Este protocolo describe técnicas optimizadas para analizar la degeneración y preservación de fotorreceptores en un modelo murino de retinitis pigmentosa, incluida la administración intravítrea de fármacos, el corte de criostato y la inmunofluorescencia. El método garantiza la integridad de la retina y proporciona datos cuantitativos sobre la eficacia de las intervenciones terapéuticas.
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Artículo de método
Análisis de la degeneración y preservación de fotorreceptores en un modelo murino de retinosis pigmentaria
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las retinopatías afectan a cientos de millones de personas en todo el mundo y son causas importantes de discapacidad visual y ceguera. Entre estas enfermedades, la retinosis pigmentaria (RP) es un trastorno ocular hereditario caracterizado por una degeneración progresiva de la retina, que afecta aproximadamente a entre 1,5 y 2 millones de personas en todo el mundo. Los estudios de prueba de concepto en modelos animales de distrofias hereditarias de retina constituyen una base importante de evidencia para los estudios sobre los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad, la eficacia del tratamiento y la seguridad. La inyección intravítrea en ratones y el corte criostato son técnicas ampliamente utilizadas para investigar los efectos de los fármacos en modelos de RP, ya que permiten una administración precisa de sustancias en el humor vítreo y la preparación de muestras histológicas de alta calidad para el análisis detallado de las alteraciones de la retina. Además, el recuento celular mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra recoverina, una proteína dependiente del calcio expresada en los fotorreceptores de la retina, se ha empleado recientemente para estudiar los cambios celulares asociados con la degeneración de la retina en modelos de RP, ya que este enfoque facilita la evaluación de la pérdida de fotorreceptores y la posible preservación celular después de las intervenciones terapéuticas. La inyección intravítrea se ha optimizado para garantizar la integridad ocular y resultados fiables, utilizando una aguja fina para administrar la solución en la cámara vítrea. Después de un período predefinido para evaluar los efectos del fármaco, se realiza un procesamiento histológico, con muestras seccionadas a 10 μm de espesor utilizando un criostato, seguido de un marcaje de inmunofluorescencia con anticuerpos recoverina. Por último, se realiza un recuento celular para valorar si el tratamiento con fármacos ha ejercido un efecto protector, como lo demuestra la conservación de los fotorreceptores. Aunque estas técnicas se han aplicado ampliamente para generar datos consistentes en la investigación de la retinopatía, persisten los desafíos para lograr un manejo preciso de los tejidos y la calidad del procesamiento. Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado para optimizar cada paso, desde la inyección intravítrea hasta la preparación de secciones histológicas, lo que garantiza resultados reproducibles y de alta calidad.
Introducción
La visión es uno de los sentidos más complejos del sistema sensorial, esencial para captar los estímulos visuales del entorno y traducirlos en señales electroquímicas, que se procesan en el cerebro para formar imágenes. Varios factores biológicos, como el envejecimiento, los defectos genéticos y las enfermedades, pueden comprometer la visión, lo que afecta significativamente la calidad de vida y las actividades diarias.
El ojo humano consta de tres cámaras principales. La capa externa, formada por la córnea y la esclerótica, proporciona soporte estructural al globo ocular. La capa intermedia incluye el iris, el cuerpo ciliar y la coroides, siendo esta última responsable de suministrar sangre a los fotorreceptores. Por último, la capa interna comprende la retina, una estructura responsable de procesar los estímulos luminosos y convertir la luz en señales eléctricas enviadas al cerebro para la formación de imágenes 1,2.
La retina neural está compuesta por varias capas celulares, incluidas células especializadas como los fotorreceptores, las células bipolares, las células horizontales, las células amacrinas y las células ganglionares. Además, la retina contiene células gliales como la microglía, los astrocitos y las células de Müller, así como células epiteliales pigmentadas. Este último, ubicado en la porción no neural de la retina, desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad estructural, la protección y el soporte de los fotorreceptores 3,4. La porción neural alberga células sensoriales y neuronales directamente involucradas en la captura y procesamiento de la luz 5,6,7.
Al ser esencial para la visión, la retina a menudo se ve afectada por patologías que pueden llevar a la ceguera. Entre estas patologías, la retinosis pigmentaria (RP) se destaca como una de las principales retinopatías hereditarias, con más de 80 genes asociados a su etiología 8,9. La PR es una enfermedad heterogénea, predominantemente heredada de forma autosómica dominante o recesiva, pero también puede presentarse ligada al cromosoma X o por mutaciones espontáneas10.
Con una prevalencia global estimada entre 1 de cada 3.000 y 1 de cada 7.000 individuos, dependiendo de la población y la región geográfica11,12, la RP suele manifestarse durante la adolescencia o la adultez temprana, con síntomas iniciales como disminución de la visión nocturna y pérdida del campo visual periférico. A medida que la enfermedad progresa, la visión central se ve comprometida, lo que puede llevar a la ceguera total 9,13.
Aunque todavía no existe una cura para la RP, varias terapias en desarrollo han demostrado su potencial para retrasar o revertir la progresión de la enfermedad. Entre estos enfoques se encuentran las terapias genéticas, celulares y farmacológicas, así como los dispositivos electrónicos. Para avanzar en la comprensión de la RP y evaluar nuevas intervenciones, se han utilizado ampliamente modelos murinos de degeneración de la retina. Estos modelos, a menudo denominados rd (degeneración de la retina), son herramientas valiosas para estudiar las bases moleculares y las terapias para la RP. Entre los diversos modelos utilizados en el estudio de la retinosis pigmentaria, la cepa de ratón Pde6βrd10/rd10 (rd10) presenta una mutación de cambio de sentido en el gen que codifica la subunidad β específica de la fosfodiesterasa14, exhibiendo una degeneración lenta de los fotorreceptores similar a la que ocurre en los humanos15.
La administración intravítrea de fármacos ha sido ampliamente utilizada en diversos estudios 16,17,18. Este protocolo es adecuado para los investigadores que estudian los efectos de los fármacos en la retina, especialmente en lo que respecta a la supervivencia de las células fotorreceptoras. De esta manera, el objetivo principal de este protocolo es optimizar la administración de fármacos mediante inyección intravítrea en un modelo murino de retinosis pigmentaria (RP) y evaluar la supervivencia de los fotorreceptores mediante inmunofluorescencia para la recoverina, un marcador de células fotorreceptoras. La inyección intravítrea permite la administración localizada de fármacos, minimizando los efectos secundarios sistémicos, aumentando la biodisponibilidad de la retina y reduciendo los efectos adversos en otros órganos. Por otro lado, la inmunofluorescencia para recoverina permite un análisis específico de la supervivencia de los fotorreceptores, proporcionando una herramienta eficaz para evaluar la eficacia de esta estrategia terapéutica. Sin embargo, su aplicabilidad depende de factores como la selección del modelo animal, la precisión de la inyección y la duración del tratamiento, que deben tenerse en cuenta a la hora de adaptar este método a otros entornos experimentales.
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Protocolo
El proyecto y todos los protocolos que se llevan a cabo en él siguen las directrices de cuidado animal del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal y fueron aprobados por el Comité de Ética del Uso Animal (CEUA - UFF) bajo el número 1464280219.
1. Animales
- Utilice la cepa murina rd10, que sufre degeneración de fotorreceptores, y la cepa C57 Black/6 (fondo de rd10). Mantenga estas cepas bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 h, con acceso ad libitum al agua y a los alimentos.
2. Anestesia
- Realizar una inyección intraperitoneal con un anestésico preparado a dosis de 80 mg/kg de ketamina y 8 mg/kg de xilacina, diluidos en agua destilada. La ketamina actúa como un inhibidor del receptor del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), proporcionando efectos analgésicos, mientras que la xilacina funciona como un sedante anestésico.
- Para la inyección intraperitoneal, calcule el volumen a inyectar como 10 μL x Peso (g).
- Sujete el ratón para garantizar un acceso despejado al abdomen. Limpie el cuadrante inferior derecho de la cavidad abdominal con alcohol al 70%, donde se debe insertar la aguja con el bisel hacia arriba.
- Para confirmar la ausencia de un reflejo de dolor, pellizque suavemente la cola o la pata del animal. Si no hay ninguna reacción, esto indica que el animal está debidamente anestesiado.
3. Inyección intravítrea
- Con los animales anestesiados, exponer los ojos y, utilizando un microscopio estereoscópico binocular con un aumento de 10x, identificar el área del limbo, una banda gris entre la córnea y la esclerótica, donde se realizará la inyección.
- Para realizar la inyección, se necesita la ayuda de otra persona. Bajo un microscopio estereoscópico binocular, una persona tiene que sostener al animal e insertar la aguja, mientras que el asistente presiona el émbolo de la jeringa para introducir la sustancia en el ojo.
- En primer lugar, utilice una jeringa ultrafina con aguja fija (31 G x 6 mm) para realizar una punción en la región del limbo, teniendo cuidado de no insertar la aguja demasiado profundamente; Insertar solo la mitad del bisel es suficiente.
- A continuación, inserte la microjeringa portátil preesterilizada (calibre 26 S sin bisel), que contiene 1 μL del líquido/fármaco de interés, en la punción realizada por la jeringa de insulina.
- Haga que el asistente presione el émbolo de la jeringa lentamente, asegurándose de que todo el volumen se administre durante aproximadamente 30 s.
- Repite el proceso para el otro ojo del mismo animal y registra la hora.
- Si hay más de un grupo experimental, marque la oreja del animal para asegurar la correcta identificación de cada grupo.
- Utilice 1 gota de solución de PBS 0,01 M en cada ojo del animal para evitar que se seque.
- Después de estos procedimientos, coloque a los animales en una almohadilla térmica, con la temperatura ajustada a 37 ° C, hasta que se despierten. Puede tardar 1-2 h. Monitorear a los animales continuamente mientras estén anestesiados, y una vez despiertos, devolverlos a sus jaulas hasta el momento del análisis.
- Llevar a cabo una sesión de entrenamiento inicial utilizando un tinte visible, como el azul de tripano, para ayudar a los operadores a perfeccionar su técnica de inyección intravítrea en ratones.
NOTA: El tinte facilita la visualización de la trayectoria de la aguja, permitiendo ajustes precisos en la profundidad y el ángulo de la inyección, reduciendo el riesgo de daño a la estructura ocular y aumentando la seguridad del procedimiento.
4. Eutanasia y preparación ocular
- Después de un período específico de tratamiento después de la inyección, eutanasiar a los animales mediante la inhalación de una sobredosis de isoflurano al 5%. Continúe la exposición hasta al menos 1 minuto después del cese de la respiración. Para asegurar la muerte, sujete al animal por la parte posterior del cuello y aplique una tracción firme en la cola hasta lograr la luxación cervical.
- Antes de quitar los ojos, marque el polo temporal. Aplique con cuidado el marcador o la aguja/alfiler caliente en la región temporal de la esclerótica, asegurándose de que la marca sea visible y precisa. Este paso servirá como punto de referencia para la orientación durante el proceso de seccionamiento.
- A continuación, exponga los ojos y, con un bisturí estéril y unas tijeras de iridectomía, corte el tejido circundante para separar los tejidos conectivos y musculares y exponer el globo ocular. En ratones, disecciona los músculos de los ojos con cuidado, ya que esto puede ser un desafío. Para facilitar el procedimiento, realice una incisión lateral con un bisturí estéril en ambas esquinas de la piel del ojo.
- Con una pinza curva de punta media, retire suavemente los ojos de la cuenca del ojo sosteniéndolos por el nervio óptico e inmediatamente fije el tejido durante 5 minutos en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente (RT).
- Después de la fijación en solución de PFA, transfiera los ojos a una placa de vidrio, utilizando pinzas curvas de punta mediana. Esta placa funciona como una plataforma de disección y garantiza que contenga un tampón de fosfato a una concentración de 0,1 M, pH 7,4.
- A continuación, coloque la placa bajo un microscopio estereoscópico binocular con un aumento de 10x y haga una pequeña incisión justo por encima del limbo (borde de la córnea) con un bisturí. Posteriormente, se realiza un corte circunferencial siguiendo el limbo con unas tijeras de microiridectomía para separar la córnea.
- Retire la córnea, junto con el iris y la lente, usando pinzas Dumont #5. Por último, vuelva a fijar los ojos en la solución de PFA al 4% durante 55 min. Después de esto, lavar los ojos tres veces con tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4.
5. Criopreservación y congelación
NOTA: El criostato de tejido retiniano se realizó como se describió anteriormente con algunos ajustes19.
- Criopreservar los ojos con un gradiente de sacarosa de 10%, 20% y 30%, diluido en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4. Sumerja los ojos secuencialmente en las soluciones de sacarosa, comenzando con la concentración más baja (10%) y aumentando gradualmente hasta la más alta (30%). Cada paso dura el tiempo necesario hasta que los ojos se posan en el fondo del recipiente, lo que indica que se puede utilizar la siguiente concentración. En la concentración final, almacenar los ojos a 4 °C durante aproximadamente 12 h.
- Al día siguiente, retirar el 30% de sacarosa sobrante y colocar los ojos en un recipiente redondo de aluminio de 2 cm de diámetro, dispuestos según los grupos experimentales.
NOTA: Hacer un recipiente de papel de aluminio del tamaño adecuado según el número de grupos experimentales. - Bajo un microscopio estereoscópico binocular con un aumento de 10x, elimine el exceso de sacarosa del interior y alrededor del globo ocular con una pipeta o papel de filtro, teniendo el cuidado necesario para no dañar la estructura del tejido.
- Incrustar los ojos en un medio de congelación a temperatura óptima de corte (OCT), teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas dentro o alrededor de los ojos, y dejarlos durante 1 h en RT.
- Después de 1 h en OCT, coloque los ojos con el punto de referencia previamente marcado hacia arriba. Coloque el recipiente de papel de aluminio en una placa de aluminio adecuada dentro de una pequeña caja de espuma de poliestireno para congelar.
- Vierta con cuidado nitrógeno líquido sobre la placa de aluminio, alrededor del recipiente de papel de aluminio. Asegúrese de que el nitrógeno se distribuya uniformemente por la superficie. Esto promueve la congelación uniforme del tejido. Asegúrese de que el nitrógeno líquido no entre en contacto directo con los ojos dentro del recipiente de aluminio. Luego, proceda a seccionar los ojos con un criostato.
6. Preparación de la diapositiva
- Extienda poli-L-lisina (200 μg/mL) en los portaobjetos de vidrio de borde esmerilado.
- Espere 12 h para que los portaobjetos se sequen y estén listos para su uso.
7. Seccionamiento por criostato
- En un criostato, coloque el bloque congelado en la plataforma.
- Gire el volante para hacer secciones con un grosor de 10 μm.
- Ajuste la posición del bloque para asegurarse de que todos los ojos estén igualmente presentes en el corte.
- Continúe cortando hasta que se identifique el nervio óptico, utilizando un microscopio de campo claro.
- Recoja las secciones en los portaobjetos pretratados de poli-L-lisina.
- Guarde los portaobjetos a -20 °C hasta el análisis.
8. Inmunofluorescencia
NOTA: La inmunofluorescencia se realizó como se describió anteriormente con algunos ajustes 19,20.
- Incubar los portaobjetos obtenidos de la sección en el criostato con 100 μL de Triton X-100 al 0,5% en PBS 0,01 M durante 15 min a RT para permeabilizar la membrana plasmática celular.
- Lave los portaobjetos dos veces con 0,01 M PBS durante 5 minutos cada uno a RT para eliminar el exceso de Triton X-100.
- Incubar con 100 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en 0,01 M PBS durante 30 min en RT para bloquear los sitios de unión de anticuerpos no específicos.
- Después del bloqueo, incubar las secciones con 100 μL de antirrecuperina a una concentración de 1:1500 diluida en BSA 1% para marcar células fotorreceptoras, durante la noche a 4 °C (refrigerador).
- Al día siguiente, incubar las secciones con 100 μL de anticuerpo secundario policlonal anti-conejo 488 o anticuerpo secundario policlonal anti-conejo 568 1:500 diluido en BSA 1% durante 2 h a RT.
- Lave los portaobjetos dos veces con 0.01 M PBS durante 5 minutos cada uno en RT.
- Incubar las secciones con 100 μL de DAPI 1 mg/mL (4',6-diamidino-2-fenilindol) durante 2-3 min en RT.
- Lave el portaobjetos una vez con 0,01 M PBS durante 5 minutos en RT.
- Por último, tratar las secciones con un medio de montaje que contenga 2,5 g de galato de n-propilo en 40 mL de glicerol en tampón de fosfato 0,1 M pH 7,4. Actuarán como un reactivo anti-decoloración y un medio de montaje, preservando las muestras. Coloque un cubreobjetos (24 mm 50 mm) encima de los portaobjetos, luego selle las secciones con esmalte de uñas. Después de eso, proceda a ver las muestras bajo el microscopio.
9. Microscopio de fluorescencia, fotomicrografía
- Para obtener imágenes de las células marcadas mediante la técnica de inmunohistoquímica, utilice un microscopio óptico de fluorescencia equipado con filtros azules, verdes y rojos. Además, conecte una cámara para la fotomicrografía de portaobjetos. Para obtener las fotomicrografías, utilice un ordenador con el software LAS V3.7 (Leica) (software de imagen), que debe estar abierto para su visualización simultánea con el microscopio.
- Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio. Inicialmente, utilice el objetivo de aumento más bajo y el filtro azul.
- Ajuste el enfoque usando las perillas de enfoque grueso y fino hasta que la retina con las células marcadas en azul (núcleos celulares) se visualice claramente.
- Seleccione el área deseada de la retina para la toma de imágenes. Aumente gradualmente el aumento hasta 40x el objetivo, ajustando el enfoque según sea necesario.
- Después de ajustar el enfoque, tire de la clavija de derivación para transferir la imagen del microscopio al software de imágenes. Seleccione los filtros deseados (A4 (azul), L5 (verde) y TX2 (rojo)). Ajuste los siguientes parámetros: Exposición, Ganancia y Gamma, para garantizar que la imagen sea clara y lo más parecida posible a lo que se observa bajo el microscopio.
- Con un aumento de 400×, capture cuatro campos con un área de 113 × 113 μm, siguiendo una orientación desde la periferia hasta el centro de la retina. Asegúrese de que dos de estos campos representen la región periférica y dos representen la región central de la retina.
- Para obtener fotomicrografías de campo periférico, capture imágenes a aproximadamente 50 μm desde los bordes del ojo. Para las fotomicrografías de campo central, seleccione áreas adyacentes ubicadas a 50 μm del nervio óptico y adquiera las imágenes. Utilice los ojos derecho e izquierdo para las cuantificaciones, lo que da como resultado un total de ocho campos analizados por tratamiento.
- Después de completar todas las fotomicrografías, proceda con la cuantificación manual de las células inmunomarcadas.
10. Cuantificación celular
- Abra el programa ImageJ v.1.54g. Dentro del programa, haga clic en Archivo, luego en Abrir y seleccione la imagen guardada en la computadora.
- Con la imagen ya abierta, haga clic en Multipunto. Utilice esta herramienta para cuantificar las celdas haciendo clic con el botón izquierdo en cada celda que se va a contar.
- Cuantificar las células colocalizadas, es decir, positivas para recoverina y DAPI, en la capa nuclear externa (ONL).
- Cuando se complete el recuento, haga doble clic con el botón izquierdo del ratón para ver el número total de celdas que se marcaron.
- Después de determinar el número de células recoverin-positivas, introduzca el número de células en la tabla de cuantificación de Excel y pase a la siguiente fotomicrografía.
- Repita todos los pasos para los 8 campos correspondientes a cada animal.
- Calcula el promedio de estos ocho campos, correspondientes a un solo punto experimental para toda la retina (n= 1). Para el gráfico de retina periférica, utilice el promedio de los campos periféricos, con un total de cuatro campos: dos del ojo izquierdo y dos del ojo derecho. Este promedio corresponde a un punto experimental para la retina periférica (n= 1). Cree el centro del gráfico de retina de la misma manera que el gráfico periférico, cambiando solo la región.
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Resultados
La técnica de inmunofluorescencia para el marcaje de fotorreceptores, células recoverin-positive, permitió observar el patrón de degeneración de los fotorreceptores en animales rd10 y C57Bl6, este último considerado sano (Figura 1). Como se puede observar, el marcaje de las células recoverina-positivas es exclusivo de la capa nuclear externa (ONL) donde se encuentran los fotorreceptores, incluido el marcaje de segmentos internos de estas células, tanto en ani...
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Discusión
La retina es un tejido delicado de difícil acceso; Por lo tanto, es necesario considerar la técnica a utilizar para realizar el tratamiento farmacológico dirigido a este tejido. La inyección intravítrea es una técnica bien establecida y ampliamente utilizada para administrar fármacos directamente a la retina, especialmente en el tratamiento de enfermedades oculares como la degeneración macular relacionada con la edad21, la retinopatía diabética22...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue realizado durante una beca de investigación apoyada por el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), la Fundación Carlos Chagas Filho de Apoyo a la Investigación del Estado de Río de Janeiro (FAPERJ), y también fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Finanzas 001.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | para el tampón de bloqueo |
| al 1 % BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | Solución para el bloqueo del tampón |
| 1 % Bloque BD Fc humano | BD Biosciences | 564220 | Fc Bloque necesario para el tampón de bloqueo |
| Lámpara LED de 150 W | B07VH3CVSF de Amazon | para la fotoirradiación tisular | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Solución para bloquear pasos de tampón y lavado |
| Contenedor de almacenamiento de 20 galones | Amazon | B001B1C4G0 | Contenedor para proceso de fotoirradiación |
| Lámpara LED de inundación RGBW de 40 W | Amazon | B08QFPJSMD | Fuente de luz RGB para fotoirradiación tisular |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Alfa-actina del músculo liso DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Kit de bloqueo de avidina/biotina | Abcam | ab64212 | Solución de bloqueo de avidina y biotina |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | Solución de fijación 554714 | |
| BOND Solución de desparafinación Leica | Biosystems | NC0221076 | Solución de desparafinación |
| BOND Solución de recuperación de epítopos 1 | Leica Biosystems | NC0235529 | Solución de recuperación de epítopos de pH 6 a base de citrato ( ER1) |
| BOND Solución de recuperación de epítopos 2 | Leica Biosystems | NC0235530 | Solución de recuperación de epítopos de pH 9 basada en EDTA (ER2) |
| Sistema de detección de investigación BOND | Reactivo de tinción de investigación automatizado | NC0396648 | Leica Biosystems |
| investigación automatizada BOND RX Tinción de investigación | Leica Biosystems | NA | Plataforma de tinción de investigación automatizada |
| Solución de lavado BOND | Leica Biosystems | NC0221077 | Tampón de lavado |
| CD15 | BD Biosciences | 347420/AB_400298 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82/AB_11150959 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& D Systems | FAB8165G/AB_2728839 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| CD45 Ficoeritrina (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE/NA | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135/AB_2892745 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Anticuerpo anti-cabra Donkey IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Anticuerpo anti-ratón Donkey IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/ AB_2762830 | para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Burro anti-ratón IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Sistema de tinción EasyDip | Newcomer Supply | 5300KIT | Sistema de tinción de portaobjetos |
| Fluoromount-G | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 Medios de | montaje |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Tinción nuclear para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Imaris File Converter x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Convertidor de archivos gratuito | |
| Software ImarisViewer x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Software gratuito de procesamiento de imágenes | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Bolígrafo de barrera hidrofóbico |
| Borohidruro de litio (1 gramo) | STREM Chemicals | 93-0397 | Químico para la inactivación del colorante, compre pequeñas alícuotas de este químico (1 gramo) |
| Lumican Biotin | R& D Systems | BAF2846 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48393-241 | Glass slide covers |
| Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | Anticuerpo para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Sistema de microondas PELCO BioWave Pro | Ted Pella Inc | 36500-230 | Microondas científico sin calentamiento |
| PELCO SteadyTemp Pro | Ted Pella Inc | 50062 | Control de temperatura totalmente automatizado para microondas científicas |
| SimpleITK | Software | Software de registro y procesamiento de canales | |
| Streptavidin Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | Reactivo de marcado para imágenes IBEX. Consulte la Tabla 1. |
| Microscopio de campo amplio | Leica Microsystems | NA | Leica Microsystems THUNDER imager con fuente de luz LED8 y software LAS X (3.7.1.21655). Para las imágenes de fluorescencia, se utilizó un filtro de banda cuádruple personalizado con rueda de filtros externa (PN: 11536075) con dos filtros de banda única adicionales (PN: 8118215) para obtener imágenes de siete canales de colorante por pasada. Las líneas de excitación, dicroica y emisión del filtro son (1) cubo de banda cuádruple: dicroico a 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, sin filtros de excitación o emisión; (2) rueda de filtro externa posición 1: 434/32, posición 2: 520/40, posición 3: 585/20, posición 4: 720/60, posición 5: paso; (3) banda única de 1— 585/22 excitación, 594 dicroico, 625/30 emisión; (4) banda única de 2— 635/20 excitación, 647 dicroico, 667/30 emisión. |
| Limpiador de lentes ópticos Zeiss | Amazon | B00GPVQVCO | Limpiador de lentes de microscopio |
| Antibodies | |||
| Ag85B | Abcam | ab43019 | IgG policlonal de conejo, ciclo 1 |
| Alfa-actina del músculo liso DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R | 1A4/asm-1, ciclo 1 |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R&;D Sistemas | FAB8165G | IgG policlonal de cabra, ciclo 1 |
| CD8 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 372906 | C8/144B, ciclo 1 |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | KP1, ciclo 1 |
| IgG anticabra Donkey Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814 | Burro policlonal, ciclo 1 |
| IgG antiratón Donkey Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787 | Burro policlonal, ciclo 1 |
| Burro anti-conejo IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794 | Burro policlonal, ciclo 1 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Etiqueta nuclear, ciclo 1 |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | MMA, ciclo 2 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | L26, ciclo 2 |
| CD45 Ficoeritrina (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 2B11 + PD7/26, ciclo 2 |
| Burro anti-ratón IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020 | Burro policlonal, ciclo 2 |
| Lumican Biotin | R& D Systems | BAF2846 | IgG policlonal de cabra, ciclo 2 |
| Pancitoqueratina Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | AE-1/AE-3, ciclo 2 |
| Estreptavidina Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | N/A, ciclo 2 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | ciclo 2 |
| Solutions | |||
| Blocking Buffer (Ciclo 1) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3% en volumen |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 1% en volumen |
| Humano BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1% en volumen |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 97,7 % en volumen |
| Solución de tinción de anticuerpos primarios #1 (Ciclo 1) | |||
| añadir anticuerpos | |||
| Solución de tinción de anticuerpos primario #2 (Ciclo 1) fuerte | |||
| agregar anticuerpos | |||
| AF488 | R& D Systems | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | 1:100 |
| Solución de tinción de anticuerpos secundarios #1 (Ciclo 1) | |||
| añadir anticuerpos | |||
| Donkey anti-Rabbit AF Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| Donkey anti-Mouse AF Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| Primary Antibody Staining Solution #3 (Ciclo 1) | |||
| anticuerpos | |||
| CD68 iF594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| Tampón de bloqueo sin BSA (Ciclo 2) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0.3% en volumen |
| Humano BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1% en volumen |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 98,7 % en volumen |
| Solución de tinción de anticuerpos primarios #4 (Ciclo 2) | |||
| Tampón de bloqueo sin BSA (Ciclo 2) | Ver arriba | Rellenar hasta el volumen después de añadir anticuerpos | |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | 1:30 |
| Lumican Biotin | R& D Systems | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 1:20 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | 1:10 |
| Pan-Citoqueratina AF750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | 1:10 |
| Solución de tinción de anticuerpos secundarios #2 (Ciclo 2) | |||
| Tampón de bloqueo sin BSA (ciclo 2) | Ver arriba | Rellenar hasta el volumen después de añadir anticuerpos | |
| IgM anti-ratón Donkey AF488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| Strepavidin AF594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 1 | :200 |
Referencias
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