Biosensores codificados genéticamente basados en fluoróforos para imágenes de fluorescencia radiométrica en microbios

Resumen

Este protocolo describe la aplicación de biosensores codificados genéticamente basados en fluoróforos en microbios para imágenes de fluorescencia radiométricas cuantitativas en condiciones controladas. Al integrar estas estrategias de biodetección con técnicas avanzadas de imagen, el método permite un análisis de alta resolución y en tiempo real a nivel de una sola célula, proporcionando información más profunda sobre la dinámica de moléculas pequeñas.

Resumen

La investigación de la dinámica de moléculas pequeñas dentro de los microbios es esencial para estudios exhaustivos de la función microbiana. Tanto la dinámica de moléculas pequeñas dentro del organismo como entre organismos juega un papel fundamental en la fisiología microbiana, la simbiosis y la enfermedad. Sin embargo, el monitoreo de estas dinámicas sigue siendo un gran desafío utilizando la mayoría de las técnicas existentes. Los biosensores codificados genéticamente basados en fluoróforos son herramientas poderosas para rastrear la dinámica de moléculas pequeñas in vivo y tienen un alto potencial para impulsar nuevos descubrimientos. Estos biosensores se utilizan más comúnmente en imágenes de fluorescencia, a menudo en combinación con dispositivos de perfusión que permiten un control preciso de las condiciones ambientales. Cuando se integra con técnicas avanzadas de imagen, este enfoque proporciona datos de alta resolución, resueltos espacial y temporalmente, lo que permite comprender las respuestas microbianas de una sola célula. A pesar de su promesa, la implementación de tales biosensores sigue siendo un desafío técnico. Comprender los pasos clave es crucial para una adopción más amplia. Aquí, presentamos un protocolo diseñado para respaldar el despliegue efectivo de biosensores de nueva ingeniería en microbios para imágenes de fluorescencia radiométricas cuantitativas en condiciones controladas.

Introducción

Los biosensores basados en la intensidad de un solo fluoróforo y de doble fluoróforo son ampliamente utilizados por los investigadores para una variedad de aplicaciones¹. Algunos estudios han empleado análisis de biosensores multiplex para rastrear simultáneamente múltiples señales dentro de las mismas células². Muchos de estos biosensores se basan en dominios de unión a ligandos, donde los eventos de unión inducen cambios conformacionales que alteran las propiedades de fluorescencia ^3,4. Los biosensores codificados genéticamente se han convertido en herramientas esenciales para la obtención de imágenes in vivo en una amplia gama de sistemas⁵, lo que permite la monitorización de alta resolución de los niveles de iones y metabolitos en el espacio y el tiempo¹. Sin embargo, los primeros biosensores estaban limitados en rango dinámico y relación señal-ruido (SNR)⁶. Los avances recientes en biosensores intensiométricos de fluoróforo único basados en proteínas fluorescentes conformacionalmente sensibles (csFP) han mejorado significativamente el rendimiento. No obstante, las variaciones en los niveles de expresión de proteínas pueden afectar las mediciones in vivo utilizando biosensores basados en fluoróforos codificados genéticamente⁶, que se emplean comúnmente para visualizar moléculas de señalización y metabolitos en células vivas ^7,8. Los biosensores intensiométricos de un solo fluoróforo no permiten la normalización de los niveles de expresión del biosensor, que pueden fluctuar in vivo. Sin embargo, la incorporación de una proteína fluorescente de referencia puede convertir los biosensores de un solo fluoróforo en versiones radiométricas de doble fluoróforo, lo que permite cuantificaciones más confiables⁹. Debido a la pérdida de energía de los procesos no radiativos, el espectro de emisión fluorescente se desplaza en relación con el espectro de absorción, un fenómeno conocido como el desplazamiento de Stokes¹⁰. La proteína fluorescente de desplazamiento de Stokes grande (LSSFP) se ha empleado como fluoróforos de referencia óptimos en biosensores radiométricos de fluoróforos duales ^9,11. Un avance reciente es el desarrollo de biosensores monocromáticos de Matryoshka Green-Apple (GA), conocidos como GA-MatryoshCaMP6s, que incorporan un LSSFP rojo, llamado LSSmApple¹². Cuando se combinan con microdispositivos como los sistemas microfluídicos, los biosensores codificados genéticamente basados en fluoróforos ofrecen un enfoque mínimamente invasivo para la obtención de imágenes radiométricas cuantitativas utilizando técnicas como la microscopía confocal. Esta integración permite obtener imágenes de alta velocidad y monitorear en tiempo real la dinámica de moléculas pequeñas en células individuales bajo estrés ambiental. Por ejemplo, los biosensores de cAMP y glucosa se han aplicado con éxito en levaduras. Cuando se utilizan junto con cepas mutantes, estos biosensores han ayudado a dilucidar las redes reguladoras clave que rigen la absorción de azúcar^13,14. A pesar de los avances significativos, estas tecnologías aún no han alcanzado su máximo potencial para investigar cuestiones biológicas críticas que involucran la dinámica de moléculas pequeñas in vivo¹⁵. Como resultado, su adopción generalizada en todos los laboratorios sigue siendo limitada y aún faltan metodologías estandarizadas para una implementación más amplia.

En comparación con las metodologías tradicionales que se basan en biosensores no radiométricos de un solo fluoróforo o mediciones a nivel de volumen, nuestro protocolo basado en biosensores GA Matryoshka permite obtener imágenes unicelulares de alta resolución con análisis radiométrico cuantitativo. Al integrar el gran fluoróforo de desplazamiento de Stokes como referencia interna, el método compensa la variabilidad en la expresión del biosensor, una limitación clave de los diseños anteriores. Además, la combinación con dispositivos microfluídicos permite un control preciso de las condiciones ambientales, ofreciendo una mejora sobre las cámaras de perfusión convencionales o los sistemas de cultivo estático¹². Este enfoque también proporciona claras ventajas para estudiar las interacciones dinámicas entre los microbios y sus huéspedes, como las interacciones planta-patógeno y las asociaciones simbióticas como las micorrizas, donde la resolución espacial y temporal a nivel celular es esencial para descubrir los mecanismos moleculares de comunicación e intercambio de nutrientes.

En este contexto, presentamos un protocolo detallado paso a paso para la obtención de imágenes biosensoriales radiométricas en microbios. Aunque está específicamente optimizado para la implementación en levaduras, este protocolo puede adaptarse para su uso en otros microbios, incluidas las bacterias, y extenderse a organismos no modelo, como los microbios asociados a las plantas. Por ejemplo, los biosensores se pueden usar junto con sistemas microfluídicos para obtener imágenes cuantitativas de fluorescencia de la señalización de calcio en levaduras, lo que permite el monitoreo en tiempo real de las respuestas de calcio bajo estrés ambiental¹⁴.

Este protocolo tiene como objetivo guiar a los investigadores en el despliegue efectivo de biosensores de nuevo diseño, avanzando así en la exploración de procesos biológicos a través de imágenes fluorescentes basadas en biosensores en sistemas microbianos. Incluye recomendaciones prácticas sobre las condiciones de cultivo de levadura, los ajustes óptimos de excitación/emisión y la compatibilidad con las cepas de levadura de uso común (por ejemplo, K601 y W303-1A MAT-a). Las limitaciones notables incluyen el fotoblanqueo durante sesiones de imágenes prolongadas y los desafíos relacionados con la expresión del biosensor en muestras biológicas. Dado que numerosos factores pueden influir en el resultado de los experimentos de imágenes de biosensores in vivo , este protocolo paso a paso también tiene como objetivo ayudar a los investigadores a anticipar y superar posibles desafíos, facilitando así implementaciones reproducibles.

Protocolo

1. Diseño racional de biosensores radiométricos (Figura 1)

NOTA: La proteína de unión de interés se selecciona como dominio sensorial en función de criterios relevantes, que incluyen (i) especificidad, (ii) afinidad, (iii) información estructural y (iv) reordenamiento de conformación tras la unión del ligando. La especificidad garantiza que el biosensor responda selectivamente a la molécula diana sin reactividad cruzada. Se considera que la afinidad se alinea con el rango de concentración esperado de la molécula diana en el contexto biológico. La información estructural, derivada de datos experimentales o modelos computacionales como los generados por AlphaFold, proporciona información sobre la organización tridimensional del dominio sensorial y los cambios conformacionales inducidos por ligandos. Estos conocimientos se utilizan para identificar puntos de inserción adecuados para los fluoróforos. A continuación, se desarrolla una estrategia de validación para evaluar la capacidad de respuesta y el rango dinámico del biosensor, en función de las aplicaciones previstas.

1. Construya el diseño de Matryoshka in silico insertando el casete Green-Apple Matryoshka¹² en el dominio sensorial de tal manera que la proteína fluorescente verde permutada circularmente (cpGFP), que es sensible a los cambios conformacionales, responda a los reordenamientos inducidos por la unión al ligando del dominio sensorial.
   1. Utilice software de visualización molecular, como Chimera, para analizar la estructura del dominio de unión. Si la estructura tridimensional no está disponible, utilice AlphaFold para generar un modelo fiable.
   2. Identifique bucles flexibles dentro de la estructura de la proteína como puntos débiles y posibles sitios de inserción para el casete de doble fluoróforo, elegidos para evitar interrumpir la función o estabilidad general de la proteína.
   3. Utilice AlphaFold nuevamente para predecir la estructura de la proteína quimérica que contiene el casete FP dual insertado, confirmando que la inserción no introduce cambios estructurales desfavorables.
   4. Clone las construcciones del biosensor en ADN plásmido que permite la expresión en células de levadura. Específicamente, inserte el gen que codifica el biosensor de nuevo diseño en el vector lanzadera de levadura pAG416, que contiene elementos apropiados para la expresión de levadura, utilizando una técnica de clonación adecuada 12,13,14.
   5. Después de la clonación, transforme el plásmido recombinante en células bacterianas para la amplificación del ADN plásmido. Utilice ADN plasmídico purificado para la transformación de levaduras.
   6. Introducir el plásmido purificado en células de levadura a través de la transformación mediada por polietilenglicol (PEG) como se publicó¹⁶. Células de levadura transformadas en placa en medios deficientes en uracilo, que seleccionan clones positivos que contienen el plásmido que lleva el marcador de selección URA3.

2. Preparación de la muestra

1. Transformantes de levadura rayados que expresan biosensores GA-Matryoshka en placas de medio selectivo (es decir, SC-Ura) e incuban a 30 °C durante 2-3 días para permitir el crecimiento de la colonia.
   NOTA: La cepa de levadura porta una auxotrofia ura3, que se complementa con el gen URA3 en el plásmido, lo que permite la selección en medios deficientes en uracilo. El plásmido que codifica el biosensor incluye un casete que complementa la auxotrofia (p. ej., pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
2. Generar transformadores de levadura a partir de la cepa K601/W303-1A MAT-a (genotipo: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). Realice la transformación con un vector de expresión comúnmente utilizado para Saccharomyces cerevisiae, como pAG416¹².
3. Después de la transformación, cultivar células de levadura a 30 °C en medio SC-Ura, preparado por litro de la siguiente manera, hasta que aparezcan colonias transformadas de forma independiente: 0,77 g de CSM-Ura, 6,7 g de base de nitrógeno de levadura (YNB) con sulfato de amonio, 20 g de glucosa, 20 g de agar y adenina añadidas a una concentración final de 150 μM.
4. Preparar células de levadura competentes y realizar la transformación mediada por PEG 3350 de acuerdo con un protocolo establecido¹⁶.
5. Para experimentos de captura de células microfluídicas, raye las existencias de glicerol al 25% en placas SC-Ura e incube a 30 ° C durante 2 días para permitir el crecimiento de colonias individuales independientes. Vuelva a suspender las colonias individuales en 5 ml de medio líquido SC-Ura e incube a 30 °C agitando hasta que el OD600 alcance 0,5-1,0, lo que las hace adecuadas para cargarlas en el sistema de perfusión.

3. Preparación del sistema de perfusión (Figura 2)

1. Prepare la placa microfluídica para las células de levadura haploides cargándola con 50 μL de células de levadura que expresan biosensores GA-Matryoshka, junto con los medios SC-Ura finales para el crecimiento y la solución tamponada para los tratamientos (por ejemplo, NaCl o sorbitol).
   1. Retire la solución de almacenamiento de los pocillos 1-8. Aspire la solución salina tamponada con fosfato (PBS) de los pocillos y agregue 400 μL de agua estéril.
   2. Lave los pozos 1-6 y 8. Lavado 1: Aspire la solución de agua estéril de los pocillos 1-8 y agregue 400 μL de agua estéril. Lavado 2: Repita el lavado aspirando y agregando 400 μL de agua estéril. Lavado 3: Repetir una vez más con 400 μL de agua estéril.
   3. Llenado final para los pocillos 1-6: Aspire la solución de agua y agregue 300 μL de soluciones finales de perfusión/crecimiento como SC-Ura para el crecimiento de levaduras, o una solución tamponada que contenga los analitos de interés para el tratamiento.
   4. Carga celular en el pozo 8: Agregue 50 μL de suspensión de células de levadura (OD600 = 0.5-1.0).
2. Selle las placas con el colector de temperatura controlada de la plataforma microfluídica y conéctelo al sistema de imágenes de células vivas. Los colectores mantienen un ambiente térmico estable a una temperatura de 28 °C, mientras que la tubería y una bomba aseguran un sellado adecuado y una perfusión continua.
   1. Alinee la placa en el colector. Enciende la aspiradora. Encienda la plataforma microfluídica.
   2. Presione Seal y espere hasta que se encienda la luz verde. Abra el software de la plataforma microfluídica, cree un nuevo experimento y seleccione la placa de levadura adecuada en la lista desplegable.
   3. Haga clic en el botón Ejecutar secuencia de cebado líquido . Haga clic en Ejecutar secuencia de carga celular para cargar células de levadura del pocillo 8 en la cámara de cultivo, donde serán atrapadas y cultivadas bajo perfusión continua de medio selectivo SC-Ura durante la noche a 10 kPa a 28 °C.
   4. En la pestaña Modo manual, haga clic en Ejecutar una secuencia personalizada o utilice el Editor de protocolos para establecer parámetros experimentales como la temperatura a 30 °C, el caudal a 10 kPa, la duración del paso (por ejemplo, 10 min) y los canales que se abrirán para la perfusión.
3. Cultivar las células durante la noche en la cámara de cultivo bajo perfusión continua con medio selectivo SC-Ura a 28 °C y una presión de 10-17 kPa.

4. Imágenes de fluorescencia radiométrica (Figura 3, Figura 4 y Video 1)

1. Evalúe el crecimiento celular y la fluorescencia a través de una visualización microscópica rápida.
   1. Coloque la placa microfluídica en la platina de un microscopio invertido. Concéntrese en el centro del área de visualización para ubicar las celdas.
   2. Utilice microscopía de campo claro y/o fluorescencia para evaluar la morfología celular, la viabilidad y la expresión del biosensor.
2. Investigue la dinámica del estado estacionario del calcio en condiciones controladas con precisión utilizando el sistema microfluídico y las placas microfluídicas compatibles 4,12,13,14.
3. Realice imágenes de células vivas utilizando un microscopio confocal de barrido láser invertido con un aumento de 100x y una apertura numérica (NA) de 1,40. Monitoree los biosensores de doble fluoróforo excitando GFP y LSSmApple a 488 nm usando un láser de argón. Recopile señales de emisión a 520 nm para GFP y 610 nm para LSSmApple (Figura 5) y realice experimentos de imágenes de fluorescencia radiométricas para cuantificar las respuestas dinámicas del biosensor. Mida la relación de intensidades de emisión (GFP/LSSmApple) a lo largo del tiempo para monitorear los cambios inducidos por analitos.

5. Análisis de imágenes mediante software de código abierto (Figura 6)

1. Obtenga CellProfiler o cualquier otro software similar del repositorio oficial e instálelo en una estación de trabajo local.
2. Organice las imágenes de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo en orden secuencial (por ejemplo, img_001.tif, img_002.tif, etc.) para garantizar la compatibilidad con el procesamiento automatizado por lotes.
3. Inicie el software e inicialice una nueva canalización de análisis seleccionando Nuevo proyecto. Importe la secuencia de imágenes de lapso de tiempo en el área de trabajo de canalización.
4. Incorpore el módulo IdentifyPrimaryObjects para detectar células individuales dentro de cada trama en función de la señal de fluorescencia o los criterios morfológicos.
5. Agregue el módulo TrackObjects para establecer correspondencias temporales entre celdas a través de marcos, lo que permite el seguimiento de una sola celda a lo largo del tiempo.
6. Incluya el módulo MeasureObjectIntensity para cuantificar los parámetros de intensidad de fluorescencia (por ejemplo, media, mediana e intensidad integrada) para cada celda rastreada.
7. Utilice el módulo ExportToSpreadsheet para compilar y exportar datos cuantitativos a un formato tabular (por ejemplo, CSV) para el análisis posterior.
8. Analice los datos exportados utilizando herramientas estadísticas o de visualización de datos, como software de hoja de cálculo.

Resultados

Para lograr una imagen radiométrica exitosa de biosensores en sistemas microbianos, se deben abordar varios desafíos técnicos.

Sistema de expresión: El primer desafío radica en la selección del sistema de expresión; ya sea basado en plásmidos, cromosómicamente integrado, impulsado por promotores constitutivos o inducibles, y con o sin etiquetas de orientación subcelular. Estos factores pueden afectar significativamente la estabilidad, toxicidad y localización del biosensor dentro de las célula...

Discusión

Los biosensores basados en fluoróforos codificados genéticamente permiten el monitoreo en tiempo real de las concentraciones de analitos intracelulares en células vivas¹. Estos biosensores suelen funcionar convirtiendo los cambios conformacionales en señales ópticas, que pueden detectarse de forma radiométrica o intensiométrica. Los biosensores intensiométricos se basan en los cambios de intensidad de fluorescencia de un solo FP, lo que los hace sensibles a las va...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	Sigma-Aldrich Co.	A5306-250G
Placa CellASIC ONIX para células de levadura haploides	Merck KGaA	Y04C-02-5PK
CellASIC ONIX2	Merck KGaA	CAX2-S0000
CSM-Ura	Thermo Fisher Scientific	11387899
D-glucosa	Sigma-Aldrich Co.	G8270-100G
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich Co.	S1876-10MG
NaCl	Sigma-Aldrich Co.	S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s	NA	7	Para la expresión de GA-MatryoshCaMP6s en levadura
TCS SP8 STED	Leica	NA
Cepa de levadura K601/ W303-1A MAT-a	NA	8	ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNB	BocaScientific	GCM16.0500
α-Mating Factor acetato sal	Sigma-Aldrich Co.	T6901-.5MG