Artículo de método

Uso del método de transferencia de gotas para preparar de forma fiable vesículas unilamelares gigantes

DOI:

10.3791/68340

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19 de septiembre de 2025

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1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta guía para principiantes presenta un protocolo general para la preparación de vesículas unilamelares gigantes (GUV) mediante el método de transferencia de gotas, discutiendo los pasos críticos y proporcionando información para ayudar a los posibles ajustes necesarios para diferentes aplicaciones, incluida la biología sintética y la microrobótica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En las últimas dos décadas, el método de transferencia de gotas, también conocido como emulsión invertida, doble emulsión, transferencia de fase o transferencia de emulsión, ha demostrado ser ventajoso para la preparación de vesículas unilamelares gigantes (GUV) y, en particular, para cargarlas con diferentes cargas, desempeñando así un papel crucial en la biología sintética. Debido a la eficiencia de la encapsulación y la simplicidad de ejecución, se ha utilizado ampliamente para el desarrollo de células artificiales. En la literatura se observa una gran variabilidad en varios parámetros, lo que conduce a resultados extremadamente variables. Esto se debe en parte a los ajustes necesarios para las diferentes necesidades y aplicaciones de este método versátil, pero puede resultar desorientador para los investigadores que se acercan a esta técnica por primera vez.

Para proporcionar a los principiantes una comprensión básica del método y el papel de los parámetros críticos, se presenta un protocolo junto con sugerencias sobre los principios fisicoquímicos fundamentales que subyacen a la formación de GUV a través de la transferencia de gotas. Esta guía paso a paso para la preparación de los GUV incluye, por tanto, consideraciones y sugerencias prácticas basadas en la literatura y la experiencia directa.

Teniendo en cuenta las posibles fuentes de variabilidad, se identifican algunos aspectos como críticos: la sensibilidad de los fosfolípidos a la luz, la oxidación y la hidrólisis; la elección del aceite para disolver los fosfolípidos (la solución lipídica o LS); y la recuperación de GUV después de la centrifugación. Se proponen medidas eficaces en función de los costos para reducir al mínimo la interferencia del oxígeno y la humedad atmosféricos. Para ayudar a identificar combinaciones adecuadas de aceite y fosfolípidos, el protocolo general se complementa con una discusión sobre las propiedades fisicoquímicas relevantes del LS. Finalmente, para evitar procedimientos poco prácticos, se propone un método sencillo y seguro para eliminar completamente la fase oleosa de una vez y recuperar una dispersión GUV limpia. Estas medidas aceleran la implementación de ajustes a las nuevas composiciones de GUV, ampliando potencialmente su adopción en biología sintética y campos vecinos, incluida la microrobótica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implementando una técnica previamente descrita para producir liposomas1, Pautot et al. establecieron un protocolo para producir vesículas lipídicas con diámetros que van de 0,1 a 1 μm de diámetro2. El método de transferencia de gotas ha demostrado rápidamente su eficacia en la producción de vesículas aún más grandes (diámetros superiores a 1 μm)3, ganando cada vez más popularidad por la simplicidad de ejecución y la alta eficiencia de encapsulación. De hecho, en comparación con los métodos de hinchamiento (como el hinchamiento del gel o la electroformación), este protocolo reduce el volumen de solución de carga necesaria para formar un número comparable de vesículas y los residuos asociados4. Los GUV se pueden ensamblar a partir de interfaces de fluidos a través de métodos alternativos con una eficiencia de encapsulación comparable. Sin embargo, en comparación con los basados en chips microfluídicos 5,6 o encapsulación continua de cruce de interfaz de gotas (cDICE)7, la transferencia de gotas ofrece la configuración más simple asequible en cualquier laboratorio con equipo básico. Además, los métodos microfluídicos pueden conducir a GUV con inclusiones de aceite no deseadas en la membrana. Por estas razones, la transferencia de gotas ha sido el método elegido para cargar GUV con cargas valiosas en los campos de las células artificiales 3,8,9,10 y, recientemente, la microrobótica 11,12.

El método se basa en la formación de valvas de membranas a través de la estabilización de interfaces agua/aceite mediadas por fosfolípidos. Primero, los fosfolípidos se disuelven en un aceite (solución lipídica, LS), luego se prepara una emulsión de agua en aceite con la solución acuosa que contiene la carga GUV deseada (solución interna, IS) en el LS. Luego, la emulsión se transfiere a un tubo donde otra solución acuosa (llamada solución externa, OS) se ha equilibrado previamente con LS para formar una interfaz agua-aceite. Los GUV se forman cuando las gotas de agua se ven obligadas a cruzar esta interfaz OS/LS por centrifugación: la valva interna de los GUV se forma en la superficie de las gotas de IS, mientras que la valva externa se forma entre OS y LS (Figura 1).

Se han descrito muchas variantes de protocolo con parámetros ajustados de acuerdo con las necesidades experimentales contingentes. Un primer intento extenso de optimizar el proceso fue descrito por Moga et al.13, mientras que Zhang et al. reunieron la mayoría de los ejemplos relevantes en una revisión reciente14. A pesar de los muchos parámetros descritos que influyen en el protocolo, no hay indicios de cómo se podría llevar a cabo un proceso de optimización para una nueva formulación de GUV, ni de las mejores prácticas para la recuperación y manipulación de GUV después de la producción. Basándonos en la literatura científica disponible y nuestra experiencia directa, proporcionamos aquí un protocolo general para producir GUV mientras discutimos los principios básicos. De este modo, proporcionamos indicaciones útiles para la optimización de nuevas formulaciones de GUV y dos precauciones siempre aplicables al protocolo: la preparación de LS en un entorno controlado y un método para eliminar fácilmente la fase superior del aceite para la recuperación de una muestra limpia de GUV. Elegimos dos ejemplos: uno con 240 mM de sacarosa como IS y 0,2 mM de DOPC en aceite de silicona AR20 como LS (condición E [vacío], ver Tabla 1) y el otro compuesto por 0,2% de micropartículas de poliestireno de 1,1 μm en sacarosa de 240 mM como IS y 3,18 mM de DOPC en aceite mineral como LS (condición P [con partículas], ver Tabla 1). Ambas muestras se produjeron con 240 mM de glucosa como OS. Elegimos esta osmolaridad para obtener GUV que, en condiciones fisiológicas, tienen una membrana lipídica relajada (baja tensión de la membrana).

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Figura 1: Representación esquemática del método de transferencia de gotas. (A) Se preparan tres soluciones en viales separados: fosfolípidos en aceite (fase amarilla) para formar una solución lipídica, una solución que contiene sacarosa (en cian) como solución interna y una solución de glucosa equiosmolar (blanca) como solución externa. (B) LS se mezcla con el IS para formar una emulsión estable, luego (C) se permite que una interfaz entre OS y LS se equilibre antes de que (D) la emulsión se vierta encima. (E) Las gotas de agua se ven obligadas a cruzar la interfaz LS / OS por la fuerza centrífuga para (F) permitir la formación de GUV. La figura no está a escala y está destinada a proporcionar solo un esquema del método. Abreviaturas: LS = solución lipídica; IS = solución interna; OS = solución externa; GUV = vesícula unilamelar gigante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

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NOTA: A menos que se indique lo contrario, los procesos se llevan a cabo a temperatura ambiente.

1. Preparación de soluciones

  1. Preparación de soluciones acuosas (IS y OS)
    1. En dos barcos de pesaje diferentes, pesar 2,16 g de glucosa y la cantidad de sacarosa especificada en la Tabla 1. Agregue los polvos a dos vasos de precipitados de 150 ml, agregue 40 ml de agua ultrapura y mezcle revolviendo.
    2. Transfiera las soluciones a dos cilindros de 50 ml y agregue agua ultrapura hasta 50 ml para obtener soluciones de glucosa de 240 mM y soluciones de sacarosa con las concentraciones indicadas en la Tabla 1. Cubra los cilindros con un trozo de parafilm y mezcle las soluciones invirtiendo los cilindros varias veces.
    3. Filtre las soluciones con jeringas de 50 ml y filtros de 0,22 μm para evitar la contaminación por microorganismos.
    4. Para la condición P, prepare la siguiente mezcla: 2 μL de dispersión de partículas de poliestireno de 100 mg/mL 1,1 μm, 24 μL de solución de sacarosa preparada en el paso 1.1.1 y agua ultrapura hasta 100 μL (suspensión final: 0,2% de micropartículas en solución de sacarosa de 240 mM). Almacene las soluciones a +4 °C durante un máximo de 1 semana o prepare alícuotas de 1 ml en tubos de 1,5 ml y guárdelas a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
  2. Configuración de una cámara de guantes para preparar LS en un entorno controlado
    1. Corte cinco trozos de tubo de silicona con un diámetro interno de 7 mm, un diámetro externo de 13 mm y las longitudes indicadas en la Tabla 2 (tubos 1 a 5).
    2. Corte cuatro trozos de tubo de silicona que tengan un diámetro interno de 3 mm, un diámetro externo de 7 mm y las longitudes indicadas en la Tabla 2 (tubos 6 a 9).
    3. Conecte un extremo de la tubería 1 a una válvula de dos vías y el otro extremo a una unión de tres vías (Figura 2A).
    4. Conecte la tubería 2 a los otros extremos de la válvula de dos vías, luego conecte la tubería 3 y la tubería 4 a la unión de tres vías, con la tubería 3 conectada a la extremidad opuesta a la tubería 1 (Figura 2A).
    5. Conecte el extremo libre del tubo 4 a la entrada de la cámara del guante (tubo de entrada, Figura 2B).
    6. Conecte la válvula de tres vías suministrada con la cámara del guante a la salida, luego conecte la válvula a la tubería 5 (tubería de salida, Figura 2C).
    7. Conecte un extremo de la tubería 6 a una aguja de 18 G y el otro extremo a una unión bidireccional. Repita esto con la pipa 7 y la aguja de 21 G (Figura 2D).
    8. Inserte las dos agujas en una tapa de vial con tabique: esta tapa con agujas permitirá la entrada y salida controlada de nitrógeno y cloroformo. Guarde la tapa en un tubo vacío de 50 ml sin tapa para evitar el contacto con las agujas (Figura 2D).
    9. Apriete e inserte los tubos 8 y 9, respectivamente, en las aberturas de entrada y salida desde el lado interior de la cámara del guante (Figura 2E).
  3. Preparación de LS
    1. Mueva la cámara de guantes dentro o al lado de una campana química. Abra la cámara de guantes e inserte un cristalizador lleno de partículas de sílice en el fondo de la cámara (Figura 2F). Cubra el cristalizador con la superficie de apoyo blanca y cúbralo con toallas de papel.
    2. Inserte todos los materiales necesarios en la cámara del guante (Figura 2G): un higrómetro, el 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) en solución de cloroformo, el aceite (s) (Tabla 1), viales limpios de vidrio oscuro de 20 ml (abiertos y con las respectivas tapas), una jeringa Hamilton (Tabla 1), una micropipeta P10000 y puntas. Coloque el vial de vidrio que contiene la solución de cloroformo en un soporte de anillo de corcho, un vaso de precipitados de 150 ml o cualquier otro soporte adecuado lo más cerca posible del lado del operador.
      NOTA: Esta precaución evitará que las botellas se inclinen debido al inflado y desinflado de los guantes durante los ciclos de vacío y flujo de nitrógeno.
    3. Cierre la cámara del guante, asegurándose de que las dos mitades no puedan deslizarse, y séllelas con los tornillos de plástico provistos con la cámara del guante.
    4. Cierre la válvula de salida y sumerja el tubo 5 en un vaso de precipitados de 500 ml lleno hasta la mitad con agua (Figura 2H).
    5. Conecte el extremo regulado por válvula de la tubería de entrada (tubería 2) a la línea de vacío y el otro extremo al nitrógeno (tubería 3, Figura 2A). La cámara del guante ahora está completamente configurada como se muestra en la Figura 2J.
    6. Abra la válvula y la línea de vacío hasta que la despresurización infle los guantes hasta el punto de que sean demasiado rígidos para doblarlos. Cierre la línea de vacío y la válvula.
    7. Abra el nitrógeno hasta que la presión desinfle los guantes hasta el punto de que salgan de la cámara de guantes. Cierre la línea de nitrógeno.
    8. Repita los pasos 1.3.6 a 1.3.7 al menos 10 veces, asegurándose de que la humedad interna caiga por debajo del 40%.
    9. Controle la presión interna con vacío y nitrógeno para facilitar al operador el uso de guantes.
    10. Con la jeringa Hamilton, transfiera el volumen de DOPC en la solución de cloroformo indicada en la Tabla 1 a un vial de vidrio oscuro. Cierre el vial con la tapa con agujas preparada en el paso 1.2.9.
    11. Conecte la tubería 6 a la tubería 8 y la tubería 7 a la tubería 9 a través de las uniones bidireccionales (Figura 2I).
    12. Quítese los guantes y abra la válvula de salida.
      NOTA: Un segundo operador podría ayudar desde los pasos 1.3.13 a 1.3.15 para acelerar el proceso.
    13. Abra el flujo de nitrógeno muy lentamente y verifique el flujo de gas observando burbujas en el vaso de precipitados donde se colocó previamente la tubería 5 (paso 1.3.4). Ajuste gradualmente el flujo de nitrógeno hasta que alcance una velocidad relativamente alta a la que las burbujas individuales permanezcan observables. Deje que el nitrógeno fluya durante 3 minutos, luego cierre la línea de nitrógeno.
      NOTA: La presión excesiva de nitrógeno puede hacer que la solución de DOPC en cloroformo se disperse por todo el vial, disminuyendo la cantidad de fosfolípidos disponible para la solución lipídica (LS) posterior. Además, la alta presión aumenta el riesgo de que las agujas sean expulsadas del vial. Por lo tanto, es esencial ajustar cuidadosamente el flujo de nitrógeno a un nivel óptimo que agite suavemente el cloroformo sin causar salpicaduras incontroladas.
    14. Mientras tanto, prepare un baño de agua en un cristalizador y caliéntelo a 80 °C en una placa caliente.
    15. Espere hasta que salga la última burbuja en el vaso de precipitados, luego cierre la válvula de salida. Vuelva a usar los guantes y desconecte las tuberías 8 y 9 de las uniones bidireccionales.
    16. Compruebe que todo el cloroformo se haya evaporado del vial oscuro, luego ábralo y vuelva a colocar la tapa en el tubo de 50 ml. Abra la botella de aceite, transfiera el volumen requerido de aceite (Tabla 1) al vial oscuro y ciérrelo con la tapa. Quítese los guantes y abra la cámara de guantes.
    17. Selle el LS con parafilm. Agite el vial vigorosamente durante al menos 30 s. Incubar a 80 °C durante 30 min en el baño de agua preparado en el paso 1.3.14. Agite el vial vigorosamente durante al menos 30 s. Incube a temperatura ambiente durante la noche.
    18. Continúe con la preparación de GUV o guárdelos a +4 °C hasta por 1 semana.
      NOTA: En preparaciones asimétricas de GUV, se pueden usar dos LS diferentes para la interfaz y la emulsión para obtener dos valvas de membrana diferentes15.

2. Producción de GUV

  1. Preparación de un recipiente para eliminar fácilmente el aceite
    1. Con unas tijeras, corte la tapa de un tubo de 5 ml. Taladre un orificio de ~ 8 mm en el centro de la tapa y verifique que el orificio sea lo suficientemente ancho como para permitir que una punta P1000 encaje y se bloquee (Figura 3A). Si el agujero es demasiado estrecho, repita los dos pasos anteriores; Si es demasiado ancho, deseche la tapa y reinicie con una nueva del paso 2.1.1.
    2. Corta un trozo de papel de lija de 2 x 5 cm y lija el agujero. Vuelva a colocar la tapa perforada en la parte superior del tubo de 5 ml y centrifugue a 3.000 × g durante 5 minutos para eliminar todos los residuos plásticos residuales del agujero. Retire la tapa y deseche el tubo.
    3. Corte la tapa de un tubo nuevo de 5 ml y reemplácela con la tapa perforada. Coloque una junta tórica en la parte superior de la tapa e inserte una punta P1000 a través del orificio. Bloquee la junta tórica entre la punta y la tapa y verifique que la punta no se pueda empujar más abajo en el tubo (Figura 3B). Llene el tubo de 5 ml con 5,5 ml de OS a través de la punta.
  2. Formación de la interfaz OS/LS
    1. Preparar un baño de agua en un cristalizador y calentarlo a 50 °C en una placa caliente.
    2. Agitar el vial de LS preparado en la sección 1.3, vigorosamente durante al menos 30 s. Calentar el LS a 50 °C en el baño maría durante 30 min.
    3. Equilibrar las soluciones de agua preparadas en la sección 1.1 a temperatura ambiente durante al menos 10 min.
    4. Pipetee 300 μL de OS en un tubo de 1,5 ml o un tubo de 5 ml modificado según el paso 2.1. Pipetee lentamente 100 μL de LS sobre el sistema operativo, asegurándose de que se formen dos fases distintas y continuas en el tubo. Deje que la interfaz se equilibre durante 10 minutos.
      NOTA: Para permitir la formación de una monocapa homogénea de fosfolípidos, el LS debe distribuirse homogéneamente sobre el OS (Figura 4A). Si la capa de LS no es continua, redistribuya el volumen de LS con una micropipeta o aumente el volumen de LS (esto puede ser muy útil con aceites altamente viscosos como la parafina).
  3. Formación de emulsión de agua en aceite
    1. En un tubo de 2 ml, pipetee, en este orden, 250 μl de LS y 6,25 μl de IS para una emulsión de agua en aceite al 2,5 %.
      NOTA: En nuestra experiencia, esta proporción de agua en aceite probablemente proporciona una emulsión estable, lo que aumenta la tasa de éxito del protocolo (Figura 5). Para aumentar el rendimiento de GUV, recomendamos aumentar el volumen de emulsión en lugar de la relación IS/LS.
    2. Mezcle las dos fases utilizando uno o más de los siguientes métodos hasta que la mezcla parezca homogénea y estable: vórtice, agitación mecánica sobre una rejilla de microtubos estándar o golpeando el tubo con un dedo (consulte la Figura 5 para ver ejemplos de emulsión homogénea).
    3. Transfiera 200 μl de la emulsión sobre la interfaz OS/LS preparada en la sección 2.2.
    4. Si usa un tubo de 1,5 ml, simplemente cierre el tubo; si usa el tubo modificado de 5 ml de la sección 2.1, coloque una tapa de goma en la parte superior de la punta y transfiera con cuidado el tubo a un tubo cónico de 50 ml.
  4. Transferencia de gotas mediante centrifugación
    1. Centrifugar los tubos a temperatura ambiente siguiendo las indicaciones de la Tabla 1. Al final de la centrifugación, verifique la presencia de un gránulo opaco en la parte inferior del tubo y una fase oleosa clara en la parte superior.

3. Recuperación de GUV

  1. Eliminación de aceite
    NOTA: De acuerdo con las necesidades experimentales, el aceite se puede eliminar en tres pasos alternativos diferentes.
    1. Si los GUV se prepararon en tubos estándar de 1,5 ml, retire lentamente el aceite con la ayuda de una pipeta P1000 y una P200 para las últimas gotas, asegurándose de que el pellet no se altere.
      NOTA: Las puntas más estrechas ayudan a eliminar el aceite, por lo que insertar una punta para volúmenes más pequeños (10-200 μL) en una punta P1000 mejorará la precisión de este paso.
    2. Si se trata de múltiples preparaciones de GUV en diferentes tubos de 1,5 ml, retire el aceite con la ayuda de un matraz Büchner. Conecte una pieza de un tubo de silicona grueso (diámetro interno 7 mm, externo 13 mm) a la línea de vacío e inserte otro tubo en la abertura del matraz, sellándolo con una junta de goma. En el otro extremo de este tubo, inserte una punta P1000, envuélvala con parafilm, corte alrededor de 3 mm de la punta e insértela en una punta P200. Abra el vacío y aspire el aceite con la punta P200, luego cierre el vacío y elimine las últimas gotas a través de una pipeta P200.
    3. Si los GUV se prepararon en el recipiente detallado en el paso 2.1, retire la punta del tubo, asegurándose de que la tapa de goma no se desprenda (Figura 3D). Luego, deseche la punta y guarde la tapa de goma, la junta tórica y la tapa perforada para reutilizarla.
    4. Con la ayuda de una micropipeta P1000, retire el OS del tubo (Figura 3E), dejando alrededor de 50 μL del volumen, asegurándose de que el pellet no se altere.
    5. Cambie la punta, vuelva a suspender el gránulo en el volumen sobrante y transfiéralo a un tubo limpio de 2 ml.
  2. Lavados GUV
    NOTA: El propósito de estos pasos es eliminar los rastros de la fase oleosa que no se eliminaron en el paso 3.1. Si es necesario, se deben repetir los pasos 3.2.1 y 3.2.2 hasta que no se observe ninguna gota de aceite en el tubo.
    1. Llene el tubo con 2 ml de OS y centrifugue a 1.500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Retire el OS, dejando alrededor de 50 μL del volumen, asegurándose de que el pellet no se altere.
    3. Repita los dos últimos pasos.
  3. Equilibrio de volumen
    NOTA: Incluimos esta sección para permitir una comparación de los rendimientos entre diferentes preparaciones de GUV.
    1. Con una micropipeta P200, vuelva a suspender el sedimento en los 50 μL del volumen sobrante de la última repetición del paso 3.2.2.
    2. Mida este volumen ajustando la pipeta a 20 y aumentando el volumen con la punta sumergida en la dispersión GUV sin tocar la pared del tubo para permitir que el líquido fluya dentro de la punta.
    3. Agregue OS para alcanzar el volumen final de 100 μL.

4. Observación y análisis dimensional

  1. Adquisición de imágenes microscópicas
    1. Mezcle suavemente la dispersión GUV golpeando el tubo con un dedo.
    2. Cargue una cámara Burker con 10 μL de la muestra de GUV y espere al menos 5 minutos para permitir que los GUV se sedimenten en el fondo de la cámara.
    3. Observe la muestra bajo un microscopio de contraste de fases. Usando las líneas de Burker como referencias, muévase por la muestra y adquiera al menos 20 imágenes, asegurándose de que las áreas de observación no se superpongan.
  2. Análisis dimensional
    1. Cargue las imágenes en ImageJ.
    2. Para calcular el factor de conversión de píxeles/μm, elija una imagen que muestre un cuadrado de 50 x 50 μm de la cámara de Burker (consulte la hoja de datos del fabricante para la identificación correcta), luego seleccione la herramienta de selección de línea recta , dibuje una línea entre dos esquinas consecutivas del cuadrado y mida la línea haciendo clic en Analizar | Medir. Repita 3x y calcule el valor promedio.
    3. Establezca el factor de conversión haciendo clic en Analizar | Establecer escala. Inserte el valor del paso 4.2.2 en el cuadro Distancia en píxeles, luego inserte el valor 50 en Distancia conocida y μm en Unidad de longitud.
    4. Haga clic en Analizar | Establezca las medidas y seleccione el cuadro Área . Seleccione la herramienta de selección ovalada , luego haga clic con el botón izquierdo del mouse y mantenga presionada la tecla Mayús para superponer el círculo resultante alrededor de un GUV. Mida el diámetro haciendo clic en Analizar | Medir. Repita esto para cada GUV en cada imagen.
    5. En la ventana Resultados, haga clic en Archivo | Guardar como... para exportar el archivo csv del área de GUV, luego analice la distribución de tamaño con el script disponible en GitHub16.
      NOTA: Es posible omitir el paso 4.2.3 y ejecutar el script especificando el factor de conversión de píxeles/μm. Para calcular este valor, divida el valor obtenido en el paso 4.2.2 por 50.

Resultados

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Una preparación óptima de GUV se caracteriza por la formación de una fase oleosa clara y un gránulo distinto (Figura 4A). En los casos en que las gotas de agua no se convierten en GUV, generalmente colapsan y dejan restos de fosfolípidos en la interfaz OS/LS (Figura 4C). Este efecto es probablemente causado por la agregación de fosfolípidos y otras moléculas de la fase oleosa, como resultado de un equilibrio insuficiente de fosfolípidos en la interfaz agua/aceite. No obstante, a pesar de la ausencia de un gránulo visible o la presencia de desechos en la interfaz, aún se pueden formar GUV, lo que permite que el proceso continúe. Si bien los pasos de lavado no son del todo efectivos para eliminar todos los desechos de fosfolípidos, ayudan significativamente a eliminar las gotas de aceite, mejorando la calidad general de la muestra (compare la Figura 6A y la Figura 6B).

El uso de LS viejos o LS preparados en condiciones de alta humedad a menudo da como resultado dispersiones GUV reducidas con menor rendimiento y mayor contenido de agregados desordenados que probablemente estén formados por fosfolípidos y otras moléculas de la fase oleosa (Figura 6C). Para LS preparados en condiciones de alta humedad, observamos coeficientes de variación superiores a 0,8 en la producción de GUV (con muestras que contenían muy pocos GUV), mientras que para LS preparados en la cámara de guantes modificada, el coeficiente de variación fue inferior a 0,5.

Las diferentes condiciones de centrifugación pueden afectar el rendimiento y la calidad del GUV. A partir de un análisis cualitativo, 20 min a 3.300 × g se identificó como una buena condición para los GUV cargados de sacarosa (muestra E). La disminución de la velocidad (45 min a 500 × g) resultó en una reducción del rendimiento, mientras que un aumento (5 min a 16,600 × g) condujo a una mayor formación de agregados de fosfolípidos desordenados. Una fuerza centrífuga débil puede evitar que muchas gotas crucen la interfaz OS/LS, de ahí el rendimiento reducido, mientras que una fuerza fuerte puede no proporcionar tiempo suficiente para la organización de fosfolípidos en la valva externa durante el cruce de la interfaz (Figura 7). La encapsulación de micropartículas también se puede optimizar con ajustes en los parámetros de centrifugación, siempre que la densidad de masa de las micropartículas coincida aproximadamente con la del IS. Para ello, la disminución de la aceleración de la centrifugación (y a su vez el aumento del tiempo de centrifugación) permite una encapsulación más homogénea de las partículas, evitando la rotura de la membrana fosfolípida debido a la fuerza ejercida por las partículas sólidas (un ejemplo de buena encapsulación se muestra en la Figura 6D mientras la investigación de los parámetros óptimos de centrifugación aún está en curso17).

Debido a que la difusión de fosfolípidos puede verse afectada por la fase oleosa, se puede realizar una prueba cualitativa simple para evaluar la estabilidad de la emulsión (Figura 5). Con la ayuda de un colorante colorante (Brilliant Blue FCF) disuelto en el IS para mejorar la visualización, se pueden preparar emulsiones con diferentes proporciones agua/aceite y observarlas a lo largo del tiempo. La pérdida de estabilidad se puede visualizar por la agregación de gotas de agua y la consiguiente separación de la fase oleosa. Debido a que es menos probable que las gotas grandes (visibles a simple vista) se conviertan en GUV, recomendamos utilizar la condición de emulsión que proporciona la menor separación de fases.

El efecto de las variaciones en el protocolo se puede verificar a través de un análisis de distribución de tamaño como se describe en la sección 4 del protocolo: los diámetros de los GUV se pueden medir usando ImageJ a partir de imágenes de microscopio de contraste de fase, y la distribución de tamaño se puede analizar con un script disponible en GitHub16. Siguiendo este protocolo, fue posible, por ejemplo, observar un aumento de los GUV con diámetros más grandes cuando se elige aceite mineral en lugar de aceite de silicona AR20 (Figura 8).

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Figura 2: Configuración de la cámara de guantes. Esta figura muestra las principales modificaciones de la cámara del guante para la preparación de la solución lipídica. (A) Conexión de entrada con nitrógeno y vacío; (B) conexión de entrada con la cámara del guante; (C) válvula de salida; (D) tapa con agujas para evaporación de solventes; (E) tubos delgados para evaporación de solventes; (F) partículas de sílice para absorber la humedad; G) elementos que deben colocarse en la cámara de los guantes: termohigrómetro digital (1), solución lipídica en disolvente orgánico (2), soporte para anillos de corcho (3), jeringa de vidrio (4), tapón abierto con tabique y agujas (5), solución de aceite (6), vial oscuro abierto con tapón (7), puntas de 10 ml (8), pipeta P10000 (9); (H) extremo de la tubería de salida sumergido en agua; (I) vial cerrado con tapa con agujas conectada a la entrada y salida; (J) esquemas de la cámara del guante modificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Recipiente para facilitar la eliminación del aceite. Pasos principales en la preparación de GUV en un recipiente para facilitar la extracción del aceite según la sección 2.1 del protocolo. (A) Se perfora un orificio en una tapa de tubo de 5 ml para permitir que encaje una punta P1000; luego (B) la tapa se coloca en un tubo vacío de 5 ml con la punta insertada en el orificio a través de una junta tórica. (C) Las soluciones se colocan en el tubo según las secciones 2.2 y 2.3 del protocolo, la punta se tapa y el tubo se coloca dentro de un tubo de 50 ml. Los GUV preparados a partir de 0,2 mM de DOPC en aceite de silicona se cargaron con 230,7 mM de sacarosa y 3,1 mM de azul brillante FCF para mejorar la visualización. (D) Después de la centrifugación, la fase oleosa superior queda atrapada dentro de la punta junto con una parte del tampón GUV (que parece cian debido a que parte de las gotas no se convierten en GUV y liberan el tinte en el OS). Gracias a la tapa de goma, la punta se puede quitar fácilmente del tubo de 5 ml junto con el contenido líquido, lo que permite una extracción rápida y fácil de toda la fase oleosa. (E) El gránulo GUV se puede recolectar fácilmente del fondo de un tubo en una dispersión clara, sin contaminación aparente por aceite, como se verificó (F) por microscopía de contraste de fase. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: LS = solución lipídica; IS = solución interna; OS = solución externa; GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Formación de GUV. Ejemplos de (A) interfaz OS/LS, (B) un gránulo GUV limpio con una fase oleosa clara y (C) un gránulo GUV con desechos en la interfaz OS/LS (los desechos y el gránulo aparecen rojizos porque el IS de esta población GUV se complementó con 1,65 mM de colorante de nueva coccina para mejorar la visualización). Abreviaturas: LS = solución lipídica; IS = solución interna; OS = solución externa; GUV = vesícula unilamelar gigante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Estabilidad de la emulsión con diferentes proporciones de aceite y agua en aceite. La figura muestra la estabilidad de las emulsiones a lo largo del tiempo, dependiendo del tipo de aceite y de la relación agua/aceite (w/o) utilizada. El IS estaba compuesto por 230,7 mM de sacarosa y 3,1 mM de Azul Brillante FCF para mejorar la visualización de las emulsiones. Las emulsiones preparadas con aceite mineral son menos estables que sus contrapartes hechas con aceite de silicona AR20. Este efecto se amplifica aún más con el aumento de las relaciones sin motor. Aunque las emulsiones en el aceite de silicona AR20 son significativamente más estables, su estabilidad también disminuye a medida que aumenta la relación w/o, con una separación de fases visible inmediatamente después de la emulsificación (aceite de silicona AR20 al 10%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Observación de GUV con un microscopio de contraste de fases. Un aumento de 20x de GUV cargados de sacarosa preparados a partir de un LS compuesto de 3,18 mM de DOPC en aceite mineral. (A) Muestra recuperada después de la eliminación de aceite; (B) muestra recuperada después de los pasos de lavado; (C) bajo rendimiento de GUV obtenido de un LS preparado en ambientes con oxígeno y humedad no regulados; (D) GUV cargados de micropartículas. Barra de escala = 10 μm; Las gotas de aceite están rodeadas con un círculo y los ejemplos de agregados desordenados de fosfolípidos y moléculas de aceite se indican con una flecha. Abreviaturas: LS = solución lipídica; GUV = vesículas unilamelares gigantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Efecto de diferentes condiciones de centrifugación en la formación de GUV. Imágenes de contraste de fase de GUV cargados de sacarosa preparados con un LS compuesto de 0,2 mM de DOPC en aceite de silicona AR20. La figura muestra una comparación cualitativa de GUV en (A) 16,600 × g durante 5 min, (B) 3,300 × g durante 20 min y (C) 500 × g durante 45 min. Mientras que la alta velocidad de centrifugación da como resultado una mayor presencia de agregados de fosfolípidos, la baja velocidad de centrifugación conduce a un rendimiento reducido. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: LS = solución lipídica; GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Análisis de distribución de tamaños. Comparación de dos muestras de GUV cargadas de sacarosa obtenidas de (A) 0,2 mM de DOPC en aceite mineral y (B) 0,2 mM de DOPC en aceite de silicona AR20 (*la muestra se diluyó 10x para permitir una clara distinción de GUV bajo un microscopio de contraste de fases). El análisis realizado siguiendo la sección 4 del protocolo muestra una distribución de tamaño desplazada hacia diámetros más altos para la muestra de aceite mineral con respecto a las muestras de aceite de silicona AR20. Sin embargo, el rendimiento de la muestra de silicona es casi 20 veces mayor. Abreviaturas: GUV = vesícula unilamelar gigante; DOPC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PasoCondición ECondición PDescripción
1.1.14,11 gramos17,11 gramosMasa de sacarosa
1.1.12,16 gramos2,16 gramosMasa de glucosa
1.1.2240 mM1000 mMConcentración de sacarosa
1.1.2240 mM240 mMConcentración de glucosa
1.3.2Aceite de siliconaAceite mineralFase oleosa para LS
1.3.2Jeringa de vidrio de 0,1 mlJeringa de vidrio de 0,5 mlJeringa de vidrio para transferir DOPC en soluciones de cloroformo
1.3.1063 μL500 μLVolumen de DOPC en solución de cloroformo
1.3.1610 ml5 mlVolumen de aceite
2.4.13300 g 20 minutos500 g 45 minutosCondiciones de centrifugación

Tabla 1: Variaciones en el protocolo. La tabla informa variaciones para varios pasos del protocolo (indicados en la primera columna) para preparar dos poblaciones diferentes de GUV: GUV cargados de sacarosa (condición E) y GUV cargados de micropartículas (condición P).

IDENTIFICACIÓNPasos involucradosDiámetro interior (mm)Diámetro exterior (mm)Longitud (mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Tabla 2: Tuberías para conexiones de gas y vacío en la cámara del guante. La tabla enumera las dimensiones de los tubos de silicona utilizados para conectar la cámara del guante a las líneas de nitrógeno y vacío. Se proporcionan identificadores de referencia para facilitar el proceso de ensamblaje.

Discusión

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Los métodos para la producción de GUV se pueden dividir en dos grupos principales: métodos basados en la hinchazón de los sustratos a través de la hidratación y los basados en el ensamblaje de interfaces de fluidos. Los métodos del primer grupo son muy eficientes para proporcionar grandes poblaciones de GUV para caracterizaciones biofísicas de membranas lipídicas o proteínas transmembrana. Por el contrario, métodos como la transferencia de gotas se eligen principalmente para la encapsulación de carga debido al menor consumo de cargas y la mayor eficiencia de encapsulación18.

Por esta razón, se han encapsulado una gran cantidad de cargas diferentes en GUV, lo que convierte a la transferencia de gotas en un proceso de referencia para células artificiales 3,8,9,10 y una posible solución para construir nuevos microrobots biomiméticos 11,12. Para modular las propiedades fisicoquímicas de las membranas GUV, se pueden incluir diferentes moléculas, como fosfolípidos iónicos10, ácidos grasos19, polímeros como PEG20 o colesterol21 (aunque las moléculas hidrófobas como el colesterol tienen una alta afinidad por el aceite, lo que resulta en un menor control de la composición de la membrana con respecto a los métodos de hinchamiento22). El protocolo es lo suficientemente versátil como para permitir estas modificaciones, pero algunos pasos tienen un mayor impacto que otros.

Para discutir los aspectos críticos del método, describimos aquí un protocolo para la preparación de dos poblaciones diferentes de GUV: una preparación de GUV que contiene una solución de sacarosa y una preparación de GUV que encapsulan micropartículas. Las diferencias en el protocolo se detallan en la Tabla 1 como condición E (vacío) y condición P (con partículas). Este método permite la formación de GUV mediante la transferencia de gotas de agua de una fase oleosa a una fase acuosa en un proceso biestable impulsado por fosfolípidos23 e influenciado por las propiedades fisicoquímicas de las tres fases involucradas: IS, OS y LS.

Entre los tres, LS es el más sensible debido a la susceptibilidad de los fosfolípidos a la luz, la oxidación y la hidrólisis 24,25,26. Por esta razón, el paso inicial de evaporar el disolvente orgánico utilizado para el almacenamiento a largo plazo de fosfolípidos a -20 °C (normalmente cloroformo o metanol) debe realizarse en viales de color ámbar bajo flujo de nitrógeno o argón. Si no se garantizan niveles bajos de humedad en el entorno del laboratorio, los fosfolípidos podrían dañarse13, 14, 27. Por lo tanto, el LS debe prepararse en un entorno confinado, como una guantera o la cámara de guantes modificada rentable descrita en este protocolo. Una vez que se agrega el aceite a la película lipídica, el LS se puede quitar de la cámara del guante y la disolución completa de los fosfolípidos se lleva a cabo mediante vórtice y calentamiento de la solución.

Aunque algunos protocolos incluyen la sonicación en este paso13, los aumentos localizados de la temperatura pueden provocar daños aún no descritos para algunas formulaciones de LS. Por esta razón, calentar la solución en un baño de agua puede proporcionar un proceso mejor controlado y homogéneo. Para reducir aún más las posibilidades de dañar el LS, este protocolo sugiere el uso de dos temperaturas diferentes: dado que la disolución de un LS recién preparado requiere mayor energía que un LS previamente disuelto (debido a un empaquetamiento más denso de moléculas de fosfolípidos en la película esparcida en la superficie del vial de vidrio), se adopta 80 °C para la primera disolución de la película lipídica y 50 °C para simplemente volver a disolver los fosfolípidos justo antes de su uso. Debido a que generalmente se observa un aumento en la variabilidad del rendimiento a lo largo del tiempo para 3,18 mM de DOPC en aceite mineral (Figura 4C), el uso de LS dentro de una semana es una práctica generalmente recomendada. No obstante, algunas combinaciones de aceite y fosfolípidos pueden tener una vida útil prolongada, y el uso de una cámara de guantes también parece mejorar la estabilidad de LS con el tiempo.

La personalización de las membranas GUV con combinaciones específicas de fosfolípidos puede requerir implementaciones personalizadas del protocolo. Para navegar entre todas las variaciones posibles, se puede obtener orientación de las propiedades fisicoquímicas del LS. Las concentraciones micelares críticas (CMC) y la difusividad de los fosfolípidos en LS están influenciadas por las interacciones químicas con las moléculas en solución28. Por lo tanto, la formación de gotas de agua en la emulsión IS/LS está influenciada por la rapidez con la que los fosfolípidos pueden difundirse en la fase oleosa y llegar a las interfaces agua/aceite para formar una monocapa estable (la valva interna de la membrana). Se observaron diferencias en la difusividad para los dos aceites explotados en este protocolo, siendo el aceite de silicona AR20 el que proporciona una mayor estabilidad de la emulsión IS/LS (Figura 6). Debido a que la emulsión más estable para ambos aceites se observó cuando el agua se dispersó en una proporción del 2,5% (consistentemente con observaciones previas en aceite mineral13), fijamos esto como una proporción generalmente válida.

No obstante, como las proporciones más altas podrían proporcionar características útiles (por ejemplo, el POPC en el aceite mineral mostró un cambio hacia GUV más grandes13), recomendamos realizar una prueba cualitativa preliminar como la que se informa en la Figura 6 para tener información sobre la estabilidad de la emulsión y, por lo tanto, la eficiencia esperada de la encapsulación. Aquí, aconsejamos a los lectores que no confíen en tiempos precisos o iteraciones de procedimientos para la formación de la emulsión porque la eficacia depende estrictamente del operador o del instrumento adoptado. En cambio, proporcionamos un punto de control para ayudar al operador a comprender cuándo la calidad de la emulsión es lo suficientemente buena para, al menos teóricamente, maximizar las posibilidades de convertir gotas en GUV. La difusividad de los fosfolípidos en el aceite también influye en su capacidad para reorganizarse durante la transferencia de gotas y formar la valva externa de la membrana GUV 2,7,18,29. Este paso se ve favorecido por un equilibrio adecuado de la interfaz LS/OS. Si bien el tiempo de incubación adoptado por este protocolo está en línea con las recomendaciones generales18, con mediciones de tensión interfacial de informes anteriores7 y nuestros experimentos preliminares, los GUV preparados con diferentes LS pueden beneficiarse de un tiempo de incubación más largo.

La formación de la valva exterior también está influenciada por la velocidad de las gotas de agua que atraviesan la interfaz LS/OS, un paso relacionado con la densidad y viscosidad de las tres fases30. Las diferencias de densidad siempre deben seguir el orden: IS > OS > LS. Esto es esencial para permitir primero la sedimentación de las gotas de IS hacia la interfaz LS/OS, luego el cruce de la interfaz para su conversión en GUV y su sedimentación hacia el fondo del tubo. Aunque el proceso puede ocurrir espontáneamente incluso cuando se usa agua desionizada como IS y OS23, se introdujo una diferencia de densidad entre IS y OS para favorecer la formación de GUV31. El par más común para este propósito es la sacarosa en el IS y la glucosa en el OS: a concentraciones equiosmolares requeridas para evitar daños en los GUV en formación debido al estrés osmótico, la sacarosa proporciona una solución más densa que la glucosa. Debido a que la diferencia de densidad aumenta con la osmolaridad de estas soluciones, el rendimiento de los GUV varía en consecuencia, sin que se observe ninguna mejora adicional más allá de 600 mOsm13.

Las condiciones óptimas de centrifugación están estrechamente relacionadas con la densidad y viscosidad de las tres fases y la difusividad de los fosfolípidos. En ausencia de una caracterización completa de las tres fases, se deben examinar múltiples condiciones. A partir de pruebas cualitativas (Figura 4E y Figura 5) y análisis sistemáticos preliminares17, fue posible definir buenas condiciones de centrifugación para las dos muestras descritas en este protocolo; Sin embargo, la calidad de las muestras está abierta a mejorar si se examinan más condiciones. Cuando el equilibrio entre la difusividad de los fosfolípidos en el LS y la densidad y viscosidad de las tres fases no se mantiene adecuadamente, los fosfolípidos carecen de tiempo suficiente para equilibrarse en la interfaz LS/OS y reorganizarse correctamente a medida que las gotas de agua se mueven hacia el OS. Esto a menudo conduce a la formación de un precipitado blanquecino en o justo debajo de la interfaz, que probablemente consiste en fosfolípidos y otras moléculas en fase oleosa arrastradas por gotas que no se ensamblan en GUV durante la centrifugación.

La encapsulación de una solución homogénea puede ser impulsada aumentando la densidad del IS mientras se preserva un equilibrio osmótico con el OS (como para el par sacarosa-glucosa), pero la encapsulación de una dispersión de micropartículas requiere que la densidad de la fase acuosa coincida con la de las micropartículas32. La eficiencia de la encapsulación de la carga también se ve afectada por la composición química de la solución/dispersión de la carga. Informes anteriores mostraron un efecto negativo en el rendimiento de GUV causado por muchos haluros metálicos alcalinos33 o variaciones de pH13, muy probablemente debido a interacciones o cambios en la carga neta de las cabezas hidrofílicas zwitteriónicas de fosfolípidos. Por lo tanto, la encapsulación de reacciones biológicas (como la síntesis enzimática o de proteínas libres de células) a menudo requiere un compromiso, ya que el pH y las concentraciones de sal (como KCl o NaCl) deben ajustarse a niveles que no son óptimos para la reacción en sí. No obstante, incluso las mezclas de reacciones complejas, como la síntesis de proteínas libres de células, pueden modificarse para proporcionar células artificiales funcionales basadas en GUV34.

Desde un punto de vista práctico, aunque el método de transferencia de gotas ofrece un proceso muy sencillo, la recuperación de GUV desde el sistema operativo puede plantear algunas limitaciones. Para ayudar a eliminar el aceite de la fase superior después del paso de centrifugación, es posible aprovechar dos puntas de pipeta para una extracción más fina (paso del protocolo 3.1.1) o un matraz Buchner para una extracción más rápida cuando se preparan varias muestras (paso del protocolo 3.1.2). Sin embargo, dado que el aceite no se elimina por completo, es necesario realizar un paso de lavado para obtener una dispersión GUV limpia (paso 3.2 del protocolo). Aunque los pasos de lavado dieron como resultado la eliminación efectiva de las gotas de aceite residual sin una pérdida apreciable de GUV (Figura 4A, B), este paso puede ser menos sencillo con aceite altamente viscoso y puede llevar mucho tiempo cuando se preparan múltiples formulaciones de GUV. Se describió un método alternativo para evitar la eliminación de aceite y recuperar el GUV del fondo del tubo a través de un orificio perforado con la ayuda de una aguja35. Sin embargo, este proceso puede no permitir una recuperación completa del gránulo GUV si el tubo no se perfora en la posición adecuada y, además, es potencialmente dañino para el operador.

Para ayudar a la recuperación de GUV, presentamos aquí un enfoque nuevo y simple para eliminar rápidamente la fase oleosa. Esto se basa en atrapar la fase de aceite superior menos densa en una punta de pipeta tapada para que, después de la centrifugación, la punta se pueda eliminar de tal manera que no gotee líquido. Esta sencilla estrategia permite una eliminación rápida y sencilla de toda la fase oleosa a la vez, simplificando constantemente este paso que requiere mucho tiempo.

Para evaluar la eficiencia del protocolo, se han implementado algunos métodos para la detección automática de GUV para acelerar el conteo y el análisis de distribución de tamaños. El etiquetado de GUV con sondas fluorescentes proporciona una estrategia simple y efectiva aplicada tanto a la citometría de flujo36,37 como a las imágenes de microscopio combinadas con algoritmos de detección de círculos 13,37,38,39. Más recientemente, se están explorando herramientas basadas en IA para la detección de objetos para mejorar este proceso40,41. Sin embargo, los tintes fluorescentes pueden afectar potencialmente las propiedades de GUV, introduciendo así artefactos en el análisis. Si se excluye la señal fluorescente detectable, la microscopía sigue siendo la opción más confiable, siendo la microscopía de contraste de fase el método preferido para una visualización óptima18 y la aplicación de algoritmos de detección de círculos38.

Alternativamente, es posible explotar las propiedades peculiares de formulaciones específicas para estrategias de detección únicas. Hadorn et al., por ejemplo, aprovecharon la presencia de electrolitos en IS para detectar GUV con un contador de celdas basado en impedancia33. Cuando ninguno de estos métodos automatizados o específicos de la formulación es factible, la anotación manual de círculos sigue siendo una alternativa universalmente aplicable. En tales casos, ImageJ ofrece una herramienta práctica para acelerar el proceso y extraer fácilmente las mediciones de diámetro bruto como se describe en este protocolo.

A pesar de la amplia adopción del método de transferencia de gotas, se dedica poca atención a los procesos de optimización necesarios para las nuevas formulaciones de GUV. En este trabajo, recopilamos la información disponible de la literatura para implementar un protocolo sistemático para dirigir y simplificar esta optimización. Esta guía práctica considera los principios subyacentes involucrados en la producción de nuevas formulaciones de GUV y en la recuperación de una muestra mínimamente contaminada con aceite, un aspecto del protocolo que a menudo se pasa por alto13,14. Si bien no es posible predecir la optimización que requiere cualquier formulación de GUV, esta guía proporciona consejos e información útiles para acelerar la implementación de nuevos GUV, lo que podría conducir a aplicaciones que incluyen células artificiales y microrobots.

Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estos resultados se enmarcan en el proyecto CELLOIDS (Cell-inspired particle-based intelligent microrobots) que ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención nº 948590). Este trabajo fue apoyado en parte por la Comisión Europea a través del proyecto NextGenerationEU BRIEF. Agradecemos a Michele Ibrahimi por el apoyo técnico en la instalación de la cámara de guantes y por la útil discusión sobre la implementación del contenedor para la fácil eliminación del aceite.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.22 µ M Membrana de ésteres de celulosa mixta filtros de jeringaMerckSLGSVR255F
Tubos de 1,5 mlBioclase06.0279.00
100 μ Jeringa de vidrio LMerck20737
Vaso de precipitados de 150 mlAvantor 213-1123Al menos 3
Viales de vidrio oscuro ND24 de 20 mlAvantor 548-9001A
Tubos de 2 mlBioclase07.3534.99
Cilindro de 50 mlAvantor 612-3843
500 μ Jeringa de vidrio LHamilton549-1166
Tubo Falcon de 50 mlMerckCLS352070
Jeringa de 50 ml Fisher Scientific8SS50L1
Tubos de 5 mlGreiner bio-one622201
Vaso de precipitados de 600 mlAvantor 213-1126
Bü Matraz ChnerMerckZ740682
Anillos de corcho para matraces de fondo redondoAvantor 217-1000
CristalizadorDutscherModelo 080474A
D-(+)-GlucosaSigma-AldrichG8270
D-(+)-SacarosaSigma-AldrichS9378
Termohigrómetro digitalBohlenderV1863-07
DOPCInvestigación Avanti850375C
PerforarDremel4000
Sal disódica de erioglaucina (Azul Brillante FCF)Sigma-Aldrich861146
Aguja de jeringa G18TerumoAN1838R1
Aguja de jeringa G21TerumoAN2138R1
Cámara de guantesBel-ArteF50030-0000Si está disponible, se puede usar una guantera, pero en laboratorios con bajos niveles de humedad puede que no sea necesario
Agitador magnético de placa calienteMaterial de laboratorio LLG6.263 448
Aceite mineral ligeroSigma-Aldrich330779
Nueva coccinaSigma-Aldrich199737
Junta tórica de caucho de nitrilo, diámetro exterior de 8 mm, diámetro exterior de 12 mmRS196-4863
Tapones de rosca abiertos con tabique ND24Avantor 548-0031A
Micropipeta P1000Fisher Scientific12346132
Micropipeta P10000Avantor 89079-978
Micropipeta P200Fisher Scientific12326132
Toallas de papelAvantor KIMB6657
ParafilmAvantor 291-1214
Puntas de pipeta (1000)Eppendorf0030000919
Puntas de pipeta (10000)Eppendorf0030000765
Puntas de pipeta (200)Eppendorf0030000870
Partículas de poliestireno, 1.1 µ mSigma-AldrichLB11-1ML
Tapa de gomaBioclass S.r.l.12.2300.05
Junta cónica de gomaAvantor 217-0211
Tapones de rosca  ND24Avantor 548-0161A
Aceite de silicona AR20Sigma-Aldrich10836
Tubo de silicona (diámetro interno 1,6 mm, diámetro externo 3 mm)RS667-8441
Tubo de silicona (diámetro interno 6 mm, diámetro externo 12 mm)RS273-2541Al menos 6 m
Cruce de tres víasRS795-405
Cruce de dos víasRS419-7287
Válvula de dos víasClaber91280
Agua ultrapuraThermo Fisher Scientific 22934Cuando esté disponible, este producto se puede reemplazar con agua purificada a través de los sistemas Milli-Q
Tijeras universalesBochem4154

Referencias

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