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Artículo de método

RNA-Seq revela la vía de diferenciación de células Th17 como mecanismo de lesión cerebral inducida por radiación

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DOI:

10.3791/68322

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20 de junio de 2025

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1Beijing Institute of Radiation Medicine

En este artículo

Resumen

Este estudio tiene como objetivo investigar la activación de la vía de diferenciación celular Th17 en ratones con lesión cerebral inducida por radiación.

Resumen

La radioterapia es una modalidad terapéutica prevalente para las neoplasias malignas de cabeza y cuello; sin embargo, invariablemente resulta en daño inducido por la radiación en el tejido cerebral normal, que culmina en una lesión cerebral (RBI) inducida por la radiación. A pesar de la amplia investigación sobre la neuroinflamación inducida por la radiación, la asociación entre RBI y la vía de diferenciación de las células Th17 sigue siendo inadecuada. Los ratones C57BL/6 se sometieron a una única administración de irradiación craneal de 30 Gy para desarrollar el modelo RBI. La función cognitiva se evaluó a través del laberinto acuático de Morris (MWM), la prueba de campo abierto, la prueba de reconocimiento de objetos novedosos y la prueba de rotarod. Las alteraciones histopatológicas en el tejido cerebral se analizaron mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E). La tinción con inmunofluorescencia se empleó para evaluar la activación de la microglía (IBA-1) y los astrocitos (GFAP). La secuenciación de ARN se llevó a cabo para identificar genes expresados diferencialmente, mientras que Simple Western y qPCR se utilizaron para examinar las moléculas de señalización clave involucradas en la diferenciación de las células Th17. Los ratones RBI demostraron marcados déficits cognitivos, particularmente en el aprendizaje espacial y la retención de la memoria. El examen histológico indicó la activación de la microglía y los astrocitos dentro de la corteza y el hipocampo de los ratones irradiados. El análisis de secuenciación de ARN identificó un enriquecimiento significativo de la vía de diferenciación celular Th17 en la corteza del grupo RBI. La validación adicional a través de análisis Simple Western y qPCR confirmó la regulación positiva de TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 y P-STAT3 en la corteza de ratones RBI. Estos hallazgos sugirieron que la vía de diferenciación de células Th17 desempeñó un papel fundamental en la patogénesis de la lesión cerebral inducida por la radiación. La neuroinflamación mediada por las células Th17 puede ser un mecanismo crítico subyacente a la disfunción cognitiva inducida por la radiación.

Introducción

La radioterapia es un tratamiento crucial para los tumores de cabeza y cuello primarios y metastásicos, pero la lesión cerebral inducida por radiación (RBI) puede ocurrir como una complicación grave, caracterizada por daño al sistema nervioso central. La incidencia de RBI varía según el tipo de tumor y la modalidad de tratamiento, con tasas notificadas que oscilan entre el 28-50% después de la radioterapia estereotáctica para los meningiomas1, el 1,9-5% para el carcinoma nasofaríngeo 2,3, el 1%-24% para los gliomas de bajo grado 4,5 y el 8-20% para las metástasis cerebrales 6,7. La RBI se clasifica en tipos agudos, tardíos y tardíos, con disfunción cognitiva, en particular deterioro de la memoria, y déficits de aprendizaje prominentes en la forma tardía. La disfunción cognitiva inducida por la radiación (DCRI), que afecta al 50%-90% de los supervivientes a largo plazo de cánceres de cabeza y cuello, tiene un impacto significativo en la calidad de vida8, pero su patogenia sigue siendo poco conocida y faltan estrategias preventivas y terapéuticas eficaces.

La neuroinflamación es una característica patológica clave de la RBI, que exacerba la alteración de la barrera hematoencefálica y dificulta la neurogénesis en el hipocampo. Las células Th17, un subconjunto de células T CD4+ conocidas por producir la citoquina proinflamatoria IL-179, se han relacionado con varias enfermedades neurodegenerativas, como la esclerosis múltiple y la enfermedad de Parkinson10,11. Estas células, bajo ciertas condiciones inflamatorias, pueden cruzar la barrera hematoencefálica y contribuir a la neuroinflamación12. Desde su descubrimiento en 2005, las células Th17 han atraído la atención tanto por su papel en las respuestas inmunitarias contra patógenos como por su implicación en enfermedades inflamatorias, lo que las convierte en un objetivo potencial para estudiar los mecanismos de la RBI y la disfunción cognitiva relacionada.

En este estudio, solo se utilizaron ratones machos. La exclusión de las mujeres tuvo como objetivo evitar los posibles efectos de confusión derivados de las fluctuaciones neuroinflamatorias asociadas al ciclo estral, ya que los niveles de progesterona pueden variar hasta diez veces en las diferentes fases del ciclo14. Además, nuestro modelo experimental fue diseñado para reflejar el contexto clínico de la radioterapia contra el cáncer de cabeza y cuello, en el que aproximadamente el 72% de los pacientes son varones15. De acuerdo con esto, la mayoría de los estudios publicados que investigan los mecanismos de la lesión cerebral inducida por la radiación (RBI) han utilizado roedores machos para establecer las características patológicas de referencia16.

Si bien se han empleado varios modelos para estudiar la RBI, las metodologías tradicionales como la tinción histopatológica y la transferencia de Western simple enfrentan limitaciones en términos de sensibilidad, rendimiento y precisión17. Los avances recientes, como la secuenciación de ARN (RNA-Seq) y la proteómica de alto rendimiento, han proporcionado información más sólida sobre los mecanismos moleculares que subyacen a RBI18. Estas tecnologías permiten una comprensión integral de los cambios en la expresión génica y las alteraciones de las proteínas, proporcionando datos más precisos que los métodos anteriores19. Simple Western, en particular, es una técnica novedosa y automatizada que combina las ventajas de la electroforesis capilar con la detección de proteínas mediante quimioluminiscencia, lo que facilita el análisis de alto rendimiento con un volumen de muestra mínimo y una mayor reproducibilidad20. En comparación con el Western blot tradicional, Simple Western elimina la necesidad de transferencia de membrana y proporciona datos cuantitativos de expresión de proteínas, ofreciendo varias ventajas en términos de sensibilidad y reproducibilidad, especialmente en la detección de proteínas de baja abundancia21,22.

Las directrices prácticas para la extracción y preparación de ARN son cruciales para el éxito de la secuenciación y cuantificación de alta calidad. Para una extracción óptima de ARN, recomendamos utilizar kits de aislamiento de ARN de alta calidad y asegurarse de que la concentración esté dentro del rango de 100-1000 ng/μL, con un número de integridad de ARN (RIN) superior a 7,0 para evitar la degradación. Al realizar análisis de proteínas con Simple Western, es importante asegurarse de que las muestras de proteínas se desnaturalicen correctamente y se carguen a una concentración de aproximadamente 1-5 μg por capilar. Para la validación de qPCR, utilice ADNc de alta calidad sintetizado a partir de al menos 1 μg de ARN, lo que garantiza condiciones de transcripción inversa consistentes. Los errores comunes en la preparación de ARN, como la contaminación con ADN genómico o la degradación del ARN, deben evitarse mediante el uso de equipos libres de ARNasa y la separación de fases con prontitud para evitar la degradación del ARN.

Mediante la incorporación de estos métodos, este estudio tiene como objetivo investigar si la vía de diferenciación celular Th17 se activa en modelos murinos de RBI y cómo contribuye a la patogénesis de la disfunción cognitiva inducida por la radiación.

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Protocolo

Los procedimientos experimentales que se llevan a cabo aquí están en estricta conformidad con las directrices ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Se obtuvo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Medicina Radiológica de Beijing (Aprobación No. AF/SC-08/02; Fecha: 25 de febrero de 2024).

1. Irradiación craneal de ratones

  1. Se utilizaron un total de 10 ratones machos C57BL/6 de 6 a 8 semanas en el estudio, asignando cinco animales al grupo RBI y cinco al grupo de control, donde el grupo de control consta de ratones de control en blanco que no recibieron RBI. Mantenga a los ratones en condiciones ambientales controladas, incluyendo temperatura y humedad reguladas y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Aclimatar a los ratones durante 1 semana antes de comenzar el experimento.
  2. Anestesiar a los animales mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% a 50 mg/kg de peso corporal. Confirme la anestesia adecuada comprobando la ausencia de respuesta refleja a un pellizco firme de la pata. Aplique ungüento oftálmico veterinario en ambos ojos inmediatamente después del inicio de la anestesia para prevenir la sequedad de la córnea.
  3. Coloque a los animales en decúbito prono con un dispositivo de sujeción de madera específico y cubra las áreas del cuerpo no deseadas con una placa protectora de plomo (Pb) de 3 mm de espesor (99,9% de pureza) para garantizar la irradiación localizada.
  4. Colimar el campo de irradiación de 2 x 2cm2 con filtración inherente (1,5 mm Al + 0,25 mm Cu). Alinee el campo con la línea media del cráneo con retícula láser integrada (λ = 635 nm ± precisión de 0,5 mm) y verifique el posicionamiento en tiempo real con un sistema de cámara CMOS integrado y retroiluminación IR. Irradiar la región craneal con una sola dosis de rayos X de 30 Gy a 1,325 Gy/min utilizando un sistema X-RAD 320 bajo los siguientes parámetros: 320 kVp/12,5 mA, SSD = 50 cm.
  5. Realice la calibración semanal de la dosis utilizando una cámara de ionización trazable situada en el isocentro. Mantenga los parámetros del haz a 320 kVp/12,5 mA con filtración HVL de 3,2 mm de Cu para lograr una tasa de dosis de 1,325 Gy/min (± variación del 3%). Verifique la uniformidad del haz diariamente (> 95% dentro del campo) utilizando la película Gafchromic EBT3.
  6. Administrar meloxicam (1-2 mg/kg, por vía subcutánea) una vez al día durante 3 días para controlar el dolor postquirúrgico. Coloque a los animales en una cámara de recuperación precalentada y monitoree continuamente hasta que recuperen la conciencia completa y puedan mantener la decúbito esternal. No deje a los animales desatendidos durante el período de recuperación.
  7. Registre el peso corporal de todos los ratones semanalmente durante todo el estudio. Observe a los ratones durante un total de 4 semanas, incluyendo 1 semana de aclimatación y 3 semanas después de la irradiación.

2. Análisis del comportamiento animal

  1. Realice experimentos conductuales 3 semanas después de la RBI.
  2. Laberinto acuático de Morris
    1. Llene una piscina circular (diámetro: 120 cm, altura: 50 cm) con agua opaca (20-22 °C) usando leche en polvo para oscurecer la plataforma sumergida. Coloque una plataforma oculta (diámetro: 10 cm) a 1 cm por debajo de la superficie del agua en un cuadrante fijo.
    2. Aclimatar a los ratones a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos antes de los ensayos. Comience la fase de entrenamiento colocando cada ratón en el agua desde uno de los cuatro puntos de inicio seleccionados pseudoaleatoriamente (N, S, E, W).
    3. Permita que el ratón nade hasta 60 segundos para localizar la plataforma oculta. Si el ratón no puede encontrar la plataforma en 60 s, guíalo hasta la plataforma y deja que permanezca allí durante 15 s.
    4. Realice cuatro ensayos al día por ratón con un intervalo de 15 minutos entre ensayos. Seque bien cada ratón con una toalla tibia entre ensayos para prevenir la hipotermia. Continuar entrenando durante 5 días consecutivos para evaluar la adquisición de aprendizajes.
    5. El día de la prueba de la sonda, retire la plataforma y permita que el ratón nade libremente durante 60 s. Registre parámetros como el tiempo de permanencia en el cuadrante objetivo, los cruces de plataformas y las rutas de nado.
    6. Realice un seguimiento y analice todos los ensayos mediante un sistema de seguimiento de vídeo automatizado con experimentadores ciegos a la asignación de grupos.
  3. Prueba de campo abierto
    1. Aclimatar a los ratones a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos antes del experimento. Utilice un aparato de campo abierto (50 cm x 50 cm x 40 cm) hecho de plástico opaco. Ilumine la arena de manera uniforme (generalmente 25-30 lux) para evitar sombras fuertes y minimizar el estrés.
    2. Limpie la arena con etanol al 70% antes de analizar a cada animal para eliminar las señales de olor. Coloque el mouse suavemente en el centro del campo abierto para comenzar la prueba. Permita que el ratón explore la arena libremente durante 10 minutos.
    3. Registre la actividad y la posición locomotora mediante un sistema de seguimiento automatizado. Defina la zona central como el 20%-25% interior del área total. Mide el tiempo de permanencia en la zona central y la distancia total recorrida.
    4. Después de la sesión, devuelva el ratón a su jaula de origen y limpie el aparato a fondo.
  4. Prueba de reconocimiento de objetos novedosos
    1. Aclimatar a los ratones a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos antes del experimento. Utilice una arena de campo abierto (50 cm x 50 cm x 40 cm) con iluminación uniforme (20-30 lux). Limpie la arena a fondo con etanol al 70% entre animales para eliminar las señales olfativas.
    2. Coloca cada ratón en la arena vacía y déjalo explorar libremente durante 10 minutos. No coloque ningún objeto durante esta fase.
    3. Después de 24 h, coloque dos objetos idénticos (A y A') en esquinas opuestas de la arena (al menos a 8 cm de las paredes). Coloca suavemente el ratón en el centro de la arena y déjalo explorar durante 10 minutos.
    4. Grabe la interacción de objetos mediante un sistema de vídeo automatizado. Defina la exploración de objetos como el hocico del ratón que se encuentra a menos de 2 cm del objeto mientras está orientado hacia él.
    5. Devuelve el ratón a su jaula de origen después de la prueba y limpia la arena y los objetos.
    6. Después de un intervalo de retención de 1 hora, coloque un objeto conocido (A) y un objeto nuevo (B) en las mismas posiciones. Regresa el ratón a la arena y déjalo explorar durante 5 minutos.
    7. Registre el tiempo dedicado a explorar cada objeto utilizando los mismos criterios que antes. Calcule el índice de reconocimiento como:
      Índice de reconocimiento (%) = [Tiempo en el objeto novedoso / (Tiempo en la novela + objeto familiar)] x 100
  5. Prueba de Rotarod
    1. Aclimatar a los ratones a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos antes de la prueba. Utilice un aparato rotarod motorizado con un diámetro de varilla de ~3 cm y una altura de ~30 cm por encima de la base.
    2. Ajuste el modo de rotación a la velocidad de aceleración (de 4 rpm a 40 rpm durante 5 min). Limpie la superficie de la varilla con etanol al 70% antes de colocar cada ratón.
    3. Coloque el mouse suavemente en el centro de la varilla giratoria, mirando hacia adelante. Comience la rotación y comience a cronometrar de inmediato.
    4. Registre la latencia para que caiga automáticamente por el sistema. Atrape al ratón de manera segura al caer para evitar lesiones. Permita un período de descanso de al menos 15 minutos entre ensayos para evitar la fatiga.
    5. Realice 3 ensayos consecutivos por ratón al día y promedie la latencia como resultado final. Asegúrese de que todas las pruebas sean realizadas por experimentadores ciegos en condiciones constantes. Regrese el ratón a su jaula de inicio después de la prueba y desinfecte el aparato a fondo.

3. Eutanasia animal y preparación de muestras

  1. Recoja muestras de tejido 5 semanas después de la RBI.
  2. Prepare pentobarbital sódico (100 mg/kg) y una jeringa estéril. Inyecte pentobarbital sódico por vía intraperitoneal. Espera a que el ratón deje de respirar y a que cesen los latidos del corazón, confirmando la muerte.
  3. Decapitar rápidamente en la unión occipital e incidir sagitalmente las suturas craneales con tijeras finas, luego elevar cuidadosamente los colgajos craneales bilaterales con pinzas curvas mientras se preserva la integridad meníngea antes de cortar las conexiones neuronales.
  4. Transfiera el cerebro intacto a una matriz preenfriada dentro de los 60 s para la bisección sagital media con hojas de afeitar estériles. Registre inmediatamente las dimensiones anteroposteriores (8,2 ± 0,3 mm), el ancho mediolateral (4,5 ± 0,2 mm) y la masa tisular (112 ± 8 mg) con instrumentación de precisión.
  5. Diseccionar los tejidos corticales e hipocampales en hielo. Congele rápidamente el hemisferio izquierdo en nitrógeno líquido para la secuenciación de ARN, qPCR y Simple Western.
  6. Fijar el hemisferio derecho en paraformaldehído (PFA) al 4% para histología. Deshidratar los cerebros fijos en etanol graduado de 70% a 100%, con una duración de 30 minutos de cada paso.
  7. Limpie los cerebros con xileno durante 2 h. Infiltrar los tejidos con parafina fundida a 60°C durante 4 h. Incruste los cerebros aclarados en bloques de parafina y deje que se solidifiquen a temperatura ambiente. Corte secciones coronales con un grosor de 5 μm con un micrótomo.

4. Tinción de hematoxilina y eosina

  1. Desparafina las secciones de tejido sumergiendo los portaobjetos en xileno durante 5 min, 3 veces. Rehidrate las secciones a través de una serie de etanol graduado: 100%, 95%, 70% y agua destilada, durante 5 minutos cada una.
  2. Teñir las secciones con hematoxilina durante 5 min, dependiendo de la intensidad de tinción deseada. Enjuague las secciones con agua corriente del grifo durante 5 minutos para eliminar el exceso de hematoxilina.
  3. Diferenciar las secciones en ácido clorhídrico al 1% en etanol durante unos segundos para conseguir el contraste deseado. Enjuague nuevamente con agua corriente del grifo durante 5 minutos. Tiñe las secciones con eosina durante 1 min.
  4. Enjuague las secciones brevemente con agua destilada. Deshidratar las secciones a través de una serie de etanol graduado: 70%, 95% y 100%, durante 5 minutos cada una.
  5. Limpie las secciones con xileno durante 5 minutos, 3 veces. Monte las secciones con un cubreobjetos utilizando un medio de montaje. Adquiera imágenes utilizando un microscopio Nikon Eclipse Ni-U con un objetivo de 20x.

5. Inmunofluorescencia

  1. Fije el tejido sumergiendo los portaobjetos en PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos, 3 veces, para eliminar el exceso de PFA.
  2. Permeabilizar el tejido incubando portaobjetos con Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Bloquee la unión inespecífica incubando los portaobjetos con suero normal al 5% durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. Incubar con anticuerpos primarios IBA-1 y GFAP, diluidos en tampón de bloqueo a una dilución de 1:2000, durante la noche a 4 °C, dependiendo de las especificaciones del anticuerpo. Lave los portaobjetos en PBS durante 5 minutos, 3 veces, para eliminar el anticuerpo primario no unido.
  4. Incubar con el anticuerpo secundario Goat Anti-Rabbit IgG conjugado con Alexa Fluor 488, diluido a 1:1000 durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave los portaobjetos en PBS durante 5 minutos, 3 veces, para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios.
  5. Monte las correderas con un medio de montaje antidecoloración que contenga DAPI. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
  6. Capture imágenes de fluorescencia utilizando un sistema de microscopio confocal con un objetivo de 20x.
  7. Cuantifique la intensidad de la fluorescencia con ImageJ. Realice análisis cuantitativos con la herramienta Analizar partículas de ImageJ con umbrales de tamaño de 50-200 μm2 (microglía) y 100-500 μm2 (astrocitos). Resta el fondo usando el algoritmo Rolling Ball (radio = 50 píxeles).

6. Análisis qPCR

  1. Extraiga el ARN total del tejido utilizando un kit de extracción de ARN. Siga el protocolo del fabricante para la homogeneización, la lisis y la purificación del ARN.
  2. Cuantifique el ARN extraído utilizando un espectrofotómetro para medir la concentración y evaluar la pureza (relación A260/A280). Asegúrese de que la concentración de ARN sea adecuada para la síntesis de ADNc (100-500 ng/μL).
  3. Evalúe la calidad del ARN mediante el uso de un bioanalizador. Asegúrese de que el ARN no muestre degradación (bandas afiladas para el ARNr 18S y 28S) y tenga un número de integridad de ARN (RIN) superior a 7.
  4. Prepare una mezcla de reacción de 20 μL con 1 μg de ARN, tampón de transcripción inversa, oligo-dT, dNTPs, inhibidor de RNasa y transcriptasa inversa.
  5. Incubar a 42 °C durante 60 min para sintetizar ADNc. Calentar a 85 °C durante 5 min para inactivar la transcriptasa inversa.
  6. Combine el ADNc, la mezcla maestra, el cebador directo, el cebador inverso (Tabla 1) y el agua sin nucleasas en una placa de PCR de 96 pocillos. Utilice 2 μL de ADNc por reacción de 20 μL y asegure una concentración final de cebador de 200 nM. Selle la placa con una película adhesiva óptica para evitar la evaporación.
GenSecuencia de cebado (5'-3', adelante/atrás)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGGGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

Tabla 1: cebadores de secuencia qPCR.

  1. Coloque la placa de reacción en un instrumento de PCR en tiempo real y programe el termociclador. Utilice las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 30 s.
  2. Normalizar la expresión de los genes diana a GAPDH. Calcule los niveles de expresión relativos utilizando el método ΔΔCt y presente los datos como cambios de pliegue en comparación con el grupo de control.

7. Análisis de secuenciación de ARN

  1. Anestesiar y sacrificar al ratón siguiendo los protocolos institucionales de cuidado animal. Perfundir inmediatamente con PBS frío para eliminar la sangre circulante.
  2. Disecciona el cerebro en hielo. Aísla la corteza cerebral con herramientas de disección estériles. Minimice el tiempo de disección para preservar la integridad del ARN.
  3. Congele rápidamente el tejido cortical en nitrógeno líquido. Almacenar a -80 °C si la extracción de ARN no se realiza inmediatamente.
  4. Homogeneizar la corteza congelada (30-50 mg) en 1 mL de reactivo de extracción de ARN utilizando un homogeneizador motorizado hasta que no queden fragmentos visibles.
  5. Realice la separación de fases con cloroformo. Añadir 200 μL de cloroformo, agitar enérgicamente durante 15 s, incubar durante 2-3 min a temperatura ambiente, luego centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  6. Transfiera la capa superior a un nuevo tubo, agregue un volumen igual de 70% de etanol y proceda con la purificación del ARN utilizando un kit basado en columna de sílice.
  7. Utilice la digestión de DNasa en columna para eliminar el ADN genómico durante la purificación del ARN. Recoja el ARN total en 30-50 μL y manténgalo en hielo para su uso inmediato.
  8. Utilice un espectrofotómetro para cuantificar la concentración y pureza del ARN. Confirme la relación A260/A280 de ~2.0. Analice 1 μL de ARN en un bioanalizador. Asegúrese de que RIN sea mayor que 8.0 para la secuenciación.
  9. Utilice un protocolo de selección de poli(A) y un kit de preparación de bibliotecas trenzadas. Siga el protocolo del fabricante para generar bibliotecas de 300-400 bp. Purifique las bibliotecas con un kit comercial.
  10. Utilice un bioanalizador para confirmar el tamaño de los fragmentos y cuantificarlos equimolarmente con bibliotecas de grupo. Realice la secuenciación de extremos emparejados (2x, 150 bp) utilizando una plataforma Illumina.
  11. Recorte adaptadores con Trim Galore, evalúe la calidad con FastQC, alinee las lecturas con el genoma del ratón (GRCm39) con STAR y cuantifique la expresión génica con featureCounts. Identificar genes expresados diferencialmente utilizando DESeq2.
  12. Utilice la salida de DESeq2 y filtre los genes DEG expresados significativamente de manera diferencial (valor p ajustado < 0.05 y |log2FC| > 1). Realizar análisis de enriquecimiento de las vías GO y KEGG utilizando Phyper basado en la prueba hipergeométrica. Identifique las vías con un valor de P corregido ≤ 0,05 como estadísticamente significativas.

8. Análisis occidental simple

  1. Homogeneizar la corteza cerebral del ratón en tampón RIPA con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa, y luego centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar los residuos. Determine la concentración de proteínas mediante un ensayo de BCA.
  2. Desnaturalice las muestras de proteínas mezclándolas con un tampón de muestra e incubando a 95 °C durante 5 minutos para garantizar una desnaturalización completa.
  3. Cargue 3 μl de muestras de proteínas desnaturalizadas en los capilares occidentales simples. Asegúrese de que las muestras se carguen correctamente para evitar el desbordamiento. Coloque los capilares en el instrumento Simple Western.
  4. Incubar las proteínas separadas con anticuerpos primarios diluidos 1:50, incluidos p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 e IL-17, durante 30 min.
  5. Lave el sistema capilar con tampón de lavado durante tres lavados de 5 minutos cada uno para eliminar los anticuerpos primarios no unidos. Añadir el anticuerpo secundario conjugado con HRP diluido en tampón bloqueante e incubar durante 30 min.
  6. Realice 3 lavados de 5 minutos cada uno con tampón de lavado para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios. Ejecute el programa de detección en el sistema Simple Western para detectar automáticamente las proteínas mediante quimioluminiscencia.
  7. Analice los datos utilizando el software Compass for Simple Western. Cuantifique la expresión de la proteína comparando las áreas de pico relativas en el electroferograma. Normalizar los datos a la proteína GAPDH.

9. Análisis estadístico

  1. Abra GraphPad Prism 9.0.0. software. Haga clic en Archivo > Importar datos para cargar los datos. Presente los datos como medios ± SD. Utilice la prueba t no apareada para las comparaciones entre dos grupos.
  2. Evaluar la normalidad mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Si se viola la normalidad (p < 0,05), aplicar la prueba U de Mann-Whitney para las comparaciones entre grupos. Si se cumple la normalidad (p ≥ 0,05), se realiza una prueba t de muestras independientes para evaluar las diferencias entre grupos.
  3. Informe los resultados con valores p. Considere p < 0.05 como estadísticamente significativo. Utilice la siguiente notación: n.s. para no significativo, * para p < 0,05, ** para p < 0,005, *** para p < 0,0005 y **** para p < 0,0001.

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Resultados

Deterioro cognitivo en ratones RBI
Después de la exposición a una irradiación de 30 Gy en todo el cerebro, el peso corporal de los ratones se controló semanalmente. Se evaluó la función cognitiva durante la4ª semana (Figura 1A). Las mediciones iniciales indicaron que los pesos corporales de los grupos de control y RBI eran similares. Sin embargo, entre 1 y 3 semanas después de la irradiación, el grupo RBI demostró una disminució...

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Discusión

Pasos críticos dentro del protocolo
Este protocolo implica la inducción de RBI en ratones, seguida de evaluaciones exhaustivas de la neuroinflamación y la vía de diferenciación celular Th17 (Figura 6). Un paso crítico es la irradiación craneal de ratones C57BL/6 con una dosis de 30 Gy, un modelo bien establecido para RBI1. La calibración precisa de la dosis mediante cámaras de ionización garantiza la reproducibilid...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

El Instituto de Medicina Radiológica de Beijing apoyó este trabajo

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Módulo de separación de 12-230 kDa, 8 cartuchos capilares de 25 ProteinSimpleSM-W004para
anticuerpo anti-GAPDHSimpleWestern ProteintechHRP-60004dilución/anticuerpo 1:500 para SimpleWestern
anticuerpo anti-GFAPAbcamab7260dilución/anticuerpo 1:2000 para inmunofluorescencia
anticuerpo anti-IBA-1Abcamab178846Dilución 1:2000/anticuerpo para inmunofluorescencia
anti-IL-17 anticuerpo A/FThermoMA5-23748dilución/anticuerpo 1:10 para SimpleWestern
anti-IL-1 y beta; anticuerpoCST12242dilución/anticuerpo 1:50 para SimpleWestern
anticuerpo anti-IL-6ThermoMA5-23800dilución/anticuerpo 1:5 para SimpleWestern
Anti-Mouse Detection ModuleAnticuerpoProteinSimple DM-002
anticuerpo anti-P-STAT3(Try705)ThermoMA5-15193dilución/anticuerpo 1:2 para
el módulo de detección SimpleWestern Anti-Rabbit AnticuerpoProteinSimpleDM-001para SimpleWestern
anti-ROR γ t anticuerpoThermo14-6988-82dilución 1:5/anticuerpo para SimpleWestern
anticuerpo anti-STAT3Thermo710077dilución 1:20/anticuerpo para
anti-TGF β-1,2,3 anticuerpoThermoMA5-23795dilución 1:10/anticuerpo para SimpleWestern
Ensayo BACThermoA55860proteínas
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8para SimpleWestern
Cabra Anti-Conejo IgG H& LAbcamab150077dilución/anticuerpo 1:1000 para inmunofluorescencia
RNeasy KitQiagen74134Extracción de ARN
SuperScript IV Sistema de síntesis de primera cadenaThermo Fisher Scientific18091050Transcripción inversa
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
Trizol ReactivoInvitrogen15596026Extracción de ARN
secundario para el secundario ensayos de

Referencias

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