método ofrece una alta resolución espacio-temporal y la capacidad de observar eventos secuenciales en la fagocitosis. Como resultado, es una herramienta poderosa para estudiar el complejo proceso de la fagocitosis, lo que permite obtener información más precisa y detallada sobre los comportamientos y mecanismos celulares13.

Además de los avances en los sistemas de imágenes, existe la necesidad de partículas fagocíticas inteligentes que puedan resaltar claramente los eventos fagocíticos, en particular los pasos de degradación que ocurren dentro del fagosoma. Los estudios de fagocitosis a menudo utilizan partículas como perlas de látex, zymosan, bacterias, células apoptóticas y nanopartículas sintéticas para explorar mecanismos como la participación de los receptores, la formación de fagosomas y las respuestas inmunitarias. Si bien estas partículas proporcionan información valiosa, tienen limitaciones para rastrear el proceso de degradación completo o evaluar directamente la maduración del fagosoma. Por ejemplo, las perlas de látex no son biodegradables y no pueden demostrar degradación, mientras que el zymosan y las bacterias a menudo requieren un etiquetado complejo y pueden no producir perfiles de degradación consistentes14,15.

Nuestro estudio previo demostró la utilidad de GB, una formulación ayurvédica tradicional compuesta principalmente de sulfato de calcio, como una partícula ideal para estudiar la maduración y degradación del fagosoma16. El GB se disuelve con el tiempo en el entorno ácido del fagosoma, lo que permite una visualización clara de la degradación de las partículas. Además, la capacidad de GB para inducir una formación robusta de vacuolas facilita la investigación de distintas etapas de la maduración del fagosoma, desde la formación temprana hasta la acidificación y la resolución final. A diferencia de otras partículas, GB elimina la necesidad de marcaje externo, proporcionando un sistema autosostenido para estudiar el ciclo de vida completo de los fagosomas, lo que lo convierte en un modelo ideal para comprender la dinámica de la fagocitosis y los trastornos asociados16.

Este estudio presenta un protocolo estandarizado y reproducible diseñado para evaluar la fagocitosis inducida por partículas y la formación de vacuolas utilizando Godanti Bhasma (GB) en líneas celulares fagocíticas profesionales (RAW 264.7) y no profesionales (HeLa y 3T3-L1). El objetivo general de este método es proporcionar una plataforma sólida para estudiar los mecanismos de absorción celular, la biogénesis vacuolar y el procesamiento de partículas intracelulares en diferentes tipos de células. El GB se suspendió en DMEM a una concentración de 10 mg/mL y, para garantizar la uniformidad, se permitió que las partículas más grandes se sedimentaran mientras se recogía la fracción superior para su uso experimental. Para los ensayos de citometría de flujo, las células se sembraron a una densidad de 2 x 105 células por pocillo en placas de 12 pocillos, y se añadieron 300 μL de la suspensión de trabajo GB a cada pocillo. Para los análisis basados en imágenes, se sembraron entre 5.000 y 10.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos o en portaobjetos de cámara. Este método establece a la GB como un modelo confiable para investigar la formación de vacuolas y la internalización de partículas en diversos tipos celulares.

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Protocolo

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1. Cultivo celular y siembra

  1. Prepare medio DMEM completo suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y antibióticos (100 μg/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina). Esterilice todos los reactivos y equipos antes de usarlos.
  2. Cultive las células 3T3-L1, HeLa y RAW 264.7 en matraces de25 cm2 y placas de cultivo de 35 mm utilizando DMEM. Mantener los cultivos a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 y sustituir el medio cada 48 h.
  3. Para el subcultivo, lavar las células 2 veces con PBS, luego separar las células adherentes con 500 μL de tripsina-EDTA e incubar durante 5 minutos. Agregue 1 mL de DMEM para neutralizar la solución de tripsina-EDTA, pipetea para crear una suspensión de una sola celda y ajuste el volumen a 10 mL con DMEM nuevo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, resuspender el pellet en 1 mL de medio fresco.
  4. Mezclar 10 μL de suspensión celular con azul de tripano al 0,4% (1:1), contar las células viables con un hemocitómetro, calcular la densidad como células/mL = Recuento medio x 104 x 2.
  5. Para placas de 96 pocillos: Dispense 100 μL de la suspensión celular (que contiene 10,000 celdas) en cada pocillo. Para los portaobjetos de cavidad, siembre 50 μL de la suspensión celular (que contiene 5000 celdas) en dos cavidades, dejando vacía la cavidad central. Añadir 50 μL de DMEM a cada una de las cavidades sembradas.
  6. Incubar las placas y portaobjetos a 37 °C en un 5% de CO2 durante 24 h para permitir la adherencia y estabilización de las células. Inspeccione las células bajo un microscopio invertido con un aumento de 20x para evaluar la morfología, la confluencia y la contaminación antes de continuar con los experimentos.

2. Preparación de la solución/cóctel madre GB para el cultivo celular

  1. Obtenga GB y pese 100 mg del polvo con precisión. Suspender el polvo en 10 mL de DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Agite la suspensión y déjela reposar durante 1 minuto para permitir que las partículas más grandes se asienten. Luego, transfiera los 5 ml superiores de la suspensión a un tubo de centrífuga estéril.
  3. Designe esta suspensión GB preparada de 5 mL como solución madre para experimentos de cultivo celular posteriores. Agite la suspensión a fondo para asegurar una dispersión uniforme de las partículas antes de agregarlas a las celdas.

3. Análisis de citometría de flujo

  1. Cosechar células RAW 264.7, HeLa o 3T3-L1 por tripsinización, neutralizar con DMEM completo, centrifugar a 300 x g durante 5 min, resuspender en 1 mL de medio fresco, mezclar 10 μL con azul de tripano al 0,4% (1:1), contar las células viables con un hemocitómetro, calcular la densidad y ajustar a 2 x 105 células/mL.
  2. Siembre 2 x 105 celdas por pocillo en una placa de 12 pocillos y cultive durante 24 h. Incubar a 37 °C con 5% de CO2.
  3. Trate las células con suspensión GB (300 μL por pocillo) durante varias duraciones: 30 min, 1 h y 12 h. Después del tratamiento, lave las células 5 veces con PBS para eliminar el exceso de partículas.
  4. Tripsinizar las células como en el paso 1.3 y lavarlas a fondo con PBS. Cargue la suspensión preparada en el puerto de muestra del citómetro de flujo. Inicie el software y seleccione la configuración de adquisición adecuada. Elija el modo de campo claro para la obtención de imágenes.
  5. Inicie la adquisición de datos haciendo clic en Ejecutar en el software. Adquiera datos de al menos 10.000 eventos a medida que el sistema captura imágenes de celdas individuales que pasan a través de la celda de flujo.
  6. Utilice diagramas de dispersión de área frente a relación de aspecto para controlar celdas intactas individuales. Esto ayuda a excluir dobletes y clústeres. Vea las imágenes correspondientes en la biblioteca de imágenes. Recopile imágenes de células individuales de la biblioteca de imágenes del software para estudiar los cambios morfológicos inducidos por el tratamiento.
  7. Para el análisis de partículas, siembre 2 x 105 celdas por pocillo en placas de 12 pocillos y cultive durante 24 h. Tratar las celdas con suspensión GB (300 μL por pocillo) durante diferentes duraciones: 1 h, 7 h, 14 h y 24 h.
  8. Después del tratamiento, agite suavemente la placa de cultivo durante 1 minuto y recoja los medios de cultivo en tubos de 1,5 ml. Lave las células 5 veces con PBS para eliminar cualquier partícula extracelular.
  9. Añadir 500 μL de tampón RIPA (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM de NaCl; 0,1% de Triton X-100; 1% de desoxicolato de sodio) para lisar completamente las células.
  10. Haga pasar el medio de cultivo y las muestras de células lisadas que contienen partículas por separado a través del citómetro de flujo. Cargue las muestras en el puerto de muestras del sistema. Inicie el software y seleccione la configuración de adquisición adecuada. Elija el modo de campo claro para el análisis de partículas.
  11. Inicie la adquisición de datos haciendo clic en Ejecutar en el software. Adquiera datos de al menos 20.000 eventos a medida que el sistema captura imágenes de partículas individuales que pasan a través de la celda de flujo.
  12. Utilice diagramas de dispersión de área frente a relación de aspecto para controlar todas las partículas. Utilice las herramientas de diagrama de dispersión para analizar el recuento de partículas.

4. Microscopía de lapso de tiempo

  1. Cultivo de células 3T3-L1 (3.0 x 104) en una placa de 35 mm con 2 mL de DMEM a 37 °C en un 5% de CO2 hasta alcanzar el 70% de confluencia.
  2. Mezcle bien 300 μL de suspensión GB en el medio de cultivo fresco precalentado de 2 mL y luego coloque la placa de cultivo con las células y GB, en la platina del microscopio de imágenes.
  3. Selecciona el objetivo 10x. Encienda la iluminación de campo claro con el botón Bright. Haga clic en el botón Película para entrar en el modo de lapso de tiempo. Establezca el tiempo del intervalo en 5 min. Comience a grabar haciendo clic en el botón Rec .
  4. Capture imágenes a intervalos de 5 minutos durante 16 h a 24 h, lo que garantiza la obtención de imágenes continuas en condiciones estándar en una incubadora de CO2 .
  5. Utilice el software ImageJ para compilar las imágenes capturadas en un vídeo time-lapse. Esta técnica permite diferenciar varias etapas de la fagocitosis, desde la internalización hasta la degradación completa de las partículas.

5. Tinción roja neutra

  1. Después de 24 h de crecimiento celular en placas de 96 pocillos y portaobjetos de cavidad, mezcle bien el material de suspensión de partículas GB y agregue 30 μL de la suspensión a cada pocillo o cavidad.
  2. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h para inducir la formación de vacuolas. Utilice los pozos o cavidades no tratados como controles negativos.
  3. Para la tinción con rojo neutro (NR), prepare una solución de NR de 0,5 mg/ml en DMEM sin suero y fíltrela a través de un filtro de 0,2 μm.
  4. Para la obtención de imágenes de vacuolas en placas de 96 pocillos y portaobjetos de cavidad: retire el medio, agregue 60 μL de colorante NR e incube a 37 °C durante 15 min. Lave 3 veces con PBS para eliminar el exceso de tinte y luego proceda con imágenes microscópicas.
  5. Examine las vacuolas bajo un microscopio utilizando el objetivo 20x, para evaluar el tamaño, la morfología y el número de vacuolas.

6. Tratamiento con bafilomycina A1 para la formación de vacuolas y la inhibición de la acidificación

  1. Prepare una solución madre de bafilomicicina A1 (BFA1) a una concentración de 100 μg/mL (160,5 nM) disolviendo 100 μg de BFA en 50 μL de DMSO, seguido de dilución en 950 μL de DMEM. Diluir 1 μL de este material en 1,6 mL de DMEM para obtener una solución de trabajo de 0,1 nM.
  2. Mezcle bien y agregue 100 μL de la solución de BFA en funcionamiento a los pocillos que contienen celdas en las placas de 96 pocillos. Además, agregue 30 μL de suspensión de partículas GB para evaluar la inhibición de la formación de vacuolas y fagosomas.
  3. Para inhibir la acidificación de los fagosomas, agregue 100 μL de la solución de BFA de trabajo a los pocillos con vacuolas preformadas (previamente tratadas con partículas GB). Incubar todos los pocillos a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h.
  4. Añada 60 μL de colorante rojo neutro (NR) a cada pocillo, incube durante 15 minutos más y analice la formación de vacuolas y la acidificación.

7. Tinción de naranja acridina (AO)

  1. Tratar las células cultivadas en portaobjetos de cavidad con 50 μL de GB e incubar durante la noche en condiciones experimentales estándar.
  2. Después del tratamiento, incubar las células con una solución de naranja de acridina (1 mg/mL) durante 15 min a 37 °C para permitir la tinción selectiva de vacuolas y orgánulos vesiculares ácidos.
  3. Lave las células 3 veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el tinte no unido y minimizar la fluorescencia de fondo.
  4. Analice rápidamente los portaobjetos con un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de 20x y un rango de filtro de excitación azul de 450-492 nm, para evaluar la morfología celular y la absorción de naranja de acridina, lo que proporcionará información sobre la dinámica vacuolar.

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Resultados

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El estudio destaca las respuestas celulares clave a las partículas GB en células de mamíferos. Utilizamos un citómetro de flujo de imágenes para investigar la internalización de partículas GB en células 3T3-L1 (Figura 1). Las células se expusieron a partículas durante períodos que oscilaron entre 30 minutos y 12 horas. Después de 30 min, observamos las partículas en la superficie celular (Figura 1B), y la membrana celular comenzó a plegarse hacia adentro en los ...

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Discusión

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La fagocitosis sirve como un mecanismo de defensa inmunitaria crucial, lo que permite la absorción y posterior eliminación de partículas, patógenos y células apoptóticas. Para comprender los procesos de formación y maduración de fagosomas, las partículas biocompatibles inteligentes combinadas con técnicas de imagen avanzadas son esenciales para estudiar eventos dinámicos como la progresión vacuolar, la acidificación y la degradación de los materiales engullidos18,19

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Esta investigación contó con el apoyo de la Subvención de Investigación Básica de la Junta de Investigación en Ciencia e Ingeniería (SERB) (CRG/2022/009045), Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Frascos de cultivo de 25 cm2NEST, India707001
Placas de 96 y 6 pocillosTarsons India Pvt. Ltd., Calcuta, India; Thermo Scientific, India980040; 140675
Naranja de acridinaSRL, India82407
Antibióticos y solución de tripsina-EDTAAlta Prensa, India628242; 655111
Líneas celulares: HeLa, 3T3-L1 y RAW-264.7Centro Nacional de Ciencia Celular (NCCS), Pune, Maharastra
Platos de cultivo (35mm) SPL Lifesciences, India101350
Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM)MP Biomedicles, India1033126
Suero fetal bovino (FBS)Alta Prensa, India651257
Citómetro de flujoMillipore, Estados UnidosAmnisCitómetros de flujo de imágenes Amnis,
Microscopio fluorescenteDiGi Lab, IndiaModelo: DiGi 110 Infinity
Godanti BhasmaPatanjali Ayurved240002
Tinte rojo neutroCDH, India593630
Microscopio de lapso de tiempoNanoEnTek Inc. Seúl, Corea.JuliAnalizador de células fluorescentes inteligente JuLi,
Microscopio de lapso de tiempoLEEDZ MICRO IMA. Reino UnidoS.No. LIM225552358A58EA PRIME Microscopio invertido

Referencias

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