Artículo de método

In vivo Imágenes de la actividad neuronal en moscas adultas de Drosophila no anestesiadas

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DOI:

10.3791/68332

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20 de junio de 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

En este artículo

Resumen

Un obstáculo importante para el estudio de la actividad celular durante los procesos cognitivos, como el aprendizaje y la memoria, es el uso de anestésicos para la preparación de imágenes in vivo . La anestesia afecta la memoria a corto plazo y la cognición en múltiples modelos, incluida Drosophila. Este estudio presenta un método único para preparar Drosophila adulta para imágenes in vivo sin anestesia.

Resumen

Las imágenes in vivo son cruciales para el estudio de la neurobiología en Drosophila , ya que permiten la visualización en tiempo real de la actividad, el desarrollo y la plasticidad neuronal dentro de la mosca intacta que se comporta. Esta técnica proporciona información valiosa sobre los procesos dinámicos, como la función sináptica y la conectividad de circuitos, que no se pueden capturar con precisión en preparaciones fijas o ex vivo . La mayoría de las técnicas para la preparación de moscas para la obtención de imágenes in vivo implican la anestesia de las moscas poco antes de la obtención de imágenes funcionales. Sin embargo, hay una amplia evidencia que demuestra que la anestesia afecta varios procesos cognitivos y fisiológicos. Por esta razón, la obtención de imágenes in vivo de Drosophila melanogaster adulta sin el uso de anestésicos durante la preparación del animal es un enfoque desafiante pero muy deseable. El protocolo presentado aquí consiste en inmovilizar la cabeza de las moscas despiertas succionando la probóscide en un pequeño tubo metálico conectado a un sistema de vacío. Mientras la cabeza está fija, la mosca se prepara para la obtención de imágenes funcionales sin necesidad de anestesia. Este protocolo es rápido y reproducible, lo que garantiza que no dañe a la mosca. La principal ventaja de este método radica en que evita el uso de anestésicos, lo que explica los posibles efectos complejos de la anestesia sobre la actividad neuronal. Este método es asequible y altamente adaptable, ya que utiliza herramientas económicas y personalizables. Permite obtener imágenes exitosas de moscas vivas, capturando cambios rápidos en la actividad neuronal asociada con procesos cognitivos dinámicos.

Introducción

Los avances recientes en los reporteros de actividad codificada genéticamente han revolucionado la neurociencia al proporcionar información muy específica y en tiempo real sobre la actividad neuronal. Estos reporteros, como los sensores de calcio o voltaje 1,2,3,4,5,6,7,8,9, permiten a los investigadores rastrear las señales eléctricas y químicas dentro de las neuronas con una precisión temporal y una resolución espacial sin precedentes. Al permitir el monitoreo de neuronas específicas y únicas a redes neuronales en diferentes regiones del cerebro, estas herramientas han profundizado nuestra comprensión de cómo los patrones de activación neuronal se relacionan con procesos cognitivos como el aprendizaje, la memoria o la toma de decisiones 10,11,12,13,14.

Para aprovechar estos indicadores codificados genéticamente, los investigadores desarrollaron métodos avanzados para preparar su organismo modelo para la obtención de imágenes in vivo. El primer informe de plasticidad neuronal mediante imágenes funcionales in vivo, a menudo denominadas "rastro de memoria", se descubrió en el lóbulo antenal de las abejas melíferas después de un condicionamiento olfativo apetitivo15. Este descubrimiento inspiró la investigación en el organismo modelo genéticamente versátil, Drosophila melanogaster, lo que llevó al desarrollo de técnicas innovadoras de imagen in vivo 10,16,17,18.

Drosophila sirve como un excelente modelo para comprender el aprendizaje y la memoria debido a su robusta capacidad para formar recuerdos olfativos a través del condicionamiento clásico, donde un olor (el estímulo condicionado-CS) se asocia con un estímulo aversivo o gratificante (el estímulo incondicionado-US)19,20,21,22. En Drosophila, los olores están escasamente representados en el cuerpo del hongo (MB)23, una región crítica del cerebro para la memoria asociativa que consta de aproximadamente 2.000 neuronas de células de Kenyon (KC) por hemisferio. La información olfativa se transmite desde el cáliz a los lóbulos MB a través de los axones KC, que se agrupan para formar los lóbulos. Durante el condicionamiento olfativo, la US, como una descarga eléctrica o una recompensa de azúcar, se transporta a los lóbulos MB a través de distintas neuronas dopaminérgicas (DAN): neuronas PPL1 para estímulos aversivos y neuronas PAM para estímulos gratificantes 25,26,27,28,29,30. Se cree que la adquisición de memoria implica la activación simultánea de las vías CS y US, lo que resulta en un aumento sinérgico del AMP cíclico (cAMP), que codifica la memoria31,32. Este proceso induce plasticidad en las sinapsis KC→MBON, modificando su peso sináptico 11,12,13,33,34,35,36,37. La plasticidad mediada por DAN en última instancia impulsa a las neuronas de salida del cuerpo del hongo (MBON) a provocar un acercamiento o un comportamiento de evitación hacia el olor aprendido34. El modelo actual sugiere que el flujo de información de los KC a los MBON transforma la representación del olor de la identidad del olor en los KC a información más abstracta en los MBON, como la valencia de un olor basada en la experiencia previa34,38. A diferencia de los KC, los MBON tienen respuestas de olor ampliamente ajustadas; cualquier olor dado da como resultado una respuesta a la mayoría de los MBON39. El ajuste del olor de los MBON es modificado por la plasticidad sináptica y varía significativamente entre moscas individuales, lo que sugiere que los MBON cambian su respuesta a los olores en función de la experiencia. Hay 34 MBON, con la mayoría de la red de MBON aparentemente dividida en dos clases mutuamente antagonistas que impulsan cualquiera de los enfoques de comportamiento de evitación34. Por esta razón, el uso de imágenes in vivo para estudiar la recuperación de la memoria mediante el registro en diferentes MBON ha sido ampliamente utilizado.

Los primeros métodos para la obtención de imágenes funcionales in vivo incluyen la realización de cirugías para extirpar una sección de la cutícula de la parte superior de la cápsula de la cabeza, que luego se cubrió con un pequeño trozo de envoltura de plástico18. Si bien esto marcó el comienzo de las imágenes in vivo en Drosophila, desde entonces ha habido avances significativos en las técnicas de preparación de moscas y la administración de estímulos bajo el microscopio para investigar procesos como el aprendizaje y la memoria. Sin embargo, incluso hoy en día, la mayoría de las técnicas de preparación de moscas para la obtención de imágenes in vivo implican anestesiar a las moscas. Esta práctica presenta desafíos, ya que existe una amplia evidencia -y todo un campo de investigación- que demuestra cómo la anestesia afecta la memoria, así como otros procesos cognitivos y fisiológicos. Por ejemplo, se llevó a cabo un estudio para comprender los efectos de diferentes anestésicos que se usan muy comúnmente en el entorno del laboratorio (dióxido de carbono, isoflurano, sevoflurano y choque frío). Encontraron que cuanto más prolongada era la exposición a la anestesia, había un aumento en el tiempo de recuperación, cambios en la actividad locomotora, menor fecundidad, y puede afectar las reservas de agua y lípidos40. Además, se ha reportado que administrar anestesia de choque frío inmediatamente después del entrenamiento puede alterar completamente la memoria a corto plazo21. A partir de este estudio inicial, ahora se sabe que en Drosophila, hay una memoria no consolidada (memoria sensible a la anestesia) que decae en 6-8 h, y una forma de memoria consolidada (memoria resistente a la anestesia) que se forma gradualmente después del aprendizaje y puede durar alrededor de 24 h41. En base a esto, la anestesia puede afectar el procesamiento cognitivo y la actividad de las neuronas, lo que eventualmente permite la expresión adecuada de la memoria.

Los efectos de la anestesia sobre la memoria no se limitan a Drosophila. Numerosos estudios en humanos y otros mamíferos han demostrado hallazgos similares. Por ejemplo, un estudio transversal realizado en un hospital universitario encontró que la memoria a corto plazo se redujo significativamente en los pacientes 24 horas después de la anestesia general42. Otro estudio realizado en ratones encontró que la anestesia general redujo robustamente la dinámica de los picos, los conjuntos celulares descorrelacionados y la dinámica alterada de la columna vertebral en la región CA1 del hipocampo, un área importante del cerebro involucrada en el aprendizaje y la memoriaen los mamíferos. Para superar estas dificultades, el objetivo de este estudio es proporcionar un protocolo novedoso que elimine el uso de anestesia durante la preparación de la mosca para la obtención de imágenes in vivo , dejando el cuerpo de la mosca completamente libre. Este enfoque permite registros más precisos de la actividad neuronal, mejora la salud de las moscas para registros más largos y elimina los posibles efectos de confusión de la anestesia en comparación con otros enfoques. Este protocolo está diseñado para registrar la actividad de las neuronas en Drosophila, específicamente observando cómo las neuronas exhiben plasticidad durante y después de la experiencia de aprendizaje. Sin embargo, el protocolo de disección es versátil y se puede adaptar a diversas aplicaciones en la investigación de imágenes en vivo.

Protocolo

Los detalles del equipo y los reactivos utilizados para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Moscas transgénicas de la fruta, Drosophila melanogaster

  1. Cruce de moscas vírgenes hembras y machos (criadas a 25 °C con una humedad relativa del 60% en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h) portadoras de las construcciones Gal4 y UAS deseadas, respectivamente, para producir moscas en las que neuronas específicas de interés expresan el indicador de actividad codificado genéticamente deseado.
  2. Envejezca la progenie de la cruz anterior hasta que esté en el rango de 2-5 días después de la eclosión. Se pueden utilizar tanto machos como hembras, ya que las cámaras de imagen están hechas a medida para adaptarse a ambos sexos.

2. Construcción de un aspirador (flujo de trabajo de 5 minutos)

  1. Corta un tubo de silicona de 6 mm de unas 8 pulgadas de largo con una cuchilla de afeitar. Tome una punta de pipeta p200 y corte aproximadamente la mitad con una cuchilla de afeitar para la boquilla (Figura 1A). Inserte la punta cortada en el tubo. Corte la punta de una pipeta p1000 lo suficiente como para que una mosca pueda moverse a través de ella.
  2. Toma un pequeño trozo de algodón y cubre el tubo de silicona. Esto es para evitar que la mosca aspire en la boca del experimentador. Coloque la punta p1000 cortada en el tubo cubierto de algodón.
  3. Cubra la punta de pipeta p1000 con una nueva punta de pipeta p200. Para determinar la longitud adecuada para cortar la punta de pipeta p200, primero retire la punta de pipeta p200 y aspire una mosca en la punta de pipeta p1000. Vuelva a colocar la punta p200. Sople y golpee suavemente la mosca para moverla lo más lejos posible en la punta del p200.
    1. Una vez que ya no pueda avanzar más, use un microscopio de disección para marcar el punto donde termina la cabeza de la mosca y comienza el tórax, con una hoja de afeitar. Aspire la mosca de nuevo en la punta de pipeta p1000 y corte la punta de pipeta p200 en la posición marcada.

3. Construcción del aspirador de probóscide de tubo metálico (flujo de trabajo de 5 a 10 minutos)

  1. Corta el tubo de metal hipodérmico de calibre 22X al tamaño deseado (~10 cm) con herramientas Dremel y una hoja de sierra de diamante. Pule los extremos de los tubos metálicos con un disco de corte Dremel 420 para crear una abertura lisa y limpia. Esta abertura acomodará la probóscide de la mosca.
  2. Envuelva el tubo alrededor de un tubo de centrífuga de 15 ml para obtener la forma curva deseada (Figura 1A). La curva debe crear una forma de gancho que permita que el cuerpo de la mosca esté alineado con la cámara.
  3. Corta un trozo (~7 cm de largo) del tubo de metal hipodérmico de calibre 12TW con herramientas Dremel (este tubo debe caber en una punta de pipeta de 2 μL). Tome una punta de pipeta de 2 μL y corte el extremo con una cuchilla de afeitar para ajustar el tubo metálico de calibre 22X. Coloque el tubo metálico más grande en el otro extremo de la punta de la pipeta de 2 μL.
  4. Mezcla una pequeña cantidad de resina y un endurecedor de pegamento epoxi. Aplique la mezcla donde el tubo metálico pequeño se encuentra con la punta de la pipeta y donde el tubo metálico más grande se conecta a la punta de la pipeta. Deje que el adhesivo se cure por completo durante la noche antes de conectar el conjunto a un soporte en un micromanipulador. Ajuste el ángulo según sea necesario.

4. Construcción de una pipeta de entrega de choque y olor para experimentos de aprendizaje y memoria bajo el microscopio (flujo de trabajo de 10 minutos)

  1. Con una herramienta de diamante Dremel, corte 1 mL en una pipeta de vidrio de 1/100 en la marca de 3 mL. Corta una pequeña pieza rectangular de lámina acrílica con unas dimensiones de 24,5 mm x 8 mm y un grosor de 1/8 de pulgada.
    NOTA: Alternativamente, esta pieza se puede imprimir en 3D para acomodar mejor la rejilla de choque (los archivos stl y obj se pueden encontrar en el Archivo Suplementario 1 y el Archivo Suplementario 2).
  2. Corta la rejilla de choque de cobre para que encaje en la pieza acrílica rectangular del paso anterior. Suelde dos cables eléctricos en extremos opuestos de la rejilla de cobre. Coloque la rejilla de cobre en la pieza acrílica rectangular y dúblela para que el abdomen y las patas de la mosca encajen en la rejilla de choque (Figura 1I).
  3. Pega la rejilla de cobre al plástico rectangular con un trozo de cinta aislante. Con una pistola de pegamento caliente, fije firmemente la pipeta de vidrio a la rejilla de choque, asegurándose de que esté recta y correctamente centrada. Usando un multímetro digital, verifique que la rejilla de cobre esté funcionando para administrar un choque efectivo a las patas de la mosca.

5. Montaje de resistencia de platino para la fusión de pegamento (ácido mirístico) (flujo de trabajo de 20 minutos)

  1. Con pelacables, corte 200 mm de alambres a la longitud deseada y pele un extremo de ambos alambres. Corta unos 60 mm del alambre de platino (esta longitud debería ser suficiente para crear un bucle que se utilizará para derretir el pegamento).
  2. Con una pistola de soldar, suelde un extremo del cable de platino al cable eléctrico. Pase un tubo termorretráctil a través del cable eléctrico y use un quemador Bunsen para contraer el tubo en el cable para cubrir las partes soldadas.
  3. Corta dos piezas de 20 mm del tubo de goma de 2,55 mm de diámetro interior y pásalas a través del alambre de platino (mantén el alambre de platino recto para facilitar este proceso). Use la pistola de soldar para soldar el otro extremo del cable de platino al otro cable eléctrico. Utilice un nuevo tubo termorretráctil para cubrir esta nueva pieza soldada.
  4. Retire el émbolo de una jeringa BD tb 1 mL y pase los cables de los pasos anteriores a través del cilindro. El platino debe sobresalir del extremo del cilindro de la jeringa. No debe haber cables expuestos, y el pequeño tubo de goma debe cubrir el alambre de platino, excepto hasta el final.
  5. Con un pelacables, pele una pequeña cantidad de los otros extremos de los cables eléctricos. Con una pistola de soldar, suelde cada cable a un enchufe banana hasta que esté bien conectado.
  6. Use pegamento epoxi para pegar la parte superior y la base del cilindro de la jeringa para pegar los cables y el cilindro; Esto evitará la tensión en los cables dentro de la jeringa y asegurará una vida útil más larga de la resistencia. Deja que el pegamento se cure toda la noche.
  7. Conecte la resistencia terminada a la fuente de alimentación de CC.

6. Construcción de la cámara de grabación - (flujo de trabajo de 2 días)

  1. Después del Archivo Suplementario 3, corte con láser una hoja de cuña negra (espesor de 0,0125 pulgadas). El tamaño de la abertura en el centro de la cámara se puede modificar para adaptarse al tamaño de las moscas (el tamaño de la lima generalmente se ajusta a hembras y machos).
  2. Tome un portaobjetos de microscopio de vidrio que servirá como base de la cámara. Mezcla la resina y el epoxi. Tome la cámara acrílica negra y, con pegamento epoxi, coloque imanes de neodimio de 3 mm x 2 mm en las cuatro esquinas. Se recomienda pegar un imán a la vez y sostenerlo mientras el pegamento se cura con un clip.
  3. Coloque dos imanes nuevos en cada uno de los imanes pegados a la cámara anteriormente. Con epoxi, pegue el último imán adjunto a un portaobjetos de vidrio y use clips para mantenerlo en su lugar mientras selecciona.
    NOTA: Una vez que se selecciona el pegamento, la cámara está completa y se pueden agregar más imanes para ajustar la altura de la cámara para los experimentos. El Archivo Suplementario 4, el Archivo Suplementario 5 y el Archivo Suplementario 6 muestran la cámara de registro ensamblada.

7. Protocolo de disección in vivo sin anestesia - (flujo de trabajo de 5 a 7 minutos)

  1. Retire la punta de pipeta p200 del aspirador. Inserte el aspirador en el vial y aspire una sola mosca en la punta de la pipeta p1000. Vuelva a colocar la punta de pipeta p200 en el aspirador. Sople y agite suavemente el aspirador para que la mosca quede inmovilizada en la parte superior de la punta de la pipeta p200, de cabeza.
  2. Coloque la cámara de disección en el soporte del manipulador. Conecte la aspiradora al tubo de retención de moscas y ajuste el nivel de flujo según sea necesario (~ 500 ml / min). Utilice un conector rápido para conectar-desconectar la aspiradora de manera fácil y rápida (Figura 1A).
  3. Mueva el tubo metálico de vacío para centrarlo en el campo de visión cuando mire a través del microscopio. Confirme que la cámara esté colocada correctamente para que vaya directamente encima del tubo de metal cuando esté lista para pegar la mosca. Aspire suavemente la probóscide de la mosca en el soporte de vacío (Figura 1A).
  4. Una vez que la mosca esté en la posición correcta, mueva el manipulador de modo que la cabeza de la mosca quede alineada con la abertura de la cámara.
  5. Encienda la fuente de alimentación de CC. La corriente debe configurarse entre 0,40 y 0,50 amperios. Las corrientes más altas pueden hacer que el ácido mirístico se derrita hasta el punto en que su viscosidad se vuelva demasiado baja, lo que aumenta el riesgo de que el pegamento se extienda sobre la cabeza de la mosca.
  6. Usando la resistencia del platino, pegue los lados de los ojos y el tórax a la cámara con ácido mirístico derretido (Figura 1B). Para evitar que el pegamento caiga en la cutícula de la cabeza, use la menor cantidad de pegamento posible, especialmente cuando pegue los lados de los ojos.
  7. Una vez que los ojos y el tórax estén pegados, desconecte el tubo de vacío y use el manipulador para quitar la cámara de grabación del tubo de vacío. Dé la vuelta a la cámara y use la resistencia del platino para pegar la probóscide desde abajo (Figura 1C). Pegar los ojos desde la parte inferior es opcional y puede ayudar a mantener la mosca en su lugar durante la disección, pero no es necesario.
  8. Una vez que todo esté pegado, apague la fuente de alimentación de CC, gire la cámara en posición vertical y conéctela a la base lateral de vidrio. Corta un pequeño trozo de cinta adhesiva con unas tijeras y aplícalo justo delante y detrás de la cabeza de la mosca (Figura 1D).
  9. Gire la cámara de modo que la cabeza quede frente al experimentador a 90. Con una aguja de disección, haga un corte vertical a lo largo de los lados de los ojos (Figura 1E). Gire la cámara para que quede colocada horizontalmente. Con la aguja de disección, corte a lo largo de la cutícula (Figura 1E).
    NOTA: Asegúrese de que la "ventana" de la cutícula que acaba de crear se pueda levantar con la aguja de disección. Si se levanta sin ninguna resistencia, vuelva a colocar la aguja de disección en su cubierta. No se utiliza solución salina en los pasos 13 y 14 para evitar la refracción de la luz, que podría obstruir una visión clara durante los cortes.
  10. Agregue 100 μL de solución salina a la parte superior de la cabeza de la mosca (Figura 1F). Con pinzas afiladas, retire con cuidado la ventana (Figura 1G). Con las pinzas afiladas, retire con cuidado cualquier resto de grasa o tráquea. El cerebro debería estar listo para la obtención de imágenes ahora (Figura 1H-1J).

8. Visualización de la plasticidad inducida por el aprendizaje a través del condicionamiento olfativo aversivo (flujo de trabajo de 20 minutos)

  1. Usando un microscopio confocal equipado con un láser y un objetivo de inmersión en agua, coloque la mosca preparada en la platina del microscopio. Opcionalmente, use una cámara con una lente macro para enfocar la mosca, asegurándose de que la mosca esté sana y en movimiento.
  2. Ajuste la posición de la rejilla de choque/pipeta de olores con un micromanipulador para que la mosca se asiente en la rejilla de choque.
    NOTA: La mosca aún debe poder moverse libremente, ya que la rejilla de choque solo toca las patas y ligeramente el abdomen (la mosca debe poder quitar las patas y el abdomen de la rejilla si está retraída). La pipeta de expulsión de olores debe dirigirse hacia las antenas de la mosca.
  3. Con la perilla de ajuste Z gruesa, escanee el eje Z del cerebro y localice la región cerebral de interés. Ajusta el tamaño del marco a 512 x 512 px. La frecuencia de escaneo debe ajustarse a la velocidad deseada, con un mínimo de 2 Hz. Por último, establece la duración de la grabación.
  4. Comience a registrar la neurona de interés utilizando un sistema de entrega de olor hecho a medida o comercial, e inicie una entrega de olor de "pre-entrenamiento" simultáneamente (Figura 2C). Ajusta la grabación a 2 min. La presentación de olores antes del entrenamiento comienza registrando las respuestas a un primer pulso de olor de 5 s (CS-) seguido de un segundo pulso de olor de 5 s (CS+) con un intervalo entre estímulos de 30 s.
  5. Después de recopilar las respuestas previas al entrenamiento, espere 5 minutos antes de iniciar un protocolo de entrenamiento en el sistema de entrega de olores. Para este ejemplo, solo se presentó el CS+ durante el entrenamiento. El olor CS+ se presenta durante 1 minuto iniciado a los 30 s después de activar el sistema de entrega de olores. El estimulador de choque está programado para administrar simultáneamente 12 descargas de 90 V mientras se presenta el olor.
  6. Después del entrenamiento, espere 5 minutos o 15 minutos antes de obtener respuestas posteriores al entrenamiento. Registre las respuestas posteriores al entrenamiento de la misma manera que se registraron las respuestas previas al entrenamiento en el paso 6. Guarde todos los archivos en el formato adecuado para su posterior análisis de imágenes.

9. Análisis de imágenes

  1. Para analizar las grabaciones, dibuje una región de interés (ROI) alrededor del área de la neurona. Esto debe ser lo más preciso posible para limitar la influencia de la fluorescencia de fondo.
  2. Utilice la herramienta de medición para extraer datos de intensidad de fluorescencia media dentro del ROI para cada fotograma de la grabación. Exporte estos datos como un archivo CSV.
  3. Abra los datos en MATLAB o en cualquier programa de análisis de datos para calcular los valores de ΔF/Fo para cada rastro de olor. Combine los datos para obtener el promedio de ΔF/Fo en general de los registros de moscas individuales y cree un gráfico de los rastros medios de la respuesta al olor antes y después del entrenamiento (Figura 2E, F).

Resultados

Aquí, se utilizan imágenes in vivo de Drosophila adulta sin anestesia para investigar el condicionamiento olfativo aversivo que induce plasticidad en una neurona de salida del cuerpo de hongo bien caracterizada (MBON γ2α'1)12. El indicador de calcio GCaMP6f2, junto con la proteína roja fluorescente TdTom, se expresan en una neurona de salida de MB, cuyas dendritas inervan el compartimento de los lóbulos de MB γ y α' y se dirige genéticamente a la MBON γ2α'1 utilizando la línea Gal4 dividida MB077C34 (Figura 2A,B).

Para observar la plasticidad después del condicionamiento olfativo aversivo, la mosca se coloca bajo el microscopio confocal, con el abdomen y las patas alineadas en el centro de la rejilla de choque y la pipeta de liberación de olores apuntando hacia la antena de la mosca. En primer lugar, se registraron las respuestas de olor de calcio a un pulso de 5 s de 4-metilciclohexanol (MCH) seguido de un pulso de 5 s de 3-octanol (OCT), separados por un intervalo entre estímulos de 30 s. Cinco minutos más tarde, las moscas fueron entrenadas mediante la presentación simultánea de un pulso OCT (CS+) de 1 min junto con 12 descargas de 90 V. Este programa de condicionamiento asociativo produce una robusta memoria aversiva conductual. Finalmente, 5 min y 15 min después del acondicionamiento, se registraron las respuestas de calcio a la MCH y la OCT como antes del entrenamiento. MBON γ2α'1 responde robustamente por los transitorios de calcio tanto a MCH como a OCT antes del acondicionamiento (Figura 2D-F). Sin embargo, coincidiendo con los hallazgos previos12, las respuestas de calcio post-acondicionamiento de 5 min a CS+ (OCT) están completamente deprimidas (Figura 2D-F). Además, las respuestas al CS- (MCH), se potenciaron significativamente. Quince min post-entrenamiento mostraron resultados similares, ya que la respuesta de calcio al CS+ se deprimió significativamente y el CS- se potentió. Estos resultados indican que el rastro de memoria observado en ambos olores dura al menos 15 minutos (Figura 2D-F). Estas respuestas se cuantificaron utilizando la respuesta promedio del olor durante el pulso de 5 s y se compararon dentro de la mosca. Estos cambios en las respuestas a los olores también se pueden visualizar mediante una representación en pseudocolor del cambio en la fluorescencia de GCaMP6 antes y después del entrenamiento aversivo (Figura 2E). Por el contrario, la anestesia de la mosca durante la preparación muestra una plasticidad reducida tanto para CS+ como para CS-. Solo se observa una depresión parcial a CS+ en animales anestesiados, ya que las respuestas posteriores al entrenamiento aún están presentes. Además, las respuestas de CS- no son significativamente diferentes después del entrenamiento (Figura 2G, H). Para observar mejor esto, calculamos la plasticidad inducida como la relación CS+/CS- y demostramos que las moscas no anestesiadas muestran una plasticidad significativamente mayor en comparación con los animales anestesiados (Figura 2I). Estos resultados representativos indican que este protocolo es adecuado para estudiar el aprendizaje y la memoria bajo el microscopio y garantiza la salud de la mosca durante la obtención de imágenes de las neuronas durante un largo período de tiempo. Este protocolo es lo suficientemente versátil y se puede aplicar a otros tipos de imágenes in vivo y otras neuronas de interés.

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Figura 1: Preparación de imágenes in vivo de Drosophila sin el uso de anestesia. (A) Panel superior: Diagrama que ilustra los pasos involucrados en la preparación del aspirador. Panel inferior: Diagrama que muestra la cámara sostenida en un micromanipulador durante el posicionamiento de la mosca. La probóscide de la mosca se coloca en la abertura de un tubo metálico conectado a un vacío a 500 mL/min mediante un aspirador. A continuación, la cámara se coloca por encima de la mosca. (B) Los lados de los ojos y el tórax se pegan con ácido mirístico utilizando una resistencia de platino hecha a medida. (C) La probóscide de la mosca se retira del tubo metálico y la cámara se invierte para permitir que la probóscide se pegue en su lugar, minimizando así el movimiento durante las grabaciones. (D) La cámara está unida a una base deslizante de vidrio. Se aplica cinta adhesiva en la parte superior de la cámara, cubriendo las antenas, y en la parte posterior para evitar fugas de solución salina. (E) Se hacen dos cortes verticales a lo largo de la cutícula cerca de los ojos compuestos, seguidos de un tercer corte a través de la cutícula cerca del tórax, creando una "ventana" al cerebro. (F) Se añaden entre 100 y 200 μL de solución salina a la cabeza de la mosca en el lugar de los cortes. (G) La ventana de la cutícula se levanta, se tira y se separa con pinzas afiladas y finas para exponer el cerebro. (H) La grasa y el tejido traqueal se eliminan para permitir una visualización clara de las células cerebrales bajo el microscopio. (I) La mosca preparada se coloca bajo el microscopio y se coloca con su cuerpo alineado en la parte superior de la rejilla de choque. (J) Imagen en pseudocolor que muestra el patrón de expresión de MBON γ2α′1. La región de interés está delineada con una línea discontinua que rodea el eje dendrítico. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Plasticidad inducida por el aprendizaje en MBON γ2α′1 después de un condicionamiento olfativo aversivo. (A) Patrón de expresión del controlador MB077C-splitGal4 que expresa GCaMP. Los cerebros fueron disecados y teñidos con anti-GFP y contrateñidos con anti-nc82. Barra de escala: 50 μm. (B) Imagen pseudo-color de MBON γ2α′1 que destaca el cuerpo de la célula, el proceso de extensión y el árbol dendrítico. La región dendrítica representa el área de la que se recogieron las respuestas de calcio. Barra de escala: 50 μm. (C) Esquema del protocolo de entrenamiento aversivo. Las moscas se expusieron a pulsos de 5 s de MCH y OCT con 30 s de aire limpio en el medio. Después de un intervalo de 5 minutos, las moscas fueron entrenadas para asociar la OCT con doce descargas eléctricas de 90 V. Los registros de las respuestas de calcio a la MCH y la OCT se realizaron 5 min y 15 min después del entrenamiento. (D) Los rastros de la respuesta al olor a MCH (panel superior) y OCT (panel inferior) se muestran antes del entrenamiento, y a los 5 minutos y 15 minutos después del entrenamiento. Las barras negras gruesas indican el momento de la presentación del olor. (E) Imágenes pseudo-color del árbol dendrítico de MBON γ2α′1 pre-entrenamiento, y 5 min y 15 min post-entrenamiento, en respuesta tanto a MCH como a OCT. Se observa potenciación de la fluorescencia para el CS- (MCH), mientras que la fluorescencia se suprime para el CS+ (OCT). Barra de escala: 20 μm. (F) La respuesta media del olor a la MCH se potencia significativamente a los 5 min y 15 min después del entrenamiento, mientras que las respuestas a la OCT (CS+) se suprimen significativamente. Prueba pareada no paramétrica de Wilcoxon, N = 12. (G) Los rastros de la respuesta al olor a MCH (panel superior) y OCT (panel inferior) se muestran para moscas anestesiadas antes y 5 minutos después del entrenamiento. Las barras negras gruesas indican la entrega de olores. (H) En los animales anestesiados, las respuestas medias de olor a la MCH no muestran una potenciación significativa después del entrenamiento, y las respuestas a la OCT exhiben solo una supresión parcial en comparación con los animales no anestesiados. (I) La plasticidad inducida por el entrenamiento, calculada como la relación CS+/CS-, es significativamente menor en las moscas anestesiadas en comparación con las preparadas sin anestesia. Prueba pareada no paramétrica de Wilcoxon, N = 8-12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fichero Complementario 1: Grid_holder (STL). Archivo STL del componente diseñado a medida utilizado para sujetar la red eléctrica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 2: Grid_holder (OBJ). Archivo OBJ del componente diseñado a medida utilizado para sostener la red eléctrica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 3: Chamber_LaserCut. Archivo de Adobe Illustrator utilizado para el corte láser del componente superior de las cámaras de grabación para moscas macho y hembra. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 4: Recording_chamber (STL). Archivo STL de la cámara de grabación diseñada a medida. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 5: Recording_chamber (OBJ). Archivo OBJ de la cámara de grabación diseñada a medida. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 6: Recording_chamber_animation. Vídeo MP4 que muestra una animación de la cámara de grabación montada. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Comprender los circuitos neuronales detrás del aprendizaje y la memoria es un objetivo central en el campo de la neurociencia. El conjunto de herramientas genéticas disponibles en Drosophila, combinado con la simplicidad y versatilidad de las pruebas de comportamiento, lo convierte en un organismo modelo ideal para estudiar estos procesos. Estudios publicados en diversos laboratorios han descrito diferentes protocolos para la preparación de moscas para la obtención de imágenes funcionales sin el uso de anestesia44,45. Sin embargo, estos protocolos varían ampliamente y, a menudo, se basan en herramientas altamente especializadas y personalizadas con orientación limitada sobre cómo construirlas o usarlas. En este protocolo, se presenta un método para realizar imágenes funcionales in vivo en moscas que evita los efectos de confusión de la anestesia general. Además, este enfoque permite capturar la actividad neuronal en tiempo real dentro de la misma mosca, lo que permite comparaciones directas de las respuestas neuronales antes y después de la exposición a diversos estímulos.

Al completar este protocolo, los pasos críticos incluyen asegurarse de que la probóscide de la mosca esté colocada correctamente en el tubo de vacío. Este paso asegura que el pegado posterior se producirá en los lugares correctos y asegura que la cabeza esté en el ángulo correcto para visualizar las neuronas de interés. La aplicación mínima de pegamento es esencial para mantener la salud de las moscas; Lo ideal es usar la cantidad más pequeña necesaria para asegurar la mosca en su lugar. Este protocolo también permite algunas modificaciones para adaptarse a necesidades específicas, como pegar solo los lados de los ojos para que todo el cuerpo quede libre. Del mismo modo, se puede conectar una cámara de perfusión a la parte superior de la cámara de registro para facilitar la perfusión del timbre o la administración del fármaco. Finalmente, se puede colocar una cinta de correr flotante giratoria debajo de la mosca como se informó anteriormente, lo que permite el análisis de la direccionalidad de la locomoción46,47.

Este protocolo tiene algunas limitaciones, incluido el estrés al que se someten las moscas durante la microcirugía para preparar a las moscas para la obtención de imágenes en vivo. Manipular las moscas pequeñas, aplicar pegamento con moderación y abrir cuidadosamente la cápsula de la cabeza sin dañar ningún tejido cerebral o cuerpo requiere una experiencia sustancial, que solo se puede adquirir a través de la práctica meticulosa y la repetición. Si bien este método es particularmente beneficioso para estudiar los procesos cognitivos a nivel celular, las imágenes in vivo aún tienen algunas limitaciones en comparación con los registros electrofisiológicos. Además, si bien nuestro protocolo evita el uso de anestesia antes de la toma de imágenes, la mosca todavía está confinada a una cámara física, que siempre puede alterar las respuestas celulares. No obstante, nuestra metodología proporciona la forma más cercana de preservar la salud de la mosca para obtener imágenes óptimas in vivo . En comparación con los métodos existentes que utilizan anestesia y restringen a la mosca, nuestro método tiene como objetivo mantener a la mosca moviéndose lo más libremente posible mientras se pueden obtener imágenes de las células con un movimiento mínimo.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales para 1R01GM147917-01A1 y la Fundación de Investigación del Cerebro y el Comportamiento para 30442.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,102 mm Alambre de platinoSurepure Chemetals2690
0,25 OD, 0,125 ID, tubo de silicona curado con platinoVWR89068-474
0,3 mm ID Tubo de siliconaFisher Scientific11-189-14
Banana plugsAmazon
Hoja de acrílico negro para cámara 0.0125 inMarca de precisión44250
Clorurode calcio Sigma-Aldrich746495
Rejilla de choque de cobreFuente
para resistencia de platinoFisher ScientificS35740
Herramienta Dremel 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;; uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ; UAS-GCAMP6F;BDSC42747Esta línea uas se combinó con ;; uas-td-tom para generar un stock que contenga ambas inserciones
Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
Pegamento epoxiMedidor4200102
1.5 LPMAmazonB01N0UWZ2T
Vidrio 1 mL Pipeta serológicaFisher Scientific50-232-9516
Portaobjetos de vidrioFisher Scientific 12-550-A3
GlucosaSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH4034
Tubo hipodérmico de calibre 12TWMicrogrupo316H12TW
Tubo hipodérmico de calibre 22XMicrogrupo304H22X
Cloruro de magnesio hexahidratadoSigma-AldrichM9272
Ácido mirísticoAcros Organics156961000
Imanes de neodimio 3X2 mmAmazonB0CXSQ387M
P1000 puntasGenesee Scientific 23-165RL
P200 puntasGenesee Scientific 23-150RL
Conector de empuje neumático 6mm ODAmazonB07ZHG8Y1Y
Cloruro de potasioTubo de PTFE Sigma-AldrichP3911
6mm ODAmazon
Cuchillas de afeitar AmazonB08LYD6645
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS5761
Cloruro de sodioFisher ScientificS271-500
Fosfato de sodio DibasicSigma-AldrichS0876
SacarosaSigma-AldrichS9378
TrehalosaSigma-AldrichT0167
de alimentación de CC hecha a medida de flujo de gas Gorilla

Referencias

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