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Artículo de método

Restricción de animales no aversiva que permite el registro del reflejo optomotor en ardillas terrestres

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DOI:

10.3791/68335

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25 de julio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Retinal Neurophysiology Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 2Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, University of Murcia and Biomedical Research Institute of Murcia (IMIB-Pascual Parrilla), 3Striatech GmbH

En este artículo

Resumen

El protocolo describe cómo medir la respuesta optomotora en ardillas terrestres de 13 líneas, una especie dominante de cono con características retinianas que se asemejan a la mácula humana. El diseño de la plataforma mejora el manejo y reduce la ansiedad, mejorando la capacidad del animal para permanecer en la plataforma elevada, lo que permite una evaluación no invasiva de los cambios en la función visual.

Resumen

El reflejo optomotor (OMR) proporciona una evaluación conductual de la sensibilidad al contraste y la agudeza visual de un animal. Los ratones o las ratas generalmente se colocan directamente sobre una pequeña plataforma circular a mano; Sin embargo, manejar animales como este puede estimular el estrés y la ansiedad, lo que introduce factores de confusión al interpretar los datos. Se ha demostrado que los métodos de manipulación no aversivos, como recoger ratones o ratas en un túnel / tubo familiar, pueden reducir la ansiedad. Esto es de particular interés en estudios en los que los animales muestran un mayor estrés, hiperactividad o disfunción motora, lo que resulta en una incapacidad para permanecer en la plataforma. Un equipo dirigido por los Dres. Kiyoharu J. Miyagishima y Francisco M. Nadal-Nicolás ha rediseñado la plataforma OMR convencional para proporcionar una contención semicerrada. Esto hace posible por primera vez registrar el reflejo optomotor en la ardilla terrestre de 13 líneas, que es uno de los pocos mamíferos que puede ver el color. Tiene una raya visual con una alta densidad de conos similar a la mácula humana, lo que proporciona un modelo atractivo para estudiar los efectos en el sistema visual del cono.

Introducción

Las ardillas terrestres ofrecen un modelo único y valioso para estudiar la función visual debido a su estilo de vida diurno y retinas dominadas por conos, que imitan de cerca la visión humana1. Esto, junto con las ventajas prácticas de su uso (menor tamaño, menor costo de cría) en comparación con los primates, los convierte en un modelo ideal para la investigación traslacional de lesiones retinianas, enfermedades o efectos secundarios oculares de los medicamentos sobre los cambios en la visión del color 2,3,4,5,6. La investigación preclínica sobre enfermedades de la retina se basa en la capacidad de evaluar si un animal puede ver. El reflejo optomotor (OMR) ofrece un método clínicamente relevante para evaluar la función visual en animales sin necesidad de anestesia, lo que permite una medición precisa de la agudeza visual 7,8. En esta prueba, el animal sigue un patrón de rayas giratorias con la mirada. Las franjas giratorias inducen la percepción de movimiento global en el entorno, lo que desencadena un movimiento involuntario de la cabeza: el OMR. Este reflejo sirve para estabilizar visualmente el entorno y se puede utilizar para cuantificar qué tan bien puede ver un animal ajustando gradualmente la frecuencia espacial o el contraste del estímulo. A medida que el estímulo se vuelve más difícil de percibir, la OMR finalmente no se activa, lo que permite determinar la agudeza visual o el umbral de contraste. La ventaja del OMR es que es un reflejo. Por lo tanto, no se requiere capacitación y la fijación de la cabeza o la cirugía son innecesarias. El reflejo está presente incluso en animales muy jóvenes (al abrir los ojos)9,10, lo que permite estudiar enfermedades de inicio temprano. Además, dado que no es invasivo, se pueden realizar mediciones longitudinales que permiten el seguimiento de la progresión de la enfermedad.

La mayoría de las pruebas OMR se realizan utilizando sistemas personalizados o comerciales que consisten en una plataforma elevada donde se coloca al animal, rodeada por cuatro pantallas que muestran patrones de rayas blancas y negras giratorias. Las rayas se mueven en una dirección (en sentido horario o antihorario), creando un estímulo de movimiento que provoca una respuesta de seguimiento visual del animal 10,11,12,13,14,15,16. Se monta una cámara sobre la arena de prueba para capturar los movimientos de la cabeza evocados visualmente del animal en respuesta al estímulo giratorio. Estos movimientos de la cabeza se rastrean y analizan para determinar la capacidad del animal para percibir y responder al movimiento, evaluando así su agudeza visual.

Aunque el OMR se usa de forma rutinaria en ratones y ratas, la medición de la respuesta optomotora en ardillas terrestres de 13 líneas ha sido un desafío debido a su hiperactividad e incapacidad para permanecer en plataformas elevadas, incluso con acondicionamiento previo. Para evitar esto, desarrollamos una plataforma que proporciona semicontención, facilitando el traslado de los animales a la arena. El objetivo de este método es reducir el tiempo de adaptación de los animales al entorno experimental, permitiendo el registro de animales que muestran un comportamiento poco cooperativo o tienen dificultades para permanecer en la plataforma y mejorar la inclusión de animales en los estudios. También hemos definido un protocolo para medir la agudeza visual en ardillas utilizando una configuración de contraste definida experimentalmente y hemos ajustado la configuración de la cámara para mejorar los resultados de las imágenes, lo que permite el análisis y el seguimiento automatizados.

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Protocolo

Los procedimientos que involucran animales se llevaron a cabo de conformidad con las leyes de los Estados Unidos y las regulaciones del Departamento de Agricultura. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Animales y Cuidado y Uso del Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud. Las ardillas terrestres macho y hembra de 13 líneas (de 6 a 8 meses) utilizadas en este estudio se compraron en la colonia de ardillas Oshkosh de la Universidad de Wisconsin. Los ratones (rd10: 1 mes, CX3CR1GFP/+: 6,5 meses) utilizados en este estudio fueron criados en nuestro animalario. Los animales y sus jaulas fueron seleccionados al azar y asignados a grupos experimentales.

1. Preparación de la plataforma prototipo y túnel de manipulación modificado

NOTA: Las plataformas planas redondas se emplean comúnmente en sistemas diseñados para medir la respuesta optomotora13. Sin embargo, los modelos de roedores hiperactivos, como las ardillas, a menudo luchan por mantener la estabilidad en estas plataformas. Este diseño proporciona un espacio semicerrado, lo que ayuda a los animales a habituarse rápidamente y reduce los comportamientos similares a la ansiedad. Esta mejora mejora la capacidad del animal para concentrarse y minimiza los casos de desequilibrio o caídas durante las grabaciones.

  1. En el software de dibujo CAD (por ejemplo, OpenSCAD o FreeCAD), diseñe la plataforma (gris) y el recinto (rojo) como se muestra en la Figura 1.
    1. Asegúrese de que las dimensiones clave para la plataforma de ardilla se mantengan como la longitud y el ancho (largo x ancho): 129 mm x 81 mm, el grosor: 7 mm y la altura de la pared que se extiende alrededor del perímetro: 8 mm. Utilice el archivo de documento estándar CAD gratuito proporcionado para la plataforma prototipo (ardilla) utilizada en este estudio de prueba de concepto (Archivo de codificación complementario 1).
    2. Asegúrese de que las dimensiones clave de la carcasa superior extraíble (mirando de arriba hacia abajo) se mantengan como la longitud (119,5 cm) y la anchura (76,2 cm), la altura de los lados (50,8 mm) y el grosor de la pieza (3 mm). Utilice el archivo de documento estándar CAD gratuito proporcionado para replicar la carcasa superior extraíble (ardilla) empleada en este estudio de prueba de concepto (Archivo de codificación complementario 2).
  2. Ajuste el diámetro del orificio pasante en la base de la plataforma según sea necesario para que se ajuste al pedestal utilizado para elevar la plataforma. El diámetro de la imagen es de 40 mm.
  3. Imprime la plataforma con un filamento blanco opaco. Esto proporciona el máximo contraste para la cámara, lo que permite que el software de seguimiento detecte correctamente el contorno del animal en la plataforma.
  4. Imprima la carcasa superior extraíble con filamento oscuro opaco (por ejemplo, rojo). Esto proporciona una sensación de refugio para los roedores, lo que facilita guiarlos hacia el túnel antes de que sean levantados y transferidos a la arena.
  5. Haga que un maquinista corte el tubo cuadrado transparente extruido acrílico con una sierra de mesa para que el extremo largo tenga ~ 101,6 mm de longitud. Asegúrese de usar gafas protectoras y un palo de empuje para guiar el acrílico a través de la cuchilla mientras mantiene sus manos a salvo de posibles lesiones.
  6. Con la sierra de mesa o una herramienta rotativa de mano equipada con una rueda de corte abrasiva, retire una de las caras rectangulares largas. Esto crea una parte superior abierta a través de la cual la cámara montada arriba tendrá una vista sin obstáculos de la posición del animal y los movimientos de la cabeza.
  7. Limpie todos los bordes con una lima de mano o papel de lija. Ensamble el túnel de manipulación modificado utilizando el tubo cuadrado transparente extruido acrílico cortado a medida con el recinto superior extraíble impreso en 3D colocando el recinto encima de la cara abierta.

2. Configuración de la arena OMR

  1. Desinfecte la plataforma y el conjunto del recinto de tubo cuadrado con un limpiador / desinfectante antes y entre los animales para eliminar las señales olfativas no deseadas.
    NOTA: Si bien se utilizan guantes de cuero para manipular a los animales y entrar en contacto directo con ellos, no se usan durante las grabaciones y no causan ningún efecto de confusión duradero u observable.
  2. Rasgue un pequeño trozo de toalla de papel que mida aproximadamente 50 mm x 50 mm y dóblelo para cubrir la superficie superior del pedestal. Coloque la plataforma impresa en 3D sobre el pedestal (14 pulgadas de alto) con el trozo de toalla de papel en su lugar.
    NOTA: El papel ajusta el ajuste a presión de la plataforma, evita movimientos involuntarios, proporciona un fondo blanco uniforme para la obtención de imágenes (si la superficie del pedestal no es blanca) y actúa como una capa absorbente en caso de que el animal orine durante la grabación, evitando que la plataforma se vuelva resbaladiza.
  3. Con guantes de trabajo de cuero, guíe suavemente al animal hacia el conjunto del recinto de tubo cuadrado.
  4. Transfiera el animal a la arena colocando el conjunto del recinto en la plataforma (Figura 1J).
  5. Separe con cuidado el recinto superior extraíble dejando al animal en el tubo cuadrado transparente extruido acrílico en la plataforma. Cierre la puerta al sistema OMR

3. Configuración de los parámetros del software OMR

NOTA: El sistema OMR de la imagen utiliza una cámara industrial compacta con un sensor CMOS de 1/3" sensible a los infrarrojos con un obturador global a 25 fotogramas por segundo (fps). La cámara está equipada con una lente gran angular F1.6, lo que permite una vista completa de arriba hacia abajo de la arena. Las pruebas preliminares de agudeza visual realizadas en ardillas utilizando la configuración estándar de contraste del 100% revelaron que la agudeza visual de las ardillas excedía los límites de resolución del hardware. Las pantallas Full HD In-Plane Switching de 23,8" utilizadas en la configuración tienen una resolución de solo 1920 píxeles de ancho y, por lo tanto, el software está codificado con una frecuencia espacial máxima de 2 cyc/°. A modo de comparación, la agudeza visual de los ratones C57Bl/6 es de aproximadamente 0,3-0,5 cyc/°. A 2 cícticos/°, cada franja tiene un promedio de 5,3 píxeles de ancho. Con una velocidad de rotación de 12°/s y una velocidad de fotogramas de 60 fotogramas por segundo, el patrón cambia 0,2° por fotograma, lo que equivale a 4,2 píxeles por fotograma, suponiendo una velocidad de píxel uniforme. A frecuencias espaciales cercanas a 2 cyc/°, el patrón de bandas se acerca al límite de resolución donde puede ocurrir el aliasing, lo que hace que el patrón parezca que se está moviendo hacia atrás. Para evitar este artefacto, el software está codificado para limitar la frecuencia espacial a 2 cyc/°.

Así, para las ardillas ideamos un protocolo en el que realizamos la prueba de agudeza pero con un contraste mucho menor. Seleccionamos una configuración de contraste (12,78%) en la que las ardillas no pudieron ver el patrón de rayas a 2 ciclos / °.

  1. En el panel de video en vivo, asegúrese de que el animal se esté adaptando bien al nuevo entorno y comience a moverse menos y a calmarse.
    1. A 2 cícticos/°, cada franja tiene un promedio de 5,3 píxeles de ancho. Establezca la velocidad de rotación en 12 ° / s y una velocidad de fotogramas de 60 fotogramas por segundo; El patrón cambia 0,2° por fotograma, lo que equivale a 4,2 píxeles por fotograma, suponiendo una velocidad de píxel uniforme. Establezca las frecuencias espaciales cerca de 2 cyc/° para que el patrón de franjas se acerque al límite de resolución donde puede ocurrir el aliasing, lo que hace que el patrón parezca que se está moviendo hacia atrás. Para evitar este artefacto, codifique el software para limitar la frecuencia espacial a 2 cyc/°.
      NOTA: Para las ardillas, ideamos un protocolo en el que realizamos la prueba de agudeza pero con un contraste mucho menor. Seleccionamos una configuración de contraste (12,78%) en la que las ardillas no pudieron ver el patrón de rayas a 2 ciclos / °.
  2. Descargar archivo de codificación complementario 3. Abra el software OptoDrum.
  3. En la pestaña Configuración, haga clic en Configuración de importación. Cargue el archivo de codificación complementario 3.
  4. En la pestaña Configuración, establezca el Desplazamiento del umbral de fondo en 17, el tamaño mínimo del animal [px] en 30 y el ancho máximo de la cola [% del tamaño] en 1.
  5. En la configuración de la cámara, deje Invertir video y control manual de la cámara sin marcar y Luz IR apagada.
  6. Amplíe la posición y el tamaño de la región de interés para el seguimiento para acomodar a la ardilla si se inclina fuera de la abertura del tubo. Los valores sugeridos son Posición: X: 359, Y: 237, Tamaño: X: 570, Y: 455. No extienda el ROI sobre la pantalla de estímulos, ya que puede dar lugar a falsos positivos.
  7. Seleccione Configuración de sesión en el panel superior (Figura 2A).
    1. Para la escalera, establezca la agudeza espacial estimada de la siguiente manera. Establezca la agudeza esperada en 1.800 cyc / ° (648 ciclos); establecer la resolución óptima del estímulo en 0,5 cyc/° (180 ciclos); Establezca la resolución de medición en 0,100 Cyc/° (36 ciclos).
    2. Para la escalera, fije el número de confirmaciones necesarias de la siguiente manera. Establecer para ensayos fallidos a 3; establecer para pruebas exitosas a 2.
      NOTA: El número de ensayos exitosos se puede aumentar para reducir aún más la aparición de confirmaciones falsas positivas. Sin embargo, con el uso de esta plataforma y el túnel de manejo modificado, la tasa de error sigue siendo aceptablemente baja. Esto se debe principalmente a la relativa quietud de las ardillas y a la poca frecuencia de los movimientos rotacionales de la cabeza, aparte de los provocados por estímulos evocados visualmente.
  8. En la pestaña Escalera (Figura 2B), establece el suavizado de contorno en width en 3 px y deja sinusoidal sin marcar.
  9. Para los criterios de prueba, bloquee el contraste al 12,78% y bloquee la velocidad de rotación a 12 ° / s.
    NOTA: Con el ajuste de contraste del 12,78%, la agudeza espacial de las ardillas se limita a aproximadamente 1,5-1,8 cícticos/°. Esta configuración, que ya no supera la configuración máxima de hardware, permite evaluar la agudeza espacial en respuesta a enfermedades o lesiones.
  10. Una vez que dos de los tres parámetros estén bloqueados, la opción Establecer automáticamente los parámetros se activará (ya no estará atenuada). Marque la casilla junto a Configurar automáticamente los parámetros.
  11. Establezca la dirección de rotación dependiendo de si se espera que la discapacidad visual esté en uno o ambos ojos. Tenga en cuenta que para cada ojo, solo el movimiento en la dirección temporal a nasal provoca seguimiento. En consecuencia, evalúe la lesión del ojo izquierdo mediante la estimulación en el sentido de las agujas del reloj (CW), ya que se espera que la estimulación en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) provoque respuestas normales. Para la degeneración o lesión esperada en ambos ojos, se puede usar la rotación del estímulo en ambas direcciones.
  12. Haga clic en Iniciar prueba para comenzar la presentación del estímulo. La cámara de arriba comenzará a grabar y rastrear los movimientos de la cabeza de los animales. Mientras se presenta el estímulo, haga clic en la pestaña Análisis para ver en tiempo real los parámetros Velocidades angulares (rotación de la cabeza), Calidad de pista y Puntuación. Al final de cada presentación de estímulo, el software determinará automáticamente si avanzar (indicado por la marca de verificación verde) al siguiente Cyc/°, repetir la prueba o reducir el Cyc/° (indicado por la X roja).
  13. Durante la grabación, si el software de seguimiento voltea incorrectamente los marcadores de nariz (rojo) y cola (verde), presione Ctrl en el teclado para permitir la anulación manual para corregir la orientación cabeza-cola.
  14. Si el animal se cae de la plataforma, pausa la prueba presionando Pausar evaluación o haciendo clic en la barra espaciadora. Retire el túnel de manipulación de la plataforma y utilícelo con la tapa para manipular de forma segura al animal y volver a colocarlo en la plataforma. Una vez que el animal esté listo, haga clic en Reanudar evaluación para continuar con la prueba.
  15. Una vez que se hayan completado todas las pruebas, haga clic en la pestaña Resumen para mostrar las pruebas exitosas en verde y las pruebas fallidas en rojo. El ensayo marcado con un círculo verde indica el umbral de agudeza visual para la ardilla usando el contraste del 12,78%. Regrese al animal con cuidado a su jaula de origen.

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Resultados

OMR se considera exitoso una vez que el software identifica el umbral visual determinado por el rendimiento del animal en los ensayos de discriminación de frecuencia espacial. Específicamente, el umbral se define de la siguiente manera: dos ensayos exitosos a una frecuencia espacial dada (medida en cyc / °), seguidos de tres ensayos fallidos a la siguiente frecuencia espacial más alta. OMR se realizó en ardillas terrestres de 13 líneas (6-8 meses de edad) utilizando la plataforma plana redonda estándar (

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Discusión

Pasos críticos

Facilitar la entrada al túnel - Un punto importante a considerar es que las ardillas requieren que el conjunto del recinto impreso en 3D sirva como tapa temporal para el túnel rectangular acrílico; sin él, no entrarán fácilmente. En nuestras instalaciones, las ardillas terrestres de 13 líneas se alojan regularmente con un cilindro rojo del tamaño de una rata (Longitud: 15,24 cm, Diámetro: 7,62 cm). El propósito del recinto impre...

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Divulgaciones

Kiyoharu Miyagishima, Francisco Nadal-Nicolás, John Ball y Wei Li declaran no tener intereses financieros contrapuestos. Thomas Munch es el propietario y director de investigación y desarrollo de Striatech GmbH. Boris Benkner es el fundador y director ejecutivo de Striatech GmbH.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada [en parte] por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional del Ojo de los NIH. Este trabajo también fue apoyado por la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud y la Dirección de Investigación y Desarrollo de la Agencia de Salud de Defensa J9, a través del Programa de Investigación de la Visión bajo el Premio No. (CDMRPL-18-0-VR180205). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Los autores agradecen al Dr. Wenxin Ma por proporcionar los ratones rd10 y CX3CR1GFP/+ , al Dr. Haohua Qian (Visual Function Core, NEI, NIH) por su perspicaz discusión y asistencia técnica con el OMR, al taller de máquinas NIMH/NINDS/NICHD por su ayuda con la fabricación de componentes, y a Charles King (Biblioteca NIH) por ayudar en la impresión 3D.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de herramientas rotativas inalámbricas de iones de litio de 12 V máx.Dremel 8220F0138220JAPara cortar y pulir el tubo cuadrado acrílico.
https://www.dremel.com/us/en/p/8220-1-28-f0138220aa
6-0 RECUBRIMIENTO VICRYL (poliglactina 910) SuturaEthiconJ670GPara suturar el párpado.
https://www.ethicon.com/na/epc/code/j670g?lang=en-default
Tubo cuadrado de acrílico incoloro transparente (2" x 12")Centro de Plásticos del CanalRT-300161Túnel rectangular transparente (para ratón).
https://www.canalplastic.com/products/clear-colorless-acrylic-square-tube
Tubo cuadrado de acrílico incoloro transparente (3" x 12")Centro de Plásticos del CanalRT-300168Túnel rectangular transparente (para ardilla).
https://www.canalplastic.com/products/clear-colorless-acrylic-square-tube
DREMEL EZ SpeedClic: Discos de corte de plásticoDremelSC476Para cortar el tubo cuadrado acrílico
Impresora 3D F270EstratosisPara imprimir modelos 3D de grado de ingeniería de las plataformas.
https://support.stratasys.com/en/printers/fdm-legacy/uprint
Fluriso (Isoflurano)VetOne 502017Anestesia general. Líquido para inhalación.
http://vetone.net/Default/GetFile?id=7dda0c60-45fa-e711-bf2e-0024e8785118
FreeCAD 1.0 Modelador 3D paramétrico de código abierto
Software Igor Pro Versión 6.3.7.2WaveMetrics, IncPara trazar los gráficos. https://www.wavemetrics.com/
Mascarillas de anestesia de bajo perfil para vaporizadores tradicionales
  para SomnoFlo. Extra grande (animales de más de 300 g) 		Corporación científica KentSOMNO-0804Para proporcionar anestesia general.
https://www.kentscientific.com/products/low-profile-anesthesia-masks-for-somnosuite/
MakerBot Print para Windows versión 4.10.1.2056Industrias MakerBot, LLCSoftware para orientar las piezas para imprimir
Impresora 3D de escritorio MakerBot Replicator (5.ª generación)Industrias MakerBot, LLCMP05825Para versiones prototipo de impresión 3D de las plataformas.
https://www.rnd-tech.com/product/makerbot-replicator-desktop-3d-printer-5th-gen/
Microsoft ExcelMicrosoftSoftware de hoja de cálculo para analizar los datos. microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Guantes de trabajo de cuero multiusosIndustrias SteinerSPC02Para manejar ardillas.
https://www.steinerindustries.com/leather-palm/product/steiner-spc02-leather-palm-work-glove
OptoDrum PlusESTRÍA. TECNOLOGÍADispositivo comercial para medir el reflejo optomotor (agudeza visual y sensibilidad al contraste) https://stria.tech/products/optodrum/ 
Software OptoDrum Versión 1.7.3ESTRÍA. TECNOLOGÍASoftware para realizar medidas automatizadas del reflejo optomotor.
Peroxigard Listo para usar (limpiador/desinfectante) PeroxigardPRTU242101Para limpiar/desinfectar la plataforma y el tubo cuadrado de acrílico entre experimentos.
https://peroxigard.com/product-information/rtu/
Máquina de anestesia Pureline M6000
con concentrador de O2		Suministro veterinario Penn, Inc.SUPM6000Para anestesia animal.
https://www.pennvet.com/customer/portal/catalog/home?urile=wcm:path%3APennVet+Catalog/Product+Catalog/SUPM6000/Pureline+M6000+Anesthesia+Mach+w_O2+Conc
Impresora 3D uPrint SE PlusEstratosisPara imprimir modelos 3D de grado de ingeniería de las plataformas.
https://www.makerbot.com/makerbot-print/
Filamento PLA MakerBot opaco blanco,
carrete grande para Replicator+ (0,9 kg, 2 lb)		Industrias MakerBot, LLCMP05780Filamento para imprimir en 3D las plataformas.
https://store.ultimaker.com/3d-printer-materials/replicator-series-materials/makerbot-pla-material-large-spool-for-replicator
Tratamiento farmacológico
Sulfatos de neomicina y polimixina B
y ungüento oftálmico de bacitracina y zinc, USP		Bausch & LombRX-0069Antibiótico oftálmico triple para la prevención de infecciones oculares
Clorhidrato de proparacaína 0.5%Akorn17478-263-12Anestésico local para la instilación oftálmica

Referencias

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