Biosensores codificados genéticamente basados en fluoróforos para imágenes de fluorescencia radiométrica en microbios

Resumen

Este protocolo describe la aplicación de biosensores codificados genéticamente basados en fluoróforos en microbios para imágenes de fluorescencia radiométricas cuantitativas en condiciones controladas. Al integrar estas estrategias de biodetección con técnicas avanzadas de imagen, el método permite un análisis de alta resolución y en tiempo real a nivel de una sola célula, proporcionando información más profunda sobre la dinámica de moléculas pequeñas.

Resumen

La investigación de la dinámica de moléculas pequeñas dentro de los microbios es esencial para estudios exhaustivos de la función microbiana. Tanto la dinámica de moléculas pequeñas dentro del organismo como entre organismos juega un papel fundamental en la fisiología microbiana, la simbiosis y la enfermedad. Sin embargo, el monitoreo de estas dinámicas sigue siendo un gran desafío utilizando la mayoría de las técnicas existentes. Los biosensores codificados genéticamente basados en fluoróforos son herramientas poderosas para rastrear la dinámica de moléculas pequeñas in vivo y tienen un alto potencial para impulsar nuevos descubrimientos. Estos biosensores se utilizan más comúnmente en imágenes de fluorescencia, a menudo en combinación con dispositivos de perfusión que permiten un control preciso de las condiciones ambientales. Cuando se integra con técnicas avanzadas de imagen, este enfoque proporciona datos de alta resolución, resueltos espacial y temporalmente, lo que permite comprender las respuestas microbianas de una sola célula. A pesar de su promesa, la implementación de tales biosensores sigue siendo un desafío técnico. Comprender los pasos clave es crucial para una adopción más amplia. Aquí, presentamos un protocolo diseñado para respaldar el despliegue efectivo de biosensores de nueva ingeniería en microbios para imágenes de fluorescencia radiométricas cuantitativas en condiciones controladas.

Introducción

Los biosensores basados en la intensidad de un solo fluoróforo y de doble fluoróforo son ampliamente utilizados por los investigadores para una variedad de aplicaciones¹. Algunos estudios han empleado análisis de biosensores multiplex para rastrear simultáneamente múltiples señales dentro de las mismas células². Muchos de estos biosensores se basan en dominios de unión a ligandos, donde los eventos de unión inducen cambios conformacionales que alteran las propiedades de fluorescencia ^3,4. Los biosensores codificados genéticamente....

Protocolo

1. Diseño racional de biosensores radiométricos (Figura 1)

NOTA: La proteína de unión de interés se selecciona como dominio sensorial en función de criterios relevantes, que incluyen (i) especificidad, (ii) afinidad, (iii) información estructural y (iv) reordenamiento de conformación tras la unión del ligando. La especificidad garantiza que el biosensor responda selectivamente a la molécula diana sin reactividad cruzada. Se considera que la afinidad se alinea con el rango de concentración esperado de la molécula diana en el contexto biológico. La....

Resultados

Para lograr una imagen radiométrica exitosa de biosensores en sistemas microbianos, se deben abordar varios desafíos técnicos.

Sistema de expresión: El primer desafío radica en la selección del sistema de expresión; ya sea basado en plásmidos, cromosómicamente integrado, impulsado por promotores constitutivos o inducibles, y con o sin etiquetas de orientación subcelular. Estos factores pueden afectar significativamente la estabilidad, toxicidad y localización del biosensor dentro de las célula.......

Discusión

Los biosensores basados en fluoróforos codificados genéticamente permiten el monitoreo en tiempo real de las concentraciones de analitos intracelulares en células vivas¹. Estos biosensores suelen funcionar convirtiendo los cambios conformacionales en señales ópticas, que pueden detectarse de forma radiométrica o intensiométrica. Los biosensores intensiométricos se basan en los cambios de intensidad de fluorescencia de un solo FP, lo que los hace sensibles a las va.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
Placa CellASIC ONIX para células de levadura haploides	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-glucosa	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	Para la expresión de GA-MatryoshCaMP6s en levadura
TCS SP8 STED	Leica	NA
Cepa de levadura K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-Mating Factor acetato sal	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG