Artículo de método

Herramienta reutilizable de imagen hepática: Una herramienta reutilizable impresa en 3D para microscopía intravital hepática

DOI:

10.3791/68337

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17 de marzo de 2026

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1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

En este artículo

Resumen

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Este protocolo introduce una herramienta de imagen hepática reutilizable (RHIT) de última generación para la microscopía intravital (IVM) de ratones vivos, que mejora la estabilidad tisular para experimentos rápidos y agudos. El diseño impreso en 3D del RHIT ofrece producción, escalabilidad y versatilidad rentables, permitiendo una observación prolongada de los procesos metabólicos en ratones de diversos tamaños.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La función y disfunción hepática pueden evaluarse visualizando directamente los procesos dinámicos del hígado mediante microscopía intravital confocal (IVM). En particular, se puede lograr una excelente precisión espacial y temporal en la extracción tanto de información cualitativa como cuantitativa. En el ámbito del microscopio, mantener las condiciones fisiológicas del tejido mientras se logra estabilidad y repetibilidad sigue siendo un reto. El aumento del peso y del contenido lipídico hepático tiene un efecto perjudicial en este proceso en modelos animales de diabetes tipo II (DT2) y enfermedad hepática grasa no alcohólica (MAFLD). Para superar estas limitaciones, hemos creado RHIT, un diseño revolucionario de instrumento de imagen que mejora el acceso y la estabilidad de los tejidos. RHIT es un dispositivo de imagen hepática reutilizable y escalable fabricado mediante impresión 3D en un método eficiente de un solo paso. Sus dimensiones pueden modificarse para adaptarse a ratones de diferentes tamaños. En resumen, el RHIT es un aparato impreso en 3D para posicionar y estabilizar animales de laboratorio durante microscopía hepática intravital, utilizado tras una breve preparación quirúrgica para minimizar el manejo, el estrés y la variabilidad. Su diseño reutilizable y estandarizado es fácil de producir y personalizar, soportando una variedad de tamaños y posibles diseños experimentales. Los resultados iniciales demuestran una mejora notable en la estabilidad y fiabilidad de la imagen intravital hepática, permitiendo la visualización detallada de estructuras subcelulares, como las gotas lipídicas. Esta mayor precisión facilita estudios metabólicos y fisiológicos con mayor claridad, reproducibilidad y potencial para diseños longitudinales. El protocolo ofrece un enfoque estandarizado y accesible que aborda desafíos técnicos de larga duración en la MIV hepática.

Introducción

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La microscopía intravital es una herramienta poderosa para visualizar dinámicamente procesos biológicos in vivo 1,2,3, en contraste con la histología tradicional de inmunofluorescencia con imágenes fijas de tejidos o células vivas y análisis de citometría de flujo de células aisladas. Para la inspección hepática, se ha utilizado la MIV para examinar la secreción y flujobiliar 4,5, la movilización deglucosa 6,7, las células no parenquimales 8,9,10 y las enfermedades hepáticas11,12. Además, en lo que respecta a la investigación de la acumulación de lipídios, la IVM permite información en tiempo real sobre la dinámica de la formación, crecimiento y degradación de gotas lipídicas en tejidos vivos, como la visualización y cuantificación de gotas lipídicas a alta resolución espacial, y la correlación directa de la acumulación de gotas lipídicas con otros procesos celulares yfisiológicos 13. A pesar de estas ventajas, la MIV sigue siendo técnicamente desafiante: requiere equipos especializados y conocimientos, puede causar daños en los tejidos, alterar el comportamiento celular y exigir procedimientos invasivos. Los estudios tradicionales in vivoo que se basan en la observación conductual, el monitoreo fisiológico y el análisis genético proporcionan información valiosa, pero carecen de la resolución espacial y temporal que ofrece la microscopía intravital.

El primer gran desafío con la IVM es controlar la inestabilidad de los artefactos causada por el latido cardíaco y la respiración del animal inspeccionado, lo que puede comprometer la calidad de la imagen, resultando en imágenes oscurecidas o distorsionadas de los procesos biológicosobservados 15. Los intentos de corregir esto mediante procesamiento de imágenes a menudo resultan en la pérdida de información espacial y temporal importante o en la exigencia de equipos quirúrgicos avanzados y mantenimiento16,17. En segundo lugar, los modelos murinos para estudios de enfermedades hepáticas, como la MAFLD y la DT2, suelen ser obesos y, por tanto, más difíciles de estabilizar debido a su mayor tamaño y contenido de lípidostisulares 16,18. En modelos de ratón obesos con NAFLD y T2D, el aumento de masa corporal plantea desafíos mecánicos para la imagen intravital al superar la capacidad de carga de las etapas estándar del microscopio y complicar la estabilizaciónanimal 19. Este peso añadido aumenta el riesgo de artefactos de movimiento y compresión de tejidos, ambos los cuales perjudican la precisión de imagen20.

Simultáneamente, un contenido elevado de lípidos hepáticos incrementa la opacidad tisular y la dispersión de la luz, lo que degrada la resolución y el contraste de la imagen. Estos efectos suelen verse agravados por comorbilidades metabólicas como perfusión alterada e inflamación, reduciendo aún más la distribución del contraste y la claridadde la señal 21. Por último, puede ser difícil y dificultar la repetibilidad mantener una temperatura corporal estable durante la imagen para sostener la fisiología tisular y las actividades biológicas. Además, una posición estable del hígado en el escenario del microscopio durante la MIV es crucial para evitar el estrés mecánico o dañostisulares 7. Exponer el tejido hepático es un procedimiento delicado que requiere precisión técnica para evitar sangrados graves y daños por parénquimahepático 7. Para reducir los artefactos de movimiento, la caja torácica del ratón se levantaba previamente del escenario del microscopio usando cartón, permitiendo que la gravedad arrastrara el hígado lejos del resto delcuerpo 22. Aunque este enfoque ha demostrado ser eficaz para producir datos cuantificables, el material de cartón es insostenible porque pierde forma y es difícil de limpiar. Además, es difícil cambiar las dimensiones del inserto de cartón para adaptarse a modelos de ratones obesos.

En los últimos años, han surgido varias técnicas avanzadas de microscopía intravital hepática, incluyendo la microscopía de campo de luz de barrido y sistemas ópticos mejorados computacionalmente, que han demostrado mejoras en la resolución espaciotemporal23, la fototoxicidadreducida 24, una mayor profundidad de imagen25,26 y la supresión de artefactosde movimiento 27. Estos avances, como demuestran estudiosrecientes 28,29,30, representan un importante avance tecnológico en el campo. Este artículo presenta la Herramienta Reutilizable de Imagen Hepática (RHIT), una herramienta innovadora para la MIV del hígado murino. RHIT contribuye a este panorama en evolución ofreciendo una herramienta escalable y reutilizable que mejora la estabilidad mecánica y la accesibilidad de los tejidos en diversos modelos animales, incluidos aquellos con enfermedades metabólicas. Su diseño aborda los desafíos persistentes del movimiento, la variabilidad y la complexidad de la configuración integrando el ajuste anatómico, la reproducibilidad de las etapas y la facilidad de uso. La compatibilidad de RHIT con modalidades de imagen convencionales y avanzadas amplía la utilidad de estas técnicas emergentes, promoviendo una imagen hepática intravital fiable y fisiológicamente estable.

Aunque se han propuesto varios enfoques para estabilizar el tejido durante la IVM, como una ventana quirúrgica 9,31,32,33,34,35,36 y acrílico ensamblado a medida en etapa 6,37, estos métodos también introducen numerosas limitaciones y complejidades en cuanto a escalabilidad, reproducibilidad y habilidades quirúrgicas. En comparación, RHIT es funcionalmente distinto en su propósito y diseño. No depende de la compresión directa ni del embedding a base degel 38. En cambio, RHIT funciona como una herramienta escalable, reutilizable y anatómicamente contorneada que apoya el aislamiento hepático mediante la posición gravitatoria, manteniendo la orientación fisiológica sin restringir ni distorsionar el tejido. De manera crítica, RHIT mejora la reproducibilidad de los datos, la fidelidad de imagen y la consistencia de procedimientos en una amplia variedad de tamaños de ratón. Elimina la necesidad de geles, adhesivos o interfaces quirúrgicas complejas, mientras simplifica la alineación de los tejidos y el control de la temperatura. Además, RHIT es una herramienta especializada que conecta la interfaz entre el animal y el microscopio, diseñada para ayudar tanto con el apoyo fisiológico como con la precisión de imagen.

RHIT aborda directamente los desafíos mecánicos y ópticos de modelos metabólicamente comprometidos a través de su geometría escalable, que acomoda tamaños animales mayores mientras distribuye el peso de manera uniforme para minimizar la inestabilidad de la plataforma. La apertura hepática retraída estabiliza el tejido mediante gravedad sin fuerza de compresión, permitiendo un acceso constante y reduciendo el movimiento durante la imagen. Su diseño reutilizable y químicamente inerte garantiza compatibilidad con tejidos biológicos y favorece la reutilización higiénica. Al permitir una colocación consistente, minimizar artefactos de movimiento y mantener la integridad de los tejidos, RHIT supone un avance fundamental en los flujos de trabajo de microscopía intravital. Su adaptabilidad y disponibilidad de código abierto promueven aún más una amplia utilidad en laboratorios y modelos animales, estableciendo un nuevo estándar para herramientas de imagen que soportan tanto la muestra como el sistema de imagen.

Además, las etapas de microscopio calefactado disponibles comercialmente pueden requerir montajes avanzados ymanipulación de microscopios 39. No son escalables al espécimen y, en general, son más caros, lo que los hace menos accesibles para muchos investigadores. Por tanto, un inserto escalable reutilizable es importante para estandarizar la IVM en diferentes modelos animales. La tecnología impresa en 3D, también conocida como fabricación aditiva, se ha vuelto cada vez más popular en los laboratorioscientíficos 40, transformando los protocolos de laboratorios de bioquímica, física y biología. Para la MIV, la tecnología 3D se ha utilizado para fabricar ventanas ópticas de imagenligeras 41,42, mejorar la accesibilidad detejidos 43 y facilitar la reparación y reconstrucción detejidos 44. Así, una herramienta personalizada para la estabilización de tejidos, que, hasta donde sabemos, no ha sido descrita, representa una excelente oportunidad para emplear la impresión 3D y superar algunos de los desafíos de la FIV hepática.

RHIT se crea utilizando un método de impresión 3D de un solo paso y mejora sustancialmente la estabilización tisular durante un periodo prolongado. El RHIT es muy accesible y adecuado para experimentos agudos de MIV que requieren mínima experiencia quirúrgica. Además, el RHIT es fácilmente escalable al tamaño de los animales y tiene un bajo coste de producción. Finalmente, demostramos que RHIT permite una imagen de fluorescencia en lapso de tiempo estable y mejora la estabilidad tisular en comparación con el inserto de cartón utilizado anteriormente. RHIT simplifica la IVM de la homeostasis lipídica hepática sin contacto directo ni impacto medible en condiciones fisiológicas. En consecuencia, RHIT presenta una ventaja competitiva como una contribución acelerada, reutilizable y adaptable aIVM 34,36,45.

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Figura 1: Diseño RHIT. (A) Diseño y dimensiones de un RHIT de 3,0 mm escalado para un ratón obeso. La vista de la cara (izquierda) muestra las dimensiones, la posición y el tamaño de la apertura del tejido, así como la orientación del ratón durante la imagen. La vista lateral (derecha) incluye dimensiones e indica la posición de la almohadilla térmica y el inserto de la sonda de temperatura. Los parámetros de escalado para diferentes tamaños de ratón se proporcionan en la Tabla 1. (B) Vista enface 3D de RHIT generada a partir del archivo STL de código abierto, mostrando dónde se inserta el cable rectal de la sonda a través del puerto personalizado (etiquetadas dimensiones de inserción rectal de la sonda que se muestran arriba a la derecha). (C) Montaje técnico de RHIT que muestra la integración del dispositivo de calefacción y los insertos estructurales personalizados para varios tamaños RHIT, el cable se inserta en el inserto rectal de la sonda para acceder a la sonda de temperatura. Abreviatura: RHIT = Herramienta Reutilizable de Imagen Hepática. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

RHIT fue diseñado originalmente como un conjunto de una sola pieza utilizando ABS (Estireno de Butadieno-Acrilonitrilo), un polímero termoplástico ampliamente utilizado en la modelización de impresión 3D45 por deposición fusionada. El ABS ofrece varias ventajas para esta aplicación: es ligero, resistente al calor (punto de fusión ~200 °C) y tiene buena resistencia al impacto 46,47,48. El diseño de RHIT aprovecha la densidad ajustable del ABS, permitiéndole absorber movimientos fisiológicos como el latido cardíaco y la respiración. El aumento de la densidad de relleno mejora la amortiguación del movimiento, lo que resulta en una mayor estabilidad de imagen y una mejor calidad de imagen.

El RHIT está diseñado para absorber el movimiento mediante ajustes a la densidad de un material químicamente inerte como el ABS. En este contexto, densidad se refiere específicamente al porcentaje de relleno interno utilizado durante la impresión 3D, que afecta a la rigidez y capacidad de la plataforma para amortiguarvibraciones 49,50,51. Se ha observado que aumentar la densidad del ABS reduce la transmisión de movimiento causada por el latido cardíaco y la respiración, lo que resulta en una plataforma estable para la imagen y mejora de la calidad de imagen. Probamos constructos RHIT con diferentes densidades internas de relleno (20-100%) y observamos cualitativamente que configuraciones de mayor densidad conducían a una reducción visible de artefactos de movimiento durante la imagen intravital hepática en ratones. No se realizó cuantificación formal, ya que la configuración de alta densidad resultó suficientemente robusta y eficaz en todos los tamaños de RHIT probados, y proporcionó un rendimiento fiable de forma constante bajo condiciones de imagen rutinarias. Para la mayoría de los usuarios, esta densidad por defecto será adecuada sin más ajustes. Sin embargo, para experimentos que requieren características mecánicas específicas, se pueden modificar la densidad de relleno y los parámetros de diseño, y se han proporcionado instrucciones completas de impresión 3D para apoyar dicha personalización.

Se pueden utilizar materiales alternativos para la impresión; sin embargo, el ABS es el material preferido para la fabricación de RHIT, ya que ofrece varias ventajas clave. Es químicamente inerte, minimizando el riesgo de interacción con tejidos o fluidos corporales, e insoluble en agua, lo que permite una limpieza, almacenamiento y reutilización eficientes. Estas propiedades hacen del ABS una opción fiable y duradera para uso experimental. Cuando el acceso a una impresora de modelado por deposición fusionada es limitado, se pueden utilizar otras técnicas y materiales de impresión 3D. La estereolitografía, la sinterización selectiva por láser y la fusión multichorro son opciones adecuadas con materiales como nailon, resinas fotopoliméricas o polvos compuestos. El nailon proporciona durabilidad y flexibilidad, mientras que las resinas estereolitómicas ofrecen alta resolución para aplicaciones que requieren detalles estructurales finos. El diseño RHIT puede adaptarse fácilmente a las tolerancias y restricciones de diferentes materiales, lo que lo hace compatible con una variedad de plataformas de impresión. Los usuarios deben seleccionar materiales en función de la estabilidad mecánica, la biocompatibilidad, la compatibilidad con los flujos de trabajo de imagen y los recursos de impresión disponibles.

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Protocolo

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Todos los estudios con animales se llevaron a cabo en las instalaciones veterinarias de los Institutos Nacionales de Salud en cumplimiento de las directrices y protocolos autorizados por el Comité de Ética para Experimentos con Animales (protocolo nº LCMB-037). Todo el personal debe recibir una formación adecuada antes de proceder con los siguientes protocolos. El manejo de animales se realizó cumpliendo con las directrices institucionales.

El protocolo RHIT describe la preparación de Herramientas de Imagen Hepática Reutilizables (RHITs) para su uso en experimentos de microscopía intravital (IVM). Los procedimientos experimentales se realizan en una sala de microscopio esterilizada, o capucha, e implican una serie de pasos: primero, la impresión del RHIT, la anestesia y el marcado fluorescente del ratón, luego la instalación del microscopio, después el procedimiento quirúrgico y finalmente la aplicación de una FIV asistida por RHIT. La Figura 1 y la Figura 2 ilustran los componentes necesarios para obtener imágenes de muestras vivas utilizando un microscopio confocal, que incluyen un insertometálico 5,6,7 (adaptador de microscopio para la imagen de muestras vivas) para la colocación de la RHIT, así como RHIT para su uso en esteatosis avanzada o controlada. Para analizar el sistema, se obtuvieron machos C57BL/6J Mus musculus de entre 6 y 10 semanas y se les alimentó con una dieta estándar o occidental durante 8-10 semanas antes del experimento.

1. Diseño de RHIT con modificaciones

  1. Para recrear RHIT, utiliza software de diseño de productos 3D (véase la Tabla de Materiales). Abre el software de diseño y crea una nueva pieza estándar. Guarda el archivo con una descripción adecuada.
  2. Crea el boceto de RHIT en el plano frontal usando la función Crear Boceto 2D .
    1. Haz clic en el icono del rectángulo y coloca la esquina inferior izquierda en el origen del plano del boceto.
    2. Dibuja un segundo rectángulo dentro del primero para representar la ventana de imagen de RHIT.
    3. Añade dimensiones a ambos rectángulos usando la característica Dimensiones , asegurando que todas las longitudes y anchos estén referenciados al origen y entre sí.
    4. Ajusta las dimensiones del RHIT según el tamaño del ratón.
    5. Añade grosor a RHIT seleccionando solo el rectángulo exterior y haciendo clic en extruida. Cuando aparezca una ventana emergente, selecciona el boceto usando la herramienta Extrusión para dejar una abertura en el centro.
    6. Selecciona la cara inferior del RHIT extruido y comienza un nuevo boceto 2D usando la función Start 2D Sketch .
  3. Dibuja un rectángulo para definir el bolsillo de la almohadilla térmica. Aplica las dimensiones adquiridas usando la característica de Dimensión .
    1. Sal del boceto 2D y realiza una extracción de material usando la herramienta Cut Extrude para crear una cavidad profunda para la almohadilla térmica.
  4. Inicia un nuevo boceto para la sonda de temperatura en la misma cara que la cavidad. Haz clic en iniciar un boceto 2D y selecciona el icono del círculo . Coloca el círculo sobre la superficie plana y dimensiona en consecuencia. Sal del modo boceto .
    1. Haz clic en extrusión y selecciona el boceto del círculo. En modoextrusión , haz clic en extrusión cortada y espera a que aparezca una ventana emergente con una opción de paso para eliminar material. Haz clic en OK. Salir del modo extrusión .
    2. Añade filetes en los bordes de la ventana haciendo clic en el icono del filete y seleccionando los ocho bordes afilados. Añade el tamaño del filete y sale del modo filete .
      NOTA: Si se desea una absorción adicional de movimiento, los usuarios pueden aumentar la densidad interna de relleno durante la preparación de impresión 3D.
  5. Prepara el modelo para la impresión 3D navegando a la pestaña de entorno y seleccionando la pestaña Impresión 3D.
    1. Utiliza la función de Establecer orientación para asegurarte de que el modelo queda tumbado plano sobre la cama de impresión y no orientado verticalmente.
    2. Haz clic en Opciones de impresión para configurar la configuración de la unidad y ajustar la escala si es necesario.
    3. Guarda el modelo finalizado. Formato STL usando la función de exportación STL .
    4. Sal de la pestaña de entorno y haz clic en guardar para guardar RHIT como una parte sólida.
  6. Cierra el programa de diseño.
    NOTA: Asegúrese de que la impresora sea compatible con el archivo . Formato de archivo STL o convertir al formato adecuado según lo requiera el software de impresora 3D.

2. Subir e imprimir RHIT desde archivos STL

  1. Importa el archivo .stl de la Figura 1A o Archivo Suplementario 1 al software de diseño asistido por ordenador (CAD) 3D haciendo clic en Importar y seleccionando el archivo .stl. Haz clic en el botón Preparar para cortar el modelo en capas finas para impresión 3D.
  2. Selecciona la impresora comercial 3D adecuada y haz clic en Imprimir. Luego, monitoriza el progreso de la impresión y, una vez completada, retira y limpia el objeto impreso en 3D según sea necesario.
Tamaño del ratónPeso corporal del ratón (g)Grosor RHIT (mm)Tamaño de ventana de imagen L x W (mm)
Pequeña (S)17-201.517 x 17
Medium (M)22-252.521 x 21
Grande (L)35-40326 x 26

Tabla 1: Escalando el tamaño del ratón a RHIT. El peso del ratón se escala al grosor de la RHIT, donde un peso superior a 30 g (punta de flecha) corresponde al mayor RHIT (3,0 mm). El ratón más ligero corresponde al RHIT más delgado, y los ratones obesos están representados por el RHIT más grueso. Estas dimensiones pueden ajustarse en software CAD. La longitud y apertura de imagen de la RHIT pueden variar según la ubicación del órgano de la muestra utilizada; longitud constante y apertura de imagen para los tres RHITS fueron adecuadas para este estudio. Abreviaturas: RHIT = Herramienta Reutilizable de Imagen Hepática; CAD = diseño asistido por ordenador.

3. Preparación del microscopio y uso del RHIT

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Figura 2: Metraje intravenosa del hígado usando la técnica RHIT. (A) Esquema del montaje del microscopio confocal invertido con un ratón anestesiado. (B) Se utilizaba un adaptador metálico de microscopio (inserto) para posicionar el ratón en el escenario del microscopio para la imagen en vivo. (C) El RHIT impreso en 3D se utilizó con una tira de gasa para manipular fácilmente el parénquima hepático. (D) Imagen del hígado pre-exteriorizado antes de la posición RHIT. El cono nasal se utilizó para anestesia antes y durante la cirugía. (E) Imagen del hígado exteriorizado antes de la posición de RHIT durante un procedimiento agudo. No era necesario afeitarse. (F) Imagen del ratón invertido en la posición final boca abajo en el RHIT para la imagen. (G) RHIT fijado firmemente a la etapa del microscopio. (H) Un ratón colocado en RHIT y un adaptador metálico. (I) Los ratones magros (flecha azul) y obesos (flecha verde) mostrados con los insertos RHIT escamados respectivos en J-L representan imágenes anatómicas macroscópicas del hígado obeso y magro (respectivamente). La IVM de alta resolución toma imágenes M,N del hígado de ratones obesos y magros marcados con BODIPY (verde, representado por una flecha rosa) para marcar gotas lipídicas y Hoechst 33342 (blanco, representado por una flecha cian) para marcar núcleos, respectivamente. Abreviaturas: RHIT = Herramienta Reutilizable de Imagen Hepática; IVM = microscopía intravital. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

  1. Prepara un microscopio confocal invertido convencional para la MIV hepática como se muestra en la Figura 2.
    1. Inserta un adaptador de escenario para acomodar la muestra. Para seguir este protocolo, utiliza un inserto metálico hecho a medida con una abertura circular de 35 mm y un tapa de 40 mm.
    2. Limpia a fondo ambos lados del vidrio de la cubierta antes y después de cada imagen, usando etanol al 70% según sea necesario.
  2. Fija el RHIT adecuado según el tamaño del ratón (Tabla 1) con cinta (opcional) alineando la apertura del RHIT con la lente objetivo y paralelo sobre el desliz de imagen (Figura 2G) en el inserto metálico con cinta sobre el cristal de la cubierta.
  3. Elige un objetivo para la imagen basado en el tamaño del área, la resolución espacial y el tiempo de imagen, como un objetivo de agua de 25x/0,95.
    NOTA: Aunque una mayor ampliación mejora la resolución, también incrementa la probabilidad de que aparezcan artefactos de movimiento.
    1. Nivela el objetivo cerca del cristal de la tapa.
  4. Sujeta una tira de gasa (aproximadamente 1 x 8 cm, Figura 2C,D) a través de la ventana RHIT con cinta adhesiva para ayudar a posicionar el tejido y separarlo de otros órganos abdominales (Figura 2C).
  5. Precalienta la RHIT usando una almohadilla térmica insertada en la ranura y asegura la sonda de calor junto a la RHIT (Figura 2G,H) para mantener la temperatura corporal del ratón durante la imagen.

4. Marcado fluorescente y anestesia del ratón

  1. Reduce el estrés del ratón desinfectando la cámara de inducción anestésica para eliminar cualquier último rastro de hedor animal.
  2. Enciende el condensador de oxígeno, un sistema de protección ambiental (EPS) y el vaporizador de isoflurano.
  3. Coloque al ratón en la cámara de inducción y anestesie usando isoflurano al 2-3% durante aproximadamente 3-5 minutos, o hasta que el animal muestre una respiración estable y pérdida de los reflejos de enderezamiento y pedal.
    1. Una vez anestesiado, transfiere al ratón a la almohadilla térmica y mantenga la anestesia utilizando isoflurano al 1-2% administrado a través del cono nasal (Figura 2D), ajustando según sea necesario para asegurar un plano quirúrgico estable durante todo el procedimiento.
    2. Evalúa la profundidad de la anestesia realizando una prueba de pellizco en el dedo del pie para observar cualquier movimiento voluntario.
  4. Para marcar estructuras ricas en lípidos, inyectar 200 nmol de BODIPY 665/676 diluido en PBS (volumen total 200 μL) a través de la vena caudal usando una jeringuilla de insulina de 31 G.
    1. Para una señal óptima, administra BODIPY una vez al día durante 2 días consecutivos antes de la imagen. Deja al menos 3-4 horas después de la segunda inyección para asegurar la eliminación sistémica del fondo y la estabilización de la señal tisular.
  5. Para proporcionar contraste nuclear, inyecta Hoechst 33342 (2 μg/g de peso corporal) diluido en 1x solución de heparina (preparada mezclando 120 μL de heparina con 180 μL de suero para obtener 400 U/mL) a través del seno retroorbital usando una jeringuilla de insulina de 31 G.
    NOTA: Hoechst se administra por separado para evitar precipitaciones cuando se mezcla con otros tintes.
  6. Para visualizar la vasculatura, inyecta 18 μg/g de peso corporal de dextrán fluorescente (70 kDa) diluido en la misma solución de heparina 1x descrita en el Paso 4.5, a través del seno retroorbitario contralateral usando una jeringuilla de insulina de 31 G (Tabla 2).
    NOTA: La heparina se incluye para reducir la formación de coágulos y promover un flujo sanguíneo constante durante la imagen.
  7. Espera 10-15 minutos después de las inyecciones de Hoechst y dextrán antes de empezar la cirugía y la imagen.
Reportero fluorescentePropósitoDosis por peso (o concentración)
Hoechst 33342Núcleos de tinte2 μg/g: suplementar el volumen del inyectante a 50 μl con solución de heparina
Carrocería 665/676Gotas lipídicas de tinte0,8 μg/g: suplementar el volumen del inyectante a 200 μl en solución salina
2M tetrametil rodamina-dextrán (Dextran)Vasculatura de tintes18 μg/g: suplementar el volumen del inyectante a 50 μl con solución de heparina

Tabla 2: Opciones de reporteros fluorescentes. Esta tabla ofrece una descripción detallada de los métodos utilizados para etiquetar tejidos de ratón para la imagen in vivo. La solución de heparina se prepara primero y luego se utiliza para preparar las soluciones DAPI-heparina ydextran-heparina 7. Hoechst 33342 se inyecta retroorbitalmente en un ojo, mientras que BODIPY se inyecta directamente en la vena caudal 2-3 días antes, con una concentración mayor en ratones obesos. Dextrano se inyecta retroorbitalmente en el otro ojo. Es importante realizar inyecciones retroorbitales por separado en cada ojo. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol.

5. Intervención quirúrgica de ratón

  1. Afeita el pelaje abdominal usando una máquina de cortar pelo y/o crema depilatoria. Elimina los residuos de pelo y usa etanol al 70% para limpiar la piel expuesta.
    NOTA: Dependiendo de los requisitos institucionales de la IACUC, se puede utilizar una dosis alterna de betadina y etanol para asegurar la preparación adecuada del sitio quirúrgico.
  2. Reevalúa la profundidad de la anestesia antes de la cirugía.
  3. Exponer el hígado realizando una incisión horizontal en forma de media luna de 2-3 cm bajo la caja torácica con tijeras quirúrgicas desde el xifoides, terminando en el lado lateral izquierdo de la parte superior del abdomen.
  4. Tras la incisión inicial, haz cuidadosamente una incisión secundaria más pequeña en la capa muscular para exponer el lóbulo izquierdo del hígado, cauteriza (opcional) según sea necesario para evitar sangrado (Figura 2E).
    1. Evita daños por calor al hígado mientras usas el cauterizador colocando una gasa empapada en suero entre el hígado y la capa muscular para absorber el calor que emana la capa muscular.
    2. Evita cualquier sangrado excesivo, traumatismos quirúrgicos o mecánicos, o compresión externa.
  5. Una vez expuesto el hígado, transfiere el ratón a la etapa de microscopio.

6. Colocación del ratón en el escenario del microscopio

  1. Coloca el abdomen del ratón anestesiado hacia abajo sobre la plataforma RHIT del microscopio.
    1. Ajusta el cono nasal para que el ratón permanezca bajo anestesia.
    2. Emplea un aplicador con punta de algodón humedecido con solución salina para maniobrar delicadamente el lóbulo lateral izquierdo del hígado contra la cubierta mientras se aplica una presión externa suave sobre la cavidad torácica.
      NOTA: Aprovecha la gravedad para maniobrar cuidadosamente el hígado hacia fuera y sobre el cristal de la cubierta.
    3. Utiliza una tira de gasa para separar suavemente el hígado del cuerpo del ratón (Figura 2E-H).
  2. Revisa de nuevo el cono nasal para asegurarte de que el ratón permanece bajo anestesia durante la imagen.
  3. Previene la deshidratación de los tejidos aplicando un gel a base de agua alrededor de los bordes de la cavidad expuesta y evitando el contacto directo con la almohadilla térmica.
    NOTA: El mantenimiento de la temperatura y la humedad también puede ser facilitado por un microscopio con una cámara de humedadcerrada 5,6,7.
  4. Aplica pomada oftálmica en los ojos para evitar el resecamiento corneal.
  5. Configurar una IVM en time-lapse para comenzar a hacer imágenes 7,52.
    1. Abrir obturadores láser, evaluar el marcado fluorescente e identificar una región estable de interés con un flujo sanguíneo notable. Seleccione parámetros apropiados de adquisición de imagen, incluyendo formato de imagen, velocidad de adquisición, intervalos de imagen, duración total de adquisición y promedio línea/fotograma (512 × 512 píxeles; 1-5 fotogramas s⁻¹ por región; intervalos de imagen de 5-30 s; tiempo total de adquisición de 5-20 minutos; promedio línea/fotograma de 2-8, dependiendo de los requisitos experimentales). Optimiza la exposición al flash de fluorescencia para acomodar los fluoróforos utilizados.
    2. Define los límites superior e inferior para las pilas Z seleccionando la pila Z en el panel de adquisición , ajustando los planos focales superior e inferior usando los controles de posición Z, y confirmando el rango con Poner Primero/Poner Último; luego inicia la grabación en lapso de tiempo haciendo clic en Iniciar experimento (o Iniciar Adquisición Inicial). Al concluir la imagen, sacrificar al animal conforme a los protocolos institucionales de cuidado animal y uso aprobados por el comité.

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Figura 3: Medición de la mejora de la estabilidad hepática de la MIV en RHIT con SSIM. MIV hepática del lóbulo hepático izquierdo inferior bajo tres condiciones de estabilización: (A) sin inserción (NINGUNA), (B) inserción de cartón y (C) RHIT. Los tejidos están marcados con BODIPY (magenta, lípidos), Hoechst 33342 (verde, núcleos) y Dextran (cian, vasculatura); los paneles A y B muestran distorsión visible y artefactos de movimiento, mientras que C muestra mayor claridad con RHIT. (D) Se calculó el índice de similitud estructural (SSIM) para cuantificar la estabilidad de la imagen. Las barras muestran la media ± SEM, y cada punto de color representa una réplica biológica individual: RHIT (n = 14), Cartón (n = 10), Sin Inserto (n = 8). Estos grupos son subconjuntos extraídos de la cohorte experimental global de aproximadamente 50-70 ratones. Solo las sesiones que cumplían criterios de imagen específicos (por ejemplo, alineación consistente de los fotogramas y calidad de imagen) se analizaban mediante SSIM. RHIT produjo consistentemente valores SSIM más altos (media 0,511 ± SEM), lo que indica una mejor estabilidad y resolución en condiciones de imagen. Barras de escala = 15 μm. Se muestran imágenes representativas; SSIM refleja sesiones de IVM en serie sin daño o alteración tisular observable. Abreviaturas: RHIT = Herramienta Reutilizable de Imagen Hepática; IVM = microscopía intravital; SSIM = índice de similitud estructural; CARD = inserción de cartón. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Resultados

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RHIT fue diseñado utilizando una aplicación CAD (Figura 1). Las dimensiones de RHIT se ajustan para acomodar ratones pequeños, medianos y pesados (Tabla 1). El diseño RHIT consiste en un material plano de ABS de 107,50 mm de longitud con una apertura posicionada para permitir la imagen hepática. La MIV se realizó en condiciones óptimas (RHIT) y subóptimas (sin inserción ni cartón) (véase la Figura 3A-C

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Discusión

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La microscopía intravital hepática ha sido ampliamente estudiada, sin embargo, los métodos previos suelen requerir procedimientos quirúrgicos altamente invasivos y no estandarizados para la imagen terminalestabilizada 5,6,7,9,31,32. El movimiento es, posiblemente, la barrera más desafiante qu...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., el Instituto Nacional del Cáncer y la biblioteca del NIH. H. Sánchez Cornejo agradece a la Agencia Peruana CONCYTEC su apoyo financiero a través de la subvención núm. PE501087367-2024-PROCIENCIA. Queremos agradecer a los miembros del laboratorio Porat-Shliom y a los colaboradores del grupo de Física Cuántica de la Universidad de Cambridge por la lectura crítica, al personal de la biblioteca de los NIH y a Geneti Gaga por la asistencia técnica. La imagen renderizada en 3D de la Figura 2A fue creada usando Biorender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cinta de enmascarador de ½-inchCinta de enmascaramiento 3M de uso general:b40069428
Cubiertas de 40 mmBioptech40-1313-03191
70% (v/v) de etanolThermo Fisher ScientificBP2818-470% etanol en volumen y 30% agua por volumen
Máquina de anestesia: AMD-3 PlusSomniAMD-17106
Gel de transmisión de ultrasonidos Aquasonic 100Laboratorios Parker  01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932Véase la Tabla 2
Software CAD (Autodesk Inventor o equivalente) Autodesk (software CAD representativo)N/DSoftware
Sistema de cauterisGéminisGEM 5917
Desinfectante ClidoxLaboratorios de Investigación Farmacéutica Inc.VWR, MSPP-96118F
Microscopio confocal (Leica SP8 o equivalente)LeicaSP8
Aplicadores con punta de algodónProductos médicos puritanos25-806 1WC
Inserto de platino de aluminio hecho a medida (3 mm de grosor, depresión de 35 mm)N/AN/A
FORANO (isoflurano, USP) líquido para inhalación, 250 mLBaxter10019-360-60
Máquina de cortar pelo (opcional)Onyx Fine InstrumentsASWRHC
Almohadilla térmica con sonda rectalInstrumentos Científicos de la ALAALMOHADILLA TÉRMICA-1/2
Heparina sodio, 1000 USP U/mLHikma0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249Véase la Tabla 2
Alfombrilla térmica para ratónInstrumentos Científicos de la ALAALMOHADILLA TÉRMICA-1/2
Mus musculusEl Laboratorio JacksonC57BL/6Ratón de laboratorio
Suero fisiológico normal (0,9% cloruro de sodio)Thermo Fisher Scientific7210-16
RHIT (Herramienta Reutilizable de Imagen Hepática) tamaño aplicableProporcionadoN/AVéase Tabla 1
Pinzas quirúrgicas, punta curvaHerramientas Científicas Fines11251-23
Gasa quirúrgicaMckesson6939
Tijeras quirúrgicasHerramientas Científicas Fines14001-14
Tetrametilrodamina DextránThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139Véase la Tabla 2
Jeringuillas de insulina Ultra Fine U-100, 31 gBetty MillsBD326730

Referencias

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