Visualización de rayos X de infusión ablativa basada en etanol intraductal para la prevención del cáncer de mama en modelos de conejo

Resumen

Este protocolo presenta un procedimiento para la infusión guiada por imágenes en el sistema de árbol ductal de la glándula mamaria del conejo. Demostramos la infusión controlada de una solución ablativa a base de etanol que contiene un agente de contraste de rayos X en todas las aberturas de los pezones mediante imágenes en tiempo real por fluoroscopia.

Resumen

El cáncer de mama es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en las mujeres. Si bien hay pocas intervenciones proactivas para las mujeres de riesgo promedio, la mastectomía profiláctica es la intervención más eficaz para reducir el riesgo para las mujeres de riesgo alto. Sin embargo, la mastectomía profiláctica es un procedimiento invasivo que elimina todas las células epiteliales mamarias junto con el estroma, el tejido graso y/o la musculatura circundantes. Nuestro objetivo general de investigación es desarrollar un procedimiento de administración intraductal (ID) no invasivo que mate localmente las células epiteliales mamarias llenando todo el árbol ductal con una solución ablativa. Anteriormente demostramos que la administración de etanol como solución ablativa es efectiva en modelos de roedores (ratones y ratas). Este protocolo presenta una administración de ID de solución de etanol al 10-70% que contiene iohexol (90-300 mg / ml) como agente de contraste de rayos X en el sistema de árbol multiductal de la glándula mamaria del conejo. La glándula mamaria de un conejo (Oryctolagus cuniculus) con un sistema de conductos múltiples es más parecida al pecho humano que las de otros animales grandes (por ejemplo, vacas, ovejas). Este protocolo de conejo aborda los desafíos técnicos de escalabilidad, imágenes en tiempo real y entrega de ID en un sistema de árbol multiductal en un modelo intermedio de animales grandes. Este protocolo establece una administración de identificación de múltiples conductos guiada por fluoroscopia con instrumentos, materiales y reactivos que podrían aplicarse directamente en la clínica. El análisis tisular permite optimizar la concentración de etanol para una ablación epitelial máxima y un daño tisular colateral mínimo como punto de partida para la futura evaluación por primera vez en humanos de este procedimiento ablativo para la prevención primaria del cáncer de mama.

Introducción

El cáncer de mama (CB) es la muerte más común y la segunda más alta relacionada con el cáncer en las mujeres en los Estados Unidos. Las proyecciones para 2025 estiman que habrá 316,950 nuevos cánceres de mama y 42,170 mujeres morirán de BC¹. Actualmente, la mastectomía profiláctica bilateral es el procedimiento más eficaz para prevenir la CB. Sin embargo, este es un procedimiento altamente invasivo que implica una extirpación completa de las células epiteliales, de las cuales surge el carcinoma de mama, y el tejido circundante. Debido a su invasividad, así como al impacto psicológico y social de este procedimiento, menos del 50% de las mujeres de alto riesgo se someten a una mastectomía para reducir el riesgo². Nosotros, y otros, hemos desarrollado procedimientos de administración intraductal (ID) para la prevención primaria y / o el tratamiento local del cáncer de mama en modelos de roedores ^2,3 como una alternativa a las prevenciones y tratamientos actuales. El etanol (EtOH) tiene un perfil de baja toxicidad y seguridad que está bien establecido y se utiliza en múltiples aplicaciones clínicas, como agentes esclerosantes para el tratamiento de malformaciones venosas y como agente ablativo para el tratamiento local de algunos cánceres³. Por lo general, se infunden o administran varios mililitros de EtOH a una concentración del 90-100% en estos procedimientos clínicos. En nuestro trabajo anterior, la administración de EtOH al 70% directamente en el sistema de árbol ductal de modelos de ratón y rata fue eficaz para ablacionar químicamente las células epiteliales mamarias con daño limitado al tejido normal adyacente y para prevenir la formación de tumores de mama 4,5,6,7. A medida que este procedimiento se amplía al sistema de árbol ductal más grande de un conejo con una mayor relación entre el volumen luminal y el área de superficie de la célula epitelial luminal, exploramos las propiedades ablativas de una solución con un porcentaje más bajo de EtOH (10% a 70%). Con una búsqueda de traducción clínica, razonamos que el porcentaje más bajo de etanol que es efectivo para ablacionar las células epiteliales será el más bien tolerado y tendrá el mejor perfil de seguridad.

La confirmación del llenado completo del árbol ductal es necesaria para garantizar que la solución ablativa ha entrado en contacto directo con las células epiteliales mamarias. En nuestros estudios anteriores en modelos de roedores, se utilizó la visualización de rayos X de árboles ductales infundidos mediante imágenes de microCT después del procedimiento. Debido al lapso de tiempo requerido para anestesiar, transferir, colocar y posicionar al animal para la obtención de imágenes, los agentes de contraste de difusión rápida que contienen yodo (iohexol) aprobados por la FDA o similares que contienen yodo no fueron adecuados para la visualización del árbol ductal en roedores ^6,8. Encontramos que los agentes de contraste basados en nanopartículas, especialmente aquellos que contienen nanocristales de óxido de tantalio, se difundieron más lentamente y fueron más adecuados para la visualización del árbol ductal en roedores 6,7,8,9. Sin embargo, esta confirmación a posteriori mediante imágenes de microCT no nos permite monitorear o controlar la cantidad de volumen infundido y se desvía de los procedimientos diagnósticos clínicamente establecidos, como la ductografía^10,11, para la visualización del árbol ductal. Por lo tanto, un paso clave para establecer la viabilidad técnica de traducir este procedimiento de identificación a humanos es demostrar la visualización de fluoroscopia en tiempo real del árbol ductal infundido en un modelo animal de tamaño y complejidad crecientes de sus glándulas mamarias. Este protocolo amplía este procedimiento ablativo de roedores ^4,5 a modelos de conejo. Evolutiva, anatómica y fisiológicamente, las glándulas mamarias de conejo son más similares a los senos humanos que a las de roedores u otros modelos animales grandes, como vacas y ovejas 12,13,14. Las conejas tienen cuatro pares de glándulas mamarias, cada una con cuatro árboles ductales, mientras que los roedores tienen solo un árbol ductal por glándula mamaria. Los pezones de conejo se pueden canular^15,16 utilizando un procedimiento similar a la administración de agente de contraste en la ductografía clínica en la primera investigación clínica en humanos. Por lo tanto, los conejos proporcionan un modelo intermedio práctico y relevante para la aplicación traslacional de este procedimiento ablativo de ID a los humanos. Este protocolo aborda los desafíos técnicos de la entrega de ID y la obtención de imágenes in vivo de un sistema de árbol multiductal que no podría haberse abordado en modelos de roedores. Este protocolo utiliza instrumentos, reactivos y materiales que son compatibles con la práctica clínica actual para la visualización de árboles ductales. Por lo tanto, el procedimiento descrito para la infusión guiada por fluoroscopia de una solución ablativa a base de etanol que contiene iohexol podría implementarse y evaluarse fácilmente en los primeros ensayos clínicos en humanos.

Este método se ha implementado en nuestro laboratorio para canular con éxito e infundir secuencialmente los cuatro árboles ductales de una o más glándulas mamarias en un conejo, en una sola sesión, con una solución ablativa a base de etanol que contiene un agente de contraste (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Este método consiste en infundir la solución ablativa directamente en la abertura canulada del pezón con una aguja de punta roma de 27 G de un conejo (virgen de 4 meses) en una mesa de fluoroscopia. Este procedimiento se realiza en un animal bajo anestesia general (isoflurano) con tratamiento antiinflamatorio peri y posterior al procedimiento (ketoprofeno, fármaco antiinflamatorio no esteroideo). Las imágenes de fluoroscopia nos permiten monitorear el llenado del árbol ductal en tiempo real, controlar la velocidad y la cantidad de volumen dispensado y / o determinar qué tan exitosa es la entrega de ID en cada sistema de árbol individual (Figuras 1, Figura 2, Figura 3). Esta técnica de fluoroscopia se aproxima más a la aplicación clínica prevista para la guía por imágenes del tratamiento ablativo y puede ayudar a limitar la dosis total de radiación impuesta al paciente. Este protocolo demuestra que Omnipaque (iohexol) aprobado por la FDA es un agente de contraste adecuado para visualizar el llenado inicial del árbol ductal de conejo (Figura 3). Las observaciones mediante examen macroscópico y análisis histológico muestran que una concentración de etanol del 70% causa daño tisular rápido dentro y fuera del árbol ductal y se extiende más allá de la estructura de la glándula mamaria (Figura 3). La concentración de etanol en el rango del 10-40% proporciona una ablación adecuada de las células epiteliales con menor daño tisular colateral que el etanol al 70% (Figura 4). Se requerirán estudios longitudinales que utilicen este procedimiento con el poder estadístico adecuado para el tamaño de grupo por solución ablativa y colecciones de tejido cronometradas para establecer parámetros óptimos de la solución ablativa para su evaluación clínica en pacientes humanos.

Protocolo

Todos los experimentos descritos se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan. Los conejos (Oryctolagus cuniculus) fueron atendidos de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la Ley de Bienestar Animal del USDA en una instalación acreditada por AAALAC.

NOTA: Este método se llevó a cabo en animales blancos de Nueva Zelanda vírgenes (nulíparos) y reproductores retirados (multíparos) de edades (4 meses a > 1 año) y peso (2,6 a 4,2 kg) adquiridos de fuentes comerciales. En nuestra experiencia, el tamaño del animal determinado por el peso es más confiable que la edad del animal para predecir el tamaño de los pezones. Generalmente, los animales que pesan más de 3,3 kg presentan pezones adecuados para la canulación. El protocolo que se describe a continuación se centra en animales vírgenes de 4-5 meses de edad y un peso superior a 3,3 kg, ya que son más apropiados para estudios de eficacia, cicatrización de heridas, toxicidad y seguridad a largo plazo.

1. Preparación preoperatoria

1. Aclimatar a los animales en las nuevas instalaciones durante al menos 1 semana a su llegada, especialmente para los animales destinados a procedimientos de recuperación y estudios a largo plazo. Durante esta primera semana, monitoree / revise a los conejos diariamente y suministre golosinas, enriquecimiento nutricional según lo recomendado por las pautas institucionales, para ayudar con el proceso de aclimatación.
2. Adquiera el conejo (~ 4 meses de edad New Zealand White) de la instalación de alojamiento aprobada. Registre el peso corporal antes del procedimiento.
   NOTA: El peso corporal se puede registrar el día antes del procedimiento para preparar los cálculos requeridos para la anestesia. También se pueden utilizar reproductores retirados (> 1 año de edad, > 3,5 kg) ya que tienen pezones más grandes y permiten una canulación más fácil de los conductos individuales (Figura 3). Por estas razones, los criadores retirados pueden utilizarse en experimentos iniciales para familiarizarse y optimizar el procedimiento intraductal.
3. Inyectar 35 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilacina por vía intramuscular 20 min antes de la administración de isoflurano para sedar al animal.
   NOTA: La anestesia se administra en función del peso del conejo y los rangos para cada fármaco son los siguientes: 15-35 mg/kg para la ketamina y 2-5 mg/kg para la xilacina. Asegúrese de que el animal esté sedado antes de pasar a la depilación y la intubación. Esto es para el bienestar y la seguridad de los animales y el personal. Después de la confirmación de la sedación, el conejo se puede colocar dorsalmente en la mesa de imágenes/operaciones.
4. Inyecte 5 mg / kg de ketoprofeno por vía subcutánea para analgesia después de que se muestren signos clínicos de sedación (es decir, comportamiento tranquilo y ojos parcialmente cerrados y de color rosado).
   NOTA: La analgesia se administra en función del peso del conejo y el rango de ketoprofeno es de 2-5 mg / kg.
5. Intubar al conejo con el equipo adecuado (p. ej., tubo endotraqueal o dispositivo de vía aérea supraglótica) y conectarlo a una máquina de isoflurano (1-2% de isoflurano, 1,0 L / min de oxígeno) que haya sido probada y certificada adecuadamente para anestesiar al conejo. Controle cuidadosamente la respiración del animal para asegurarse de que la anestesia se mantenga al 1-2% de isoflurano. Controle la saturación de oxígeno del conejo a través de SpO₂, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la temperatura durante todo el procedimiento.
   NOTA: El tamaño del tubo de intubación se basa en el peso y el tamaño del conejo. Sin embargo, el rango de tamaño no siempre es preciso, por lo que es útil tener una variedad de tamaños para ver cuál se adapta mejor a ese conejo en particular. También se puede utilizar una máscara nasal en lugar de un tubo endotraqueal con fines anestésicos¹⁷, teniendo en cuenta que esta máscara no proporciona protección de la vía aérea del animal proporcionada por la intubación. Las mantas de circulación de agua tibia (mantas térmicas) ajustadas a 37 ° C se colocan debajo de las toallas para mantener la temperatura corporal del conejo.
6. Coloque y asegure un catéter venoso de 25 G en la vena marginal del oído para permitir la administración de medicamentos de emergencia.
   NOTA: Se puede usar un rango de calibre de 24 a 26 dependiendo del tamaño de la vena de conejo.
7. Aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar la irritación ocular y la sequedad de la córnea.
8. Afeite el pelaje alrededor del segundo y tercer par de pezones con una maquinilla de afeitar eléctrica. Use un aplicador con punta de algodón para esparcir la crema depilatoria en el área de los pezones. Deje que la crema entre en contacto con el área durante 15 s.
   NOTA: Se debe tener mucho cuidado para no dañar los pezones con la maquinilla de afeitar. También se puede usar una aspiradora inalámbrica para ayudar a mantener limpia el área del procedimiento.
9. Humedezca una gasa con solución salina estéril y utilícela para enjuagar la crema y aflojar el pelaje del animal después de 15 s de aplicación de la crema depilatoria. Confirme una buena visibilidad y acceso al área de la tetina de donde se quitó el pelaje. Repita si es necesario.
   NOTA: La crema debe permanecer en el conejo durante el intervalo más corto posible, entre 10 y 30 s y retirarse por completo para evitar quemaduras químicas en la piel.

2. Infusión Intraductal

1. Prepare una solución ablativa mezclando los volúmenes adecuados de soluciones madre en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos BSL2.
   NOTA: El iohexol (350 mg de yodo/ml) debe almacenarse en un área oscura debido a la sensibilidad a la luz. Durante este experimento se utilizó un rango de concentraciones de EtOH. Para probar otros porcentajes de EtOH, diluya las soluciones madre a la concentración necesaria de solución ablativa. Para mantener la misma concentración de yodo en solución ablativa con diferentes porcentajes de EtOH, se puede usar PBS o agua estéril para llenar la diferencia de volumen.
2. Para este ejemplo, prepare una solución ablativa fresca de EtOH al 10%, 280 mg de yodo/ml de iohexol, colorante alimentario al 1% en un tubo de 5 ml. Para un volumen final de 5 ml, agregue 4 ml de caldo de iohexol (350 mg de yodo/ml), 500 μl de EtOH al 100% (prueba 200), 450 μl de PBS, 50 μl de colorante alimentario azul caldo.
   NOTA: Cada árbol ductal puede llenarse con hasta 400 μL, pero normalmente 250-350 μL para animales de menos de 3,5 kg. Se puede usar azul Evans de hasta un 0,2% en lugar de colorante alimentario. El azul de Evans puede ser una opción preferida si se realizan análisis de montaje completo u otros tejidos inmediatamente después de la infusión.
3. Retire cualquier piel muerta que cubra las aberturas ductales con pinzas puntiagudas finas.
   NOTA: Los conejos pueden tener un tapón queratinizado que sobresale del pezón que puede impedir una canulación exitosa si no se quita. La lidocaína tópica también se puede aplicar alrededor del pezón para ayudar a minimizar la irritación alrededor del lugar de la inyección (Tabla 1).
4. Limpie el sitio de infusión con gasas de clorhexidina.
   NOTA: La clorhexidina se usa como agente limpiador para desinfectar el lugar de la inyección antes de la canulación (Tabla 1).
5. Inserte el bisel de una aguja de 28 G (longitud: 12,7 mm) en el costado de la tetina e inyecte lentamente 200 μL de solución salina al 0,9% a una velocidad de 200 μL / min. Esto permite una mejor visualización de las aberturas ductales.
   NOTA: Es posible que no sea necesario inyectar todos los 200 μL de solución salina en el pezón; Suspenda la inyección una vez que vea que la solución salina sale de una o más aberturas ductales.
6. Aspire 1 ml de solución ablativa preparada con una jeringa Luer lock de 1 ml. Conecte la jeringa al extremo hembra "alado" de la línea de extensión macho-hembra de 12 pulgadas. Coloque con cuidado una aguja de punta roma de 27 G (longitud: 12,7 mm) en el extremo macho de la línea de extensión. Imprima la línea con la solución. Limpie la aguja con una gasa con alcohol. Además, tenga cuidado de no volcar la jeringa con la solución ablativa, ya que esto puede causar la formación de burbujas de aire.
   NOTA: Estos son volúmenes recomendados destinados a llenar completamente el árbol ductal: hasta 300 μL en cada árbol y hasta 1,2 mL por glándulas mamarias cervicales y/o inguinales (^1º y^4º pares), hasta 400 μL en cada árbol y hasta 1,6 mL por glándulas mamarias torácicas y/o abdominales (^2º y^3º pares). Para otras aplicaciones, puede ser apropiado utilizar volúmenes más pequeños o más grandes según los requisitos experimentales y / o la guía de fluoroscopia para evitar el llenado excesivo del árbol ductal. La línea de extensión permite un mayor control del caudal y la infusión simultánea y la obtención de imágenes de fluoroscopia en vivo. A modo de comparación, los volúmenes recomendados de infusión intraductal en modelos de ratón de 9 a 12 semanas de edad⁴ son: hasta 30 μL en glándulas mamarias cervicales e inguinales y hasta 50 μL en glándulas mamarias torácicas y abdominales, y modelos de rata⁵: hasta 100 μL en cervicales e inguinales y hasta 300 μL en glándulas mamarias torácicas y abdominales.
7. Use una lámpara de aumento de 10x para ayudar a ubicar las aberturas ductales. Sostenga suavemente la tetina con los dedos y canule la aguja en la abertura ductal. Continúe insertando suavemente la aguja de punta roma de 27 G hasta que la punta esté completamente dentro de la tetina. Para acomodar la aguja en la tetina, lleve la tetina hacia la aguja en lugar de empujar la aguja hacia abajo en la tetina. Tenga cuidado de seguir el camino de la abertura ductal.
   NOTA: En algunos conejos, es posible que sienta resistencia al intentar insertar la aguja en las aberturas de los pezones. Aplique con cuidado una ligera presión para atravesar la capa superior de células epiteliales. En nuestra experiencia, se requiere un dispositivo de aumento para identificar claramente la abertura ductal para la canulación. Puede ser una lámpara de aumento, una lente, una lupa o un dispositivo similar.
8. Infundir lentamente 300 μL de la solución a una velocidad constante de aproximadamente 200 μL/min una vez que la aguja esté completamente insertada. Espere 30 s después de la infusión para retirar la aguja del árbol canulado; Esto asegura que el volumen inyectado permanezca dentro del árbol ductal y reduce la probabilidad de fugas.
   NOTA: Por lo general, hay un investigador que canula y sostiene la aguja, mientras que un segundo investigador sostiene la jeringa y empuja el émbolo a la velocidad deseada. Se puede usar una bomba de jeringa para tener un caudal más controlado, ya que los cambios bruscos en la velocidad de infusión pueden estallar o dañar los árboles ductales.
9. Limpie cualquier solución derramada con una gasa humedecida o una toallita de EtOH para evitar la solución de contraste extraña en las imágenes.

3. Imágenes de fluoroscopia

1. Tome imágenes de fluoroscopia después de que se haya infundido cada árbol ductal. Los parámetros de la fluoroscopia son: 30 fps, 67 kV y 17,3 mA en un instrumento de rayos X de fluoroscopia. Sin embargo, ajústelos según el experimento y las necesidades de imágenes.
2. Utilice las imágenes de fluoroscopia para determinar si se requiere un volumen adicional para llenar completamente el árbol ductal.
   NOTA: Las imágenes de fluoroscopia pueden realizarse en vivo al mismo tiempo que la infusión de la solución ablativa. Se pueden usar pinzas de metal o plástico para sujetar el pezón mientras se realizan imágenes para proteger al personal de los rayos X dañinos. Esto permite monitorear el llenado de los árboles ductales. La fluoroscopia en vivo puede guiar cuándo detener la infusión en función del aumento de volumen en los extremos de los alvéolos. La fluoroscopia después de la infusión puede confirmar si el árbol ductal estaba completamente lleno o si había alguna fuga. Por lo general, se realiza una fluoroscopia confirmatoria después de la infusión de cada conducto dentro de la misma glándula mamaria.

4. Cuidados postoperatorios y recuperación

1. Suspenda el flujo de isoflurano después de la última infusión intraductal.
2. Inyectar 0,5 mg/kg de atipamezol por vía intramuscular.
   NOTA: El tiempo de recuperación varía entre los animales, pero el conejo debe comenzar a mostrar signos de recuperación 5-20 minutos después de la inyección.
3. Proporcione soporte térmico continuo al animal sobre una manta térmica hasta que se recupere por completo de la anestesia. Mantenga el flujo de oxígeno hasta por 5 minutos antes de retirarlo de la anestesia.
   NOTA: Los signos de recuperación incluyen movimientos de la boca como masticar, toser, espasmos nasales y / o movimientos oculares. Los conejos deben tener un reflejo de enderezamiento y ser capaces de mantenerse en posición esternal antes de volver a colocarlos en el portabebés. El agente de recuperación se administra en función del peso del conejo con un rango de 0,1-1 mg / kg de atipamezol.
4. Inyecte 5 mg/kg de ketoprofeno por vía subcutánea.
5. Retire el catéter intravenoso una vez que el conejo pueda mantenerse en posición esternal. Sostenga una gasa en el lugar donde se retiró el catéter para detener cualquier sangrado excesivo.
   NOTA: La extracción del catéter puede realizarse cuando el conejo está en el transportador.
6. Transporta al conejo de regreso a la instalación de alojamiento adecuada.
7. Continuar con las inyecciones de 5 mg/kg de ketoprofeno por vía subcutánea durante al menos 3 días después del procedimiento.
8. Controle al conejo para detectar signos de incomodidad, angustia, dolor y automutilación una vez al día durante al menos 3 días después del procedimiento. Si el conejo presenta alguno de estos signos clínicos, se puede extender el tratamiento con ketoprofeno. Registre y controle el peso corporal para evaluar si hay signos de anorexia.
   NOTA: El ketoprofeno se administra en función del peso del conejo con un rango de 2-5 mg / kg. Se puede administrar cada 24 h durante un máximo de 5 días después de la infusión intraductal para reducir la inflamación y minimizar las cicatrices. Para minimizar los eventos adversos de ulceración de la piel u otros problemas relacionados con la cicatrización de heridas, aplique lidocaína tópicamente en el lugar de la inyección. Cualquier animal que muestre signos persistentes de malestar, angustia, dolor o lesión después del tratamiento con ketoprofeno debe ser sacrificado.

5. Análisis de tejidos

1. Administrar solución de eutanasia (pentobarbital sódico y fenitoína sódica) por vía intravenosa a 100 mg/kg. Después de los 60 s, verifique si hay signos de vida pellizcando los dedos de los pies / orejas, signos de respiración o latidos cardíacos, reflejo corneal y / o estimulación de la pupila.
2. Realice una necropsia para obtener tejido de la glándula mamaria y procese para el procedimiento de inclusión de parafina de rutina después de 24-36 h en formalina¹⁸ tamponada neutra al 10%. Luego, realice la tinción estándar de hematoxilina y eosina (H&E) y/o la tinción inmunohistoquímica con un marcador específico del tipo de célula para ayudar en las lecturas de análisis deseadas¹⁸. Deseche el cadáver a través del protocolo de eliminación adecuado (por ejemplo, incineración).
3. Analizar los tejidos de las glándulas mamarias en consulta con un patólogo. Utilice un programa de software de computadora para ayudar en la cuantificación de la tasa de ablación y el daño tisular colateral.
   NOTA: El análisis de tejidos se realizó en conejos blancos de Nueva Zelanda de 4 meses de edad dentro de una hora después de las infusiones (Figura 4) con el software QuPath Open para el análisis de bioimágenes (https://qupath.github.io/). Este análisis se basa solo en tejidos teñidos con H&E. QuPath o un software informático similar, requiere la entrada y calibración de un patólogo. Algunas células pueden clasificarse erróneamente utilizando solo características morfológicas (Figura 4). El uso de marcadores específicos del tipo de célula como las citoqueratinas y la actina del músculo liso α se puede utilizar para mejorar la clasificación asistida por computadora⁶. En última instancia, el análisis de clasificación celular debe ser curado y validado por un patólogo.

Resultados

Cada una de las 8 glándulas mamarias de una coneja contiene 4 árboles ductales que se abren en orificios independientes de los pezones (Figura 2). Debido a la diferencia en el tamaño y el número de árboles ductales por glándula mamaria entre roedores (solo 1 conducto por glándula mamaria), los conejos son un buen modelo intermedio para la traducción humana. Podemos infundir hasta 400 μL de solución de EtOH al 10-70% para llenar todo el árbol ductal de cualquier glándula mamaria de conejos blancos de Nueva Zelanda de 4 meses de edad (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 ^4,8,9). Podemos infundir hasta 4 árboles ductales en hasta 8 glándulas mamarias con la solución ablativa en una sola sesión. Un diseño experimental típico consiste en infundir 2-3 árboles ductales dentro de una sola glándula mamaria en hasta 4 glándulas mamarias con una solución ablativa particular que contiene un agente de contraste de rayos X a base de yodo (Figura 2,  Figura 3). Para la solución ablativa que contiene iohexol (90-300 mg de yodo/ml), se realiza fluoroscopia durante y/o después de cada infusión para determinar el éxito individual de la infusión de cada árbol ductal con una cantidad parcial o total de solución infundida (Figura 2, Figura 3). La recolección del tejido de la glándula mamaria permite evaluar cómo los cambios en la formulación afectan la destrucción de las células epiteliales mamarias (Figura 4). Estos análisis de imágenes proporcionan información para comprender la solución más adecuada para lograr la máxima ablación y minimizar el daño tisular circundante. Determinamos que la solución de EtOH al 10% proporciona una tasa ablativa comparable a las soluciones ablativas que contienen un mayor porcentaje de EtOH (Figura 4).

Figura 1: Flujo de trabajo del procedimiento intraductal. Se resaltan los pasos clave del procedimiento de identificación. Por favor, vea el video para más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Pasos clave de la canulación intraductal y la infusión. (A) Inyección de solución salina perpendicular al pezón para dilatar las aberturas ductales para la canulación (vista del plano medio). (B) La canulación y el relleno de un árbol ductal (D1) se pueden rastrear con colorante azul en la solución ablativa (vista del plano medio). (C) Las imágenes de fluoroscopia en tiempo real ofrecen un monitoreo preciso y de alta resolución del relleno del árbol ductal (D1) con iohexol en la solución ablativa (vista del plano dorsal). Las aberturas de los árboles ductales están numeradas de izquierda a derecha, comenzando en el cuadrante superior (D1, cuadrante superior izquierdo) y terminando en el cuadrante inferior (D4, cuadrante inferior derecho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Tamaño de la tetina y administración exitosa de solución ablativa a múltiples conductos. Presentación típica de los tamaños de los pezones en conejos blancos de Nueva Zelanda. El tamaño de la tetina varía según el peso y la edad del conejo. Las glándulas mamarias están numeradas desde la parte superior izquierda (L1, cervical izquierda) hasta la parte inferior derecha (R8, inguinal derecha). Todas las imágenes se muestran en el plano dorsal. (A) Conejo virgen de 2,8 kg (arriba) con pezones más pequeños, difíciles de canular, conejo virgen de 3,5 kg (medio) con pezones adecuados para la canulación, y conejo multíparo de 4,1 kg (abajo) con pezones más grandes, mucho más fáciles de canular. (B) El colorante azul de los alimentos en la solución infundida puede usarse como evidencia in vivo de administración intraductal y llenado del árbol ductal. La infusión fallida se indica con un contorno rojo (administración de la almohadilla de grasa, arriba) y las infusiones exitosas con un contorno azul (administración intraductal, medio e inferior). Una solución de EtOH al 70% causa más daño a la piel (eritema) minutos después de la infusión (azul oscuro, panel central) en comparación con una solución al 10% (azul claro, panel inferior). (C) La fluoroscopia proporciona evidencia in vivo de administración intraductal. Infusión fallida (administración de la almohadilla de grasa, panel superior). Infusión secuencial exitosa del conducto D1 primero y el árbol ductal D2 segundo (panel inferior izquierdo). La fluoroscopia en vivo proporciona una guía de imágenes para el relleno (flechas blancas) del árbol ductal D3 (panel inferior derecho); También se ve la línea de extensión llena de solución ablativa que contiene iohexol y fórceps para sujetar el pezón. Las barras de escala corresponden a 1 cm en imágenes con diferentes aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis tisular de glándulas mamarias en conejos blancos de Nueva Zelanda después del procedimiento intraductal con solución ablativa a base de etanol. (A-B) Tinción representativa de H&E de una glándula mamaria inguinal derecha de un animal de 4 meses de edad sin tratamiento ablativo en comparación con una glándula mamaria inguinal derecha de otro animal con tratamiento ablativo de EtOH al 10%. Los cortes de tejido se cortan a lo largo del plano medio, por lo que D1 y D3 (árboles ductales izquierdos) se representan en las mismas secciones de tejido. La vista de tejido completo (A) y la vista de gran aumento (B) muestran los efectos morfológicos y cromáticos de la ablación de EtOH en la tinción de H&E (paneles superiores) y deducen las clases de células epiteliales y estromales basadas en un clasificador entrenado asistido por computadora (paneles inferiores). La barra de escala negra corresponde a 1 mm en A y la barra de escala blanca a 100 μm en B. (C) La barra gráfica muestra la distribución de clases de células en árboles ductales (n > 4 por grupo) tratados con diferentes concentraciones de EtOH o no tratados. Los asteriscos indican el valor p de la prueba t de Welch no apareada de cada clase de célula por grupo en comparación con su clase de célula coincidente en el grupo tratado con EtOH al 10% (* <0,05, ** < 0,01, **** <0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En nuestros estudios anteriores, hemos demostrado que una administración de ID de 70% de EtOH ablaciona las células epiteliales mamarias mientras causa un daño mínimo al tejido circundante en roedores ^6,7. En este procedimiento, hemos demostrado que una infusión de ID de una solución ablativa se puede escalar a un modelo de conejo. En particular, demostramos en este modelo más grande con un sistema de árbol multiductal que la infusión secuencial de todos los conductos dentro de una glándula mamaria se puede infundir con éxito. Esto representa la siguiente fase para traducir este procedimiento ablativo en una alternativa viable a la mastectomía profiláctica para la prevención primaria en individuos de alto riesgo.

El agente de contraste de rayos X a base de yodo aprobado por la FDA Omnipaque (iohexol) nos permite evaluar el éxito de la infusión, mediante la visualización en vivo del proceso de administración de la solución a través del árbol ductal. El uso de la fluoroscopia para visualizar la glándula mamaria infundida se corresponde estrechamente con lo que probablemente sean los equipos e instrumentos desplegados para llevar este procedimiento guiado por imágenes a la clínica^10,11. Esta modalidad de imagen nos permitirá saber cuándo cesar la infusión, lo que convierte a la fluoroscopia en vivo en un componente clave de la implementación clínica de este procedimiento ablativo. Establecimos la escalabilidad de este procedimiento de roedores a árboles ductales de conejos, pero se necesita más investigación para determinar el porcentaje de EtOH que mejor ablaciona las células epiteliales mamarias y minimiza el daño tisular circundante en este modelo animal más grande. Este protocolo se centró en la viabilidad de la infusión intraductal y el análisis de tejidos inmediatamente después del procedimiento. Las estrategias de solución de problemas y los consejos útiles se detallan en la Tabla 1. Si bien el enfoque principal de este protocolo es ofrecer soluciones ablativas basadas en etanol, este protocolo se puede utilizar en otras aplicaciones para administrar localmente otros reactivos de imagen, sistemas de modificación de genes como CRISPR / Cas9, vectores lentivirales, ARNip, factores de crecimiento y / o carcinógenos ^2,3 para estudiar otros aspectos del desarrollo de la glándula mamaria y la oncogénesis en conejos.

En conclusión, este protocolo proporciona las herramientas de investigación necesarias para realizar un estudio sistemático y longitudinal de los efectos locales y sistémicos de diferentes soluciones ablativas. Esta información determinará la seguridad de este procedimiento y señalará cualquier inquietud relacionada con el desarrollo posterior y la evaluación clínica en los primeros ensayos clínicos en humanos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lupa 10X con luz y abrazadera, cuello de cisne grande	Amazona	B0D982JCZ2	Para la visualización de los pezones
Jeringas de insulina Exel International	Fisher Scientific	14-841-31	Para inyección periductal de solución salina
Agujas romas a granel calibre 27 longitud 0.5	Tecnologías de infusión SAI	B27-50 100 a granel	Para canulación intraductal
Azul Evans	Sigma	E2129-50G	Para la visualización de la glándula mamaria
Sistema de imágenes de rayos X fluoroscópico	GE HealthCare	DT-C31-01	Para la adquisición de imágenes por fluroscopia
Manta térmica veterinaria HotDog	Perro caliente	WC71V	Para procedimiento intraductal/preparación preoperatoria
Líneas de extensión macho-hembra, longitud 12 pulgadas	Tecnologías de infusión SAI	EXT-12	Para el procedimiento intraductal
Omnipaque 500 ml (350 mg de yodo/ml)	GE Healthcare	0407-1414-72	Agente de contraste para visualización de rayos X (fluoroscopia)
Colorante alimentario azul estéril	Mccormick	930641	Para la visualización de la glándula mamaria
Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS)	ThermoFisher	14190250	Para la preparación de soluciones
Jeringas	BD	309659	Para infusión intraductal
Gel en V	Docsinnovent	D30001 - 30006	Para intubación (el número de catálogo depende del tamaño del V-gel)
Ketoprofeno	Covetrus	#005488	Para analgesia
ketamina	Covetrus	71069	Para analgesia
Lidocaína tópica	Covertus	70859	Para analgesia
xilacina	Covetrus	80907	Para anestesia
Euthasol	Covetrus	#009444	Para la eutanasia
lubricante ocular	Covetrus	75848	Para anestesia
atipamezol	Covetrus	82124	Para anestesia
Chips de plátano	Bio-Serv	#F7161	Para la aclimatación
Gemas de furia	Bio-Serv	#F5136-1	Para la aclimatación
Gotas de yogur	Bio-Serv	#F7200-1	Para la aclimatación