Artículo de método

Modelo de ratón optimizado para inducir cáncer de colon asociado a colitis utilizando azoximetano y sulfato de dextrano sódico para estudios de inmunología tumoral y terapia

DOI:

10.3791/68351

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25 de julio de 2025

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

En este artículo

Resumen

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El cáncer de colon asociado a colitis inducida por azoximetano (AOM)/sulfato de dextrano sódico (DSS) es un enfoque establecido y rentable para modelar tumores autóctonos del intestino grueso en ratones. Presentamos un protocolo actualizado y discutimos consideraciones críticas para la optimización de la dosis de DSS específica del sexo y la contribución del microbioma para el rigor, la robustez y la reproducibilidad.

Resumen

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El azoximetano (AOM, un agente que daña el ADN) y el sulfato de dextrano sódico (DSS, un agente promotor de la colitis) pueden inducir tumores en el intestino grueso de ratones con alta penetrancia. El modelo de cáncer de colon asociado a colitis murina (CAC) inducido por AOM / DSS se erige como un estándar de oro en la investigación del cáncer de colon relacionado con la inflamación, dada su precisión en la recapitulación de las características clínicas del CAC humano. Las ventajas del modelo incluyen su origen y desarrollo a partir de tejido endógeno, competencia inmune que preserva un repertorio completo de interacciones tumor-inmune, adaptabilidad a numerosas cepas de ratones, conveniencia de una latencia de 3 meses y costos relativamente bajos. A pesar de estas ventajas, varios desafíos limitan la efectividad del protocolo. La variabilidad en la dosis de DSS y en la penetrancia tumoral entre los estudios conduce a observaciones inconsistentes. Además, las variaciones en la microbiota intestinal contribuyen a una mayor variabilidad experimental, lo que afecta negativamente al poder estadístico. Las diferencias de sexo en respuesta a la OMA/DSS complican aún más la interpretación de los resultados. Además, la variabilidad de lote a lote de DSS dificulta la reproducibilidad de los hallazgos. Abordar estos desafíos es crucial para mejorar la confiabilidad y aplicabilidad de este modelo en la investigación preclínica. Para resolver esto, utilizando ratones C57BL / 6J como modelo, refinamos el protocolo establecido con estrategias para una optimización efectiva para mejorar la reproducibilidad y la armonización entre estudios. Entre ellas se incluyen recomendaciones para la titulación de la dosis de DSS en ratones machos y hembras, la implementación de la homogeneización de la microbiota antes de cada ciclo de DSS para mitigar la heterogeneidad de la flora intestinal de jaula a jaula. Estos pasos redujeron significativamente la variabilidad y mejoraron la reproducibilidad, lo que resultó en una sólida inducción de CAC. Reconociendo el papel fundamental de la inflamación y los mecanismos inmunológicos celulares en el desarrollo de CAC, el protocolo también describe los procedimientos de procesamiento tisular adecuados para el aislamiento de ARN o proteína y para perfilar citoquinas inflamatorias de tumores de colon y tejido de colon circundante. En última instancia, el uso de este método garantiza una producción de CAC más rigurosa, robusta y reproducible.

Introducción

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El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en todo el mundo y una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer 1,2. En comparación con el CCR esporádico, el cáncer colorrectal asociado a colitis (CAC) surge como resultado de un daño intestinal prolongado y repetido en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII)3,4, se caracteriza por un mayor grado maligno y una tendencia a la presentación multifocal a una edad más temprana. Debido a estos factores, el CAC generalmente requiere un tratamiento más agresivo con resultados clínicos menos favorables5. Aunque el CAC se considera una entidad distinta debido, al menos en parte, al momento único de adquisición de mutaciones y al papel desmesurado de los mecanismos inmunitarios inflamatorios y el microbioma, el CAC y el CCR esporádico comparten muchas similitudes con respecto a los paisajes genómicos generales y las características patogénicas. Para avanzar en nuestra comprensión del CCR en general y del CAC en particular, y para mejorar las estrategias terapéuticas, son esenciales modelos preclínicos sólidos.

Entre los diversos modelos utilizados para estudiar el CCR, el modelo CAC inducido por AOM/DSS es el más ampliamente adoptado y se considera el estándar de oro actual 6,7. Iniciado con una fuerte agresión mutagénica administrada por la OMA, este modelo se basa en episodios repetidos de colitis inducidos por DSS que imitan de cerca la EII humana, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, que son factores de riesgo bien establecidos para CAC8. El modelo AOM/DSS ofrece varias ventajas clave sobre otros enfoques in vivo. A diferencia de los métodos que se basan en la inyección de material exógeno iniciador del cáncer para establecer tumores de flanco o incluso ortotópicos, el CAC inducido por AOM / DSS es autóctono, lo que significa que el inicio del tumor ocurre endógenamente y la progresión del cáncer se desarrolla en el microambiente del tejido nativo, lo que refleja más de cerca su biología e historia natural. A diferencia de los xenoinjertos de líneas celulares humanas o de material derivado de pacientes que solo se pueden cultivar en ratones inmunocomprometidos, es inmunocompetente, lo que permite el estudio de las interacciones cáncer-inmune. A diferencia de los modelos genéticamente modificados que producen tumores con impulsores genéticos específicos, es agnóstico a mutaciones predefinidas, lo que permite un modelado más amplio de las vías de señalización del cáncer y los mecanismos de educación inmunológica. Finalmente, el modelo AOM / DSS se puede adaptar fácilmente a muchas cepas diferentes de ratones, eliminando la necesidad de esquemas de reproducción prolongados, lo que lo hace rentable y de tiempo a largo plazo. Sin embargo, factores como el sexo animal, la dosis de DSS y las diferencias en la microbiota intestinal pueden introducir variabilidad, afectando a la reproducibilidad y complicando su aplicación en la investigación traslacional.

Nuestro objetivo fue refinar este protocolo para mitigar el impacto de estos factores que sustentan las inconsistencias en la extensión de la inflamación del colon y la tumorigénesis CAC. Existe una variabilidad significativa en las concentraciones de DSS utilizadas para inducir inflamación aguda, colitis o inflamación crónica, y CAC 9,10. DSS es un polímero y el peso molecular promedio puede variar entre lotes y fabricantes, lo que afecta la variabilidad en los resultados experimentales. Por lo tanto, es esencial probar cada lote de DSS para garantizar la coherencia entre los estudios. Además, el alcance de la inflamación inducida por DSS está altamente influenciado por el microbioma intestinal, que puede diferir significativamente entre las instalaciones de ratones en todo el mundo, e incluso entre diferentes lugares de retención y colonias dentro de la misma institución11,12. Esta variabilidad en la composición microbiana puede afectar los resultados del modelo y contribuir a resultados inconsistentes13. El co-alojamiento de animales de los diferentes grupos experimentales, siempre que sea posible, es fundamental para disminuir la variabilidad, pero puede no ser suficiente para abordar este factor de confusión, ya que las comunidades microbianas experimentan una deriva estocástica con el tiempo y conducen a efectos de jaula en modelos de inflamación crónica14. Dado que el protocolo AOM/DSS implica un tratamiento a largo plazo para mantener la inflamación crónica, implementamos la homogeneización de la microbiota mezclando periódicamente la ropa de cama de todas las jaulas que albergan animales tratados con AOM/DSS. Esta práctica ayuda a homogeneizar el entorno de la microbiota, lo que reduce la variabilidad experimental. Además, las observaciones indican que los efectos del SDS pueden variar según el sexo animal15,16, lo que puede conducir a respuestas diferenciales en la inflamación y el desarrollo del cáncer. Refinamos el protocolo existente titulando DSS en ratones hembra y macho por separado para elegir una dosis adecuada de DSS para ambos sexos, asegurando resultados más uniformes y proporcionando entradas críticas para los cálculos de potencia estadística para determinar los tamaños de muestra óptimos en ratones machos y hembras.

En general, para mejorar la reproducibilidad del modelo AOM/DSS, describimos un conjunto estandarizado de pautas de protocolo que tienen en cuenta y mitigan estos factores de confusión. Empleamos técnicas de homogeneización del microbioma, así como describimos el ajuste preciso de la dosis de DSS para lograr resultados más consistentes y reproducibles, mejorando así la utilidad del modelo AOM/DSS y la armonización entre diferentes estudios. Nuestro protocolo se destaca por demostrar una variabilidad reducida de las jaulas homogeneizadas por microbiota y proporciona instrucciones claras paso a paso para implementar estas prácticas de reproducibilidad. Como resultado, la menor variabilidad dentro del grupo efectuada por estos refinamientos del protocolo conduce a una reducción en el tamaño de la muestra necesaria para lograr el poder estadístico deseado en la detección de diferencias entre grupos experimentales. Este protocolo optimizado está diseñado para investigadores que pretenden adaptar el modelo AOM/DSS a sus propios modelos de ratón y diseños experimentales, independientemente de la cepa o el género, para estudiar los mecanismos de tumorigénesis, las dianas terapéuticas o la exploración de la dinámica de las células inmunitarias.

Protocolo

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Todos los procedimientos con animales deben llevarse a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado institucionalmente para garantizar un manejo humano y el cumplimiento de las normas éticas. Los estudios descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida (IACUC).

1. Optimización de la dosificación de DSS

  1. Obtener ratones de la edad, cepa y fuente para ser utilizados en el experimento principal, con una distribución equitativa de machos y hembras. Etiquete cada ratón por punzón en la oreja, marca de cola u otro método aprobado para el seguimiento individual. Mida y registre el peso corporal inicial de cada animal.
    NOTA: Los ratones machos deben alojarse antes del destete y no deben redistribuirse entre jaulas para minimizar las peleas.
  2. Si usa riego automático, una semana antes de comenzar un experimento, cambie a los animales a botellas de agua y bloquee simultáneamente las boquillas de la jaula (tubos de sorbo de metal en la jaula) con tapones estériles.
    NOTA: Asegúrese de que cualquier cambio en el suministro de agua, como las boquillas de agua potable automatizadas bloqueadas, sea aprobado por IACUC o el organismo regulador apropiado que supervise el uso humanitario de los animales. Las jaulas para animales pueden requerir controles diarios para garantizar el acceso ininterrumpido al agua potable.
  3. Prepare la solución de DSS disolviendo DSS en agua potable estéril esterilizada en autoclave a concentraciones variadas de 1,5% a 5% (p/v), utilizando una barra de agitación magnética y una placa de agitación. Espere 30 minutos a temperatura ambiente para que el polvo DSS se disuelva completamente en agua. Prepare el agua DSS fresca cada semana y guárdela a 4 °C hasta por una semana.
  4. Llene dos tubos cónicos de 50 ml con agua DSS en cada concentración (uno para hombres y otro para mujeres) y conecte de forma segura una boquilla para beber estéril esterilizada en autoclave para evitar fugas.
  5. Administre agua DSS en cada concentración a ratones hembra y macho, con 3 ratones en cada jaula recibiendo la misma concentración. Use agua potable estéril sin DSS como control negativo. Reemplace el agua DSS cada dos días.
  6. Administre agua DSS durante 7 días. Registre el peso corporal de cada ratón diariamente.
  7. El día 8, vuelva a cambiar todos los animales al agua potable normal.
  8. El día 8, evalúe la gravedad de la diarrea en función de la consistencia de las heces utilizando un sistema de puntuación estandarizado como se describe17 y registre las puntuaciones. Puntúe "1" como gránulos de heces blandos pero aún formados, "2" como gránulos de heces muy blandos y "3" como diarrea.
  9. El día 8, recolecte 2-3 gránulos de heces frescas y evalúe la presencia de sangre oculta (consulte la Tabla de materiales). Registre la presencia o ausencia de sangre en la muestra.
  10. Evalúe el sangrado intestinal en función de una combinación de dos criterios de puntuación, consistencia de las heces (0-3) y presencia de sangre en las heces (0-3), para una puntuación total que oscila entre 0 y 6.
  11. Desde el día 9 hasta el día 12, registre el peso corporal de cada ratón diariamente y controle de cerca a los animales tratados con DSS para detectar una pérdida significativa de peso corporal y diarrea severa. Sacrificar rápidamente a los animales que alcancen o superen los criterios de valoración humanitarios mediante asfixia por dióxido de carbono (CO2) u otro método apropiado según el protocolo de uso animal aprobado y las pautas éticas establecidas.
  12. Desde el día 13 hasta el día 18, continúe monitoreando a los animales y registre el peso corporal de cada ratón diariamente hasta que se recupere por completo a los niveles previos al experimento.
  13. Determine la concentración óptima de DSS, como la que resulta en una pérdida de peso corporal de aproximadamente el 20% acompañada de heces blandas pero aún formadas. La dosis óptima de DSS puede variar entre machos y hembras, cepas de ratones, edades, lotes de DSS e instalaciones para animales.

2. Inducción CAC

  1. Día 0-6: Tratamiento de OMA Día 7-28: 1er ciclo de tratamiento DSS
    1. Preparación de la pasta de AOM: Disuelva el polvo de AOM en solución salina estéril para lograr una concentración de 10 mg/ml. Filtre la solución a través de un filtro de 0,45 μm, distribuya alícuotas de 1 ml en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y guárdela a -80 °C durante un año.
      NOTA: La OMA es un carcinógeno volátil y debe manipularse con precaución bajo una campana de bioseguridad con el equipo de protección personal (EPP) adecuado, siguiendo las recomendaciones de seguridad del fabricante. La OMA y cualquier material contaminado con OMA deben eliminarse de acuerdo con los protocolos de eliminación de desechos químicos peligrosos de la institución. Es responsabilidad del investigador obtener las aprobaciones necesarias de salud y seguridad ambiental con anticipación.
    2. Si usa riego automatizado en jaulas, 1 semana antes del inicio del experimento, bloquee la boquilla de agua potable automatizada y cambie a los animales a botellas de agua para aclimatarlos como en el paso 1.2.
    3. El día 0, pese y registre el peso corporal de cada ratón para calcular la cantidad total requerida de AOM. A continuación, calcule el volumen total de OMA (1 mg/ml de concentración final de trabajo) en función del peso de cada animal para lograr una dosis de 10 mg/kg, por ejemplo, 200 μl para un ratón de 20 g.
    4. Descongele el número requerido de nuevas alícuotas de 10 mg/ml de AOM en hielo antes de cada uso. Diluya cada alícuota de 1 ml de OMA con 9 ml de solución salina estéril para lograr una concentración de trabajo de 1 mg/ml.
    5. Administrar AOM a ratones mediante inyección intraperitoneal. Realice este procedimiento dentro de un gabinete de bioseguridad mientras usa el EPP adecuado, como guantes dobles y una máscara N95 para una protección óptima.
      PRECAUCIÓN: Deseche cualquier solución AOM sobrante de acuerdo con los requisitos de eliminación de desechos químicos peligrosos.
    6. El día 3, transfiera los animales tratados con OMA a jaulas limpias. Use el EPP adecuado cuando manipule jaulas contaminadas con AOM y otros materiales para protegerse.
      PRECAUCIÓN: Deseche la ropa de cama sucia de la jaula y cualquier alimento sobrante de acuerdo con los procedimientos de eliminación de desechos químicos peligrosos aprobados por la institución.
      NOTA: La OMA y sus metabolitos se excretan completamente a las 72 h después de la administración18, momento en el que se puede eliminar la ropa de cama sucia de la jaula.
    7. El día 7, realice la homogeneización de la microbiota intestinal para minimizar la variabilidad de una jaula a otra. Para hacer esto, muestree el 25% de la ropa de cama de cada jaula, mezcle bien y vuelva a distribuirla en cada jaula.
      NOTA: Absténgase de cambiar de jaula durante la semana de tratamiento con DSS y durante cinco días después. Coordine con el servicio de cambio de jaulas de cría de la instalación, según sea necesario.
    8. Inicie la inducción de la colitis proporcionando DSS en agua potable utilizando tubos cónicos de 50 ml equipados con boquillas adecuadas. Revise a los ratones diariamente para confirmar que los animales tengan acceso sin restricciones al agua del DSS. Reemplace el agua DSS cada dos días. Registre el peso corporal de cada ratón diariamente.
    9. El día 14, reemplace el agua DSS con botellas de agua potable normales. Continúe monitoreando de cerca a los animales para detectar dolor y angustia.
    10. En los días 14-19, pese cada ratón diariamente. Eutanasiar a los animales que pierden más del 25% de su peso corporal, o si un animal alcanza cualquiera de los criterios de valoración humanitarios descritos en el protocolo aprobado de cuidado y uso de animales. Además, controle y registre cualquier caso de sangrado rectal.
  2. Día 7-28: 1er ciclo de tratamiento DSS
    1. El día 7, realice la homogeneización de la microbiota intestinal para minimizar la variabilidad de una jaula a otra. Para hacer esto, muestree el 25% de la ropa de cama de cada jaula, mezcle bien y vuelva a distribuirla en cada jaula.
      NOTA: Absténgase de cambiar de jaula durante la semana de tratamiento con DSS y durante cinco días después. Coordine con el servicio de cambio de jaulas de cría de la instalación, según sea necesario.
    2. Inicie la inducción de la colitis proporcionando DSS en agua potable utilizando tubos cónicos de 50 ml equipados con boquillas adecuadas. Revise a los ratones diariamente para confirmar que los animales tengan acceso sin restricciones al agua del DSS. Reemplace el agua DSS cada dos días. Registre el peso corporal de cada ratón diariamente.
    3. El día 14, reemplace el agua DSS con botellas de agua potable normales. Continúe monitoreando de cerca a los animales para detectar dolor y angustia.
    4. En los días 14-19, pese cada ratón diariamente. Eutanasiar a los animales que pierden más del 25% de su peso corporal, o si un animal alcanza cualquiera de los criterios de valoración humanitarios descritos en el protocolo aprobado de cuidado y uso de animales. Además, controle y registre cualquier caso de sangrado rectal.
  3. Día 29-49: 2º ciclo de tratamiento DSS
    1. Repita la homogeneización de la microbiota junto con la administración de DSS, siguiendo los mismos procedimientos que en los pasos 2.2.1-2.2.4. Opcional: Después del segundo y/o tercer ciclo de DSS, realice una colonoscopia como se describió anteriormente19.
  4. Día 50-70:3er ciclo de tratamiento DSS
    1. Repita la homogeneización de la microbiota junto con la administración de DSS, siguiendo los mismos procedimientos que en los pasos 2.2.1-2.2.4. Como los ratones tienden a perder más peso tres días después del tercer ciclo de DSS, controle de cerca a todos los animales para detectar una pérdida excesiva de peso corporal o cualquier indicación de sangrado rectal durante este período y proporcione comida húmeda para cuidados de apoyo si está indicado.

3. Evaluación de la gravedad de la colitis y la patología macroscópica del CAC

  1. El día 70, recolecte 2-3 gránulos fecales frescos de cada ratón para detectar la presencia de sangre oculta y / o marcadores de inflamación como lipocalina-220 para evaluar la gravedad de la colitis. Utilice los reactivos/kits adecuados (consulte la lista de materiales y equipos) y siga las instrucciones del fabricante para realizar los ensayos, que se describen brevemente a continuación.
  2. Para preparar muestras fecales para la evaluación de los niveles de lipocalina-2 del marcador de inflamación, coloque gránulos de heces frescas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Disuelva los gránulos en 1 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) utilizando un mezclador de vórtice hasta lograr una solución uniforme. Centrifugar la solución a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante puede utilizarse inmediatamente para la lipocalina-2 ELISA o almacenarse a -80 °C para su uso posterior.
  3. Realice ELISA de lipocalina-2 de ratón según las instrucciones del fabricante del kit. Ejecute experimentos piloto de dilución en serie para determinar la dilución óptima de las muestras fecales en relación con los estándares.
    NOTA: Se espera que los niveles de lipocalina-2 aumenten al menos 1000 veces en ratones tratados con DSS en comparación con los animales de control tratados con agua20.
  4. Evalúe la gravedad de la colitis utilizando un sistema de puntuación de diarrea17 como se describe en los pasos 1.8-1.10.
  5. El día 70, sacrificar a los animales por asfixia con CO2 o utilizando cualquier otro método humanitario aprobado.
  6. Rocíe el área abdominal de cada animal con etanol al 70% para minimizar la contaminación durante los pasos posteriores.
  7. Use pinzas quirúrgicas finas para levantar la piel y la capa peritoneal. Hacer una incisión horizontal con unas tijeras para exponer la cavidad abdominal.
  8. Tire del intestino delgado hacia afuera e identifique el ciego. Levante suavemente el ciego y el colon con fórceps. Diseccionar cuidadosamente el colon cortando el mesenterio y la vasculatura asociada con unas tijeras, evitando perforar o cortar el colon.
  9. Cortar el hueso pélvico y la piel que rodea el área rectal-anal para exponer el colon distal completo. Es importante diseccionar todo el colon con la parte distal intacta, ya que la mayoría de los tumores suelen ocurrir en esta región.
  10. Coloque el colon diseccionado en una tira limpia de papel de filtro, enderezándolo suavemente.
  11. Mide la longitud de los dos puntos con una regla y documéntala con una fotografía. Incluya la regla en la fotografía para la escala.
  12. Limpie los parches de Peyer en el exterior del colon, teniendo cuidado de no perforar el tejido.
  13. Enjuague el colon en PBS estéril frío.
  14. Asegure una punta de micropipeta de 200 μl (sin filtro) en una jeringa de 3 ml con una película de parafina. Utilice esta configuración para llenar la jeringa con PBS estéril, inserte la punta de la pipeta en la luz del colon y enjuague suavemente el contenido del colon 2-3 veces, asegurando la eliminación completa de los gránulos de heces.
  15. Estira suavemente los dos puntos sobre una tira de papel de filtro limpia y prehumedecida. Corta los dos puntos longitudinalmente y colócalos sobre el papel de filtro.
  16. Identificar tumores más grandes, que generalmente se presentan como ampollas prominentes que sobresalen de la pared del colon con una apariencia inflamada y roja.
  17. Para tumores más pequeños, tenga precaución adicional durante la identificación. Utilice un asa de siembra bacteriana estéril para sondear suavemente la superficie del colon en busca de irregularidades o protuberancias. Confirme que las protuberancias detectadas no sean restos de ganglios linfáticos o vasos sanguíneos ubicados en el exterior de la pared del colon.
  18. Use calibradores digitales para medir el ancho y el largo de cada tumor.
  19. Registre el recuento de tumores y el tamaño y la ubicación de cada tumor en un mapa de colon preimpreso.

4. Evaluación histológica

  1. Use dos pares de fórceps de punta fina para agarrar ambos extremos laterales del colon distal. Enrolle el colon desde el extremo distal hasta el extremo proximal en forma de rollo suizo como se describe en otra parte21. Asegúrese de que el extremo distal esté en el centro del rollo y que el extremo proximal forme la capa más externa.
  2. Asegure cada colon enrollado en Suiza con una aguja de 271/2-G.
  3. Coloque cada colon enrollado en Suiza asegurado en un casete de tejido debidamente etiquetado.
  4. Sumerja los casetes de tejido que contienen colones laminados suizos en paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS estéril. Deje que los tejidos permanezcan en el fijador durante 24 h.
  5. Después de 24 h, transfiera los tejidos a etanol al 70%. Los tejidos se pueden mantener en etanol al 70% a 4 °C hasta por tres meses.
  6. El rollo suizo se puede utilizar para múltiples exámenes histopatológicos, incluida la tinción convencional de hematoxilina y eosina (H&E), inmunohistoquímica e inmunofluorescencia.

5. Recolección de tejido para el aislamiento de proteínas y ARN de tumores y el colon circundante

  1. Trabaje en hielo y use tubos y reactivos preenfriados para preservar la integridad del material biológico.
  2. Después de la evaluación del tumor, diseccione los tumores y recójalos en tubos preenfriados y premarcados con el tampón adecuado (consulte a continuación) en hielo. Dependiendo del diseño experimental, agrupe todos los tumores del mismo animal o procéselos individualmente. Si lo desea, recolecte de manera similar ~ 1 cm de trozos de tejido de colon circundante no tumoral.
  3. Aislamiento de proteínas
    1. Agregue 0,5 ml de perlas de vidrio de molienda de 800 μm y 400 μl de tampón de lisis (NP-40 al 1% en NaCl 150 mM con Tris-HCl 20 mM (pH 7,5) y un cóctel de inhibidor de proteasa y fosfatasa al 1% en cada tubo de homogeneización tisular y transfiera el tejido del colon/tumor a cada tubo.
    2. Homogeneice el tejido de colon/tumor con un homogeneizador de tejido a base de perlas a 6 M/S durante 30 s, repita dos veces para una homogeneización completa.
      NOTA: Coloque los tubos en hielo entre ciclos para evitar el sobrecalentamiento de la muestra por homogeneización mecánica.
    3. Después de la homogeneización, aspire 150 μL del lisado (sobrenadante) y transfiéralo a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml.
    4. Centrifugar el lisado a 10.000 g a 4 °C para granular cualquier material insoluble. Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio si lo desea.
    5. Cuantifique la concentración total de proteínas mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) u otro método apropiado.
    6. Si lo desea, ajuste la concentración total de proteínas a 4 mg/ml para cada muestra con el mismo tampón de lisis.
    7. Use lisados de proteínas inmediatamente para ensayos posteriores, como inmunotransferencia o análisis de citocinas, o guárdelos a -80 ° C para su uso posterior.
  4. Purificación de ARN:
    1. Después de la disección, coloque el colon / tumores en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y sumérjalos en 200 μl de reactivo de preservación de ARN apropiado.
      NOTA: Punto de pausa: el tejido fresco del colon/tumor puede congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C para su posterior procesamiento
    2. Descongele el tejido del colon/tumor en hielo.
    3. Transfiera el colon/tumor a un tubo de homogeneización tisular que contenga 500 μl de tampón de lisis adecuado para el aislamiento de ARN y 200 μl de perlas de vidrio de molienda.
    4. Homogeneizar con un homogeneizador de tejidos a base de perlas a 6 M/S durante 30 s tres veces, con un descanso de dos minutos entre cada ciclo.
      NOTA: Transfiera el tubo en hielo entre ciclos para evitar que la degradación del ARN se sobrecaliente durante la homogeneización mecánica.
    5. Transfiera 300 μL de lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    6. Aísle el ARN total utilizando el procedimiento de purificación de ARN apropiado según sea necesario. Mida la concentración, pureza y calidad/integridad del ARN según corresponda para su uso posterior.

Resultados

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Realizamos la optimización de la dosis de DSS para nuestras condiciones experimentales. La dosificación de DSS debe recalibrarse para cada animalario, cepa de ratón, diseño de estudio y lote de DSS. Para este estudio, los ratones C57BL / 6J se alojaron en un vivero específico libre de patógenos en jaulas ventiladas con una dieta para roedores de 18% de proteína estándar irradiada ad libitum . Tanto los ratones machos como las hembras comienzan a perder peso a partir del día 5 después de haber sido colocados en agua DSS, alcanzando su peso más bajo tres días después de la retirada de DSS (Figura 1A, C). En el día de la mayor pérdida de peso, los ratones machos exhibieron aproximadamente un 15% de pérdida de peso, mientras que las hembras mostraron una pérdida de peso de aproximadamente el 20% (Figura 1B, D). Con base en estos resultados, determinamos que la dosis óptima para nuestras condiciones experimentales específicas era del 3,0% para las mujeres y del 3,25% para los hombres. El programa de tratamiento para AOM/DSS se describe en la Figura 2A, con la homogeneización del microbioma al comienzo de cada ciclo de tratamiento con DSS hasta que concluye el experimento para mitigar los efectos y la variabilidad de la jaula. La dinámica típica de la pérdida de peso y la recuperación de los animales durante toda la duración del experimento se muestra en la Figura 2B. Los animales recuperan completamente el peso corporal original dentro de las dos semanas posteriores a la interrupción de la administración de DSS. Un modelo de colitis DSS bien calibrado da como resultado gránulos de heces blandas pero aún formadas en lugar de diarrea (puntuación de consistencia de las heces 1-2), con detección ocasional de sangre oculta en las heces indicativa de sangrado subclínico y pocos casos de sangre visible en las heces (puntuación de presencia de sangre 1-2)17. Para evaluar aún más la gravedad de la colitis, se recolectaron muestras fecales para analizar los niveles del marcador inflamatorio lipocalina-2. La presencia de sangre oculta no se detectó en ratones que recibieron agua potable regular durante todo el experimento, a diferencia de los animales tratados con DSS (Figura 2C). Consistentemente, los niveles de lipocalina-2 se elevaron aproximadamente 1,000 veces en ratones tratados con AOM / DSS en comparación con los controles de AOM / solo agua (Figura 2D).

En el punto final, diseccionamos los colones y contamos los tumores utilizando un mapa de registro tumoral (Figura 3A). La colitis DSS da como resultado una longitud de colon significativamente más corta, a diferencia de los controles AOM / solo agua (Figura 3B). Además, los animales tratados con AOM / DSS desarrollan tumores de colon visibles, la mayoría de los cuales se forman en el extremo distal (Figura 3C). El examen histológico de las secciones de colon teñidas con H&E reveló erosión de células epiteliales significativa, infiltración inmune y ulceración en ratones AOM / DSS (Figura 4A). La gravedad de la histopatología del colon se puede cuantificar utilizando sistemas de puntuación establecidos para el CAC murino inducido por DSS, basados en cuatro parámetros (Figura 4B): infiltración inmune y edema (0-3), ulceración (0-3), morfología epitelial colónica (0-4) y neoplasias (0-4)22,23,24. Los resultados de tales evaluaciones, tal como se aplican a los ejemplos de histología en la Figura 4A, se presentan en la Figura 4C. La proliferación epitelial del colon se evaluó mediante análisis inmunohistoquímico mediante tinción Ki67, lo que demuestra que el tratamiento con DSS promueve la proliferación de células epiteliales del colon. Además, las secciones de colon se pueden utilizar para la tinción inmunofluorescente de varios marcadores, como el marcador de angiogénesis CD31 (Figura 4D, E).

Además, evaluamos los efectos de la homogeneización de la microbiota en criterios de valoración experimentales, como la magnitud de la inflamación colónica, la pérdida de peso corporal y la carga tumoral acumulada en cada animal. Un grupo de ratones se alojó en jaulas que se sometieron a mezcla y redistribución de ropa de cama sucia el día 0 para lograr la homogeneización de la microbiota, junto con animales de control en jaulas en las que se omitió esta manipulación. Los animales de ambos grupos recibieron 2,5% de agua DSS durante 7 días. Si bien los niveles promedio del marcador inflamatorio lipocalina-2 en heces por jaula el día 8 no difirieron significativamente entre los grupos (prueba t de Welch), observamos una variabilidad significativamente menor entre los puntos de datos en las jaulas que se sometieron a homogeneización de la microbiota (Figura 5A, prueba F de Welch para comparar varianzas, p<0.0001). Consistentemente, para el día 8, todos los animales exhibieron un grado similar de pérdida de peso corporal en comparación con la línea de base del día 0. Sin embargo, los ratones del grupo de homogeneización de la microbiota mostraron menos variabilidad en la pérdida de peso corporal en comparación con el grupo de control (Figura 5B). Además, en un protocolo de inducción de CAC de 10 semanas (Figura 2A) con (homogeneización de la microbiota) y sin mezcla de lecho de jaula (control) antes de cada ciclo de DSS, la carga tumoral acumulada por ratón fue más consistente en el grupo homogeneizado de microbiota en comparación con los controles que fueron significativamente más variables (Figura 5C). En general, estos datos proporcionan pruebas sólidas de que la homogeneización de la microbiota mejora considerablemente la robustez y la reproducibilidad del modelo AOM/DSS.

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Figura 1. Titulación de dosis de DSS en ratones machos y hembras. (A-D) Porcentaje de cambio de peso corporal en comparación con el día 0 en ratones de tipo salvaje machos (A, B) y hembras (C, D) de 14 semanas de edad mantenidos en agua con concentraciones indicadas de DSS (1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% para machos y 2%, 3%, 4% para hembras). (A, C) A los animales se les administró DSS durante 7 días y se controló la pérdida de peso corporal hasta 12 días. B y D muestran pérdida de peso corporal de ratones machos en el día 8 (B) y ratones hembra en el día 9 (D) desde el inicio del tratamiento con DSS. Los datos se presentan como promedios ± SEM; n = 3 en A y B, n = 4 en C y D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Cronología y monitorización del CAC inducido por AOM/DSS. (A) Cronología experimental CAC inducida por AOM/DSS. (B) Peso corporal en relación con el día 0 en ratones experimentales de tipo salvaje C57BL / 6J hembra tratados con AOM / DSS (rojo) o control (solo AOM, sin DSS, negro). Todos los animales recibieron una dosis de AOM (10 mg / kg) y fueron asignados al azar a tres ciclos de DSS al 3% (rojo) o agua potable normal (control, negro) durante un total de 70 días. Los datos se presentan como promedios ± SEM, n = 2 y 11. (C) Prueba de hemocción fecal de ratones hembra de control (solo OMA) o tratados con DSS (AOM y 1.5% DSS). (D) Niveles fecales de lipocalina-2 de 6 ratones hembra de control (solo OMA, negro) o 35 tratados (OMA y 1,5% de DSS, rojo) en el día 70. Los datos se presentan como promedios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Valoración macroscópica de colones. (A) Ejemplo de un mapa de registro tumoral. (B) Imágenes representativas del colon de ratones hembra de control (solo OMA) o tratados con DSS (OMA y DSS al 1,5%) en el día 70. El acortamiento de la longitud del colon indica una mayor inflamación en los animales tratados con DSS. Barra - 5 mm; , p=0,002, prueba de suma de rangos de Mann-Whitney; n=12 y 30. (C) Imágenes representativas de patología macroscópica de colones con tumores en el día 70 de ratones hembra tratados con AOM y DSS al 3% (los tumores están rodeados con un círculo y marcados con triángulos negros). Barra - 5 mm. Llamada: vista ampliada de las regiones distales del colon con tumores; barra - 1 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Evaluación histológica del CAC. (A) Secciones representativas teñidas con H&E de colones laminados suizos de ratones tratados con AOM / DSS y control (solo AOM) en el día 70 con regiones distales agrandadas de 3 animales que se muestran a la derecha. Los dos puntos de control muestran una organización intacta de la cripta colónica. Los colones de los ratones tratados con AOM/DSS se caracterizan por engrosamiento de la submucosa (puntas de flecha), infiltración inmune (flechas), interrupción o pérdida de la arquitectura de la cripta (estrella), erosión de la capa epitelial, hiperplasia epitelial o epitelio displásico (círculos) con adenoma y formación de adenocarcinoma (delineado por una línea punteada). Bar - 500 μm. (B) Sistema de puntuación histopatológica utilizado para evaluar la gravedad del fenotipo CAC. (C) Ejemplo de puntuaciones histológicas de colon de ratones tratados con AOM solo o AOM / DSS que se muestran en A. (D) Tinción inmunohistoquímica representativa para el marcador de proliferación Ki67 en colones laminados suizos de animales tratados con OMA después de 1 o 3 ciclos de DSS. Las células proliferantes positivas para Ki67 (marrones) se localizan en el fondo de las criptas colónicas, pero se extienden hacia arriba e invaden el interior de las criptas con iniciación de CAC y patología más avanzada. Barra - 100 μm. (E). Tinción inmunofluorescente representativa que evalúa la vascularización basada en el marcador endotelial CD31 (rojo) y contrateñida con DAPI para visualizar núcleos (azul) en secciones de colon de ratones tratados con AOM/DSS. Barra - 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. La homogeneización de la microbiota reduce la variabilidad en la inflamación del colon y la carga tumoral CAC. (A) Niveles promedio de lipocalina-2 fecal en ratones tratados con 2.5% de DSS el día 8. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Welch para comparar los niveles promedio de lipocalina-2 fecal entre los dos grupos (p = 0,137, n = 6 y 12 jaulas). Además, se realizó una prueba F sobre varianzas, que arrojó un valor p de 0,0001, lo que indica diferencias significativas en la varianza entre los dos grupos. (B) Pérdida de peso corporal promedio en animales tratados con AOM / DSS que recibieron agua DSS el día 8. Si bien la pérdida de peso corporal promedio entre los dos grupos no es significativamente diferente ( prueba t de Welch, p = 0.194, n = 6 y 12), la varianza dentro de los grupos es significativamente diferente (prueba F, p = 0.027). (C) Carga tumoral por ratón después de 10 semanas de tratamiento con AOM / DSS. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Welch para evaluar las diferencias en la carga tumoral promedio entre los grupos (p = 0,211, n = 8 y 18) y una prueba F para evaluar la diferencia entre las varianzas (p = 0,013). (A-C) Los gráficos de violín azul representan el grupo que se sometió a homogeneización de la microbiota, mientras que los gráficos de violín verde representan el grupo de control (sin homogeneización de la microbiota), ns - no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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El protocolo AOM/DSS fue introducido por primera vez en 1996 por Okayasu et al.25 y desde entonces ha sido reconocido como un excelente modelo para imitar fielmente el inicio y la progresión del cáncer de colon desde el tejido normal hasta los cambios adenomatosos y, en última instancia, el carcinoma, como lo demostraron Suzuki et al. en 200626, especialmente en el contexto de la inflamación colónica. Estudios posteriores evaluaron los efectos de AOM y AOM / DSS en diferentes cepas de ratón, así como el impacto de las diferentes duraciones del tratamiento en el fenotipo tumoral y la penetrancia 26,27,28. En 2018, Christopher Williams y su grupo publicaron un protocoloactualizado 29 que sentó una base crucial para el desarrollo de esta metodología. Los avances recientes han demostrado aún más la utilidad del modelo AOM/DSS para los estudios de la inmunidad de la mucosa mediante la integración de métodos para el aislamiento de infiltrados inmunes intestinales y el inmunofenotipado mediante citometría de flujo30.

Una de las principales fortalezas del protocolo AOM / DSS es la fácil adaptabilidad a prácticamente cualquier cepa de ratones, lo que impulsa la investigación de los efectos de diferentes antecedentes genéticos. Por lo tanto, Suzuki et al. compararon la susceptibilidad a la carcinogénesis de colon inducida por AOM / DSS en cuatro cepas de ratón diferentes utilizando la penetrancia del adenoma de colon como lectura, con los siguientes resultados: BALB / c > C57BL / 6N > DBA / 2N = C3H / HeN26. Estudios adicionales encontraron que los ratones FVB/N desarrollan tumores de colon más fácilmente después del tratamiento repetido con AOM en comparación con las cepas C57BL/6J y 129/SvJ27. En particular, se informó el desarrollo de adenocarcinoma de colon bien diferenciado con una penetrancia de casi el 100% en ratones FVB/N en un protocolo de inducción de CAC de AOM/DSS de 10 semanas31. Estos hallazgos sugieren colectivamente que las diferentes cepas de ratón pueden no ser igualmente susceptibles al tratamiento AOM/DSS, lo que contribuye a las variaciones en la tumorigénesis y destaca aún más la necesidad de un conjunto consistente de pautas para la armonización y reproducibilidad del protocolo AOM/DSS en cepas de ratón, instalaciones de alojamiento y otras variables. Entre ellos, la variabilidad significativa en el microbioma intestinal dificulta la reproducibilidad de los estudios centrados en la inflamación y la penetrancia tumoral 9,10. Específicamente, la composición del microbioma intestinal, incluidas las especies Duncaniella muricolitica y Alistipes okayasuensis, puede tener un impacto descomunal en la gravedad de la colitis por DSS13. Otro estudio destacó la importancia de la composición de la microbiota en la inducción de CAC al demostrar que los ratones deficientes en NLRP3 exhibían un fenotipo de colitis exacerbada caracterizado por una mayor presencia de los filos bacterianos Bacteroidetes (específicamente Prevotellaceae) y TM710.

A pesar de la popularidad del método, los protocolos AOM/DSS existentes no han abordado el importante problema de la alta variabilidad observada entre los animales dentro de los grupos experimentales32. Para hacer frente a este desafío, presentamos un conjunto de recomendaciones para la optimización y armonización del protocolo mediante la implementación de la titulación DSS (teniendo en cuenta el sexo animal) y la homogeneización de la microbiota. Nuestro enfoque tiene como objetivo reducir la variabilidad y mejorar la reproducibilidad del modelo AOM/DSS en cepas animales, diseños experimentales y criterios de valoración. Si bien no podemos proporcionar recomendaciones específicas con respecto a los tamaños de muestra, el número de réplicas experimentales se guiará por el diseño específico del estudio y los tamaños de efecto esperados para cada experimento. La menor variabilidad dentro del grupo lograda por estos refinamientos requiere menos animales en cada condición para lograr el mismo poder estadístico en la detección de estas diferencias. Anticipamos que estas mejoras promoverán aún más el uso ético de los animales, la administración responsable de los fondos de investigación y la reducción de la mano de obra, lo que conducirá a una mayor eficiencia.

El modelo AOM/DSS tiene un valor traslacional significativo en el estudio del cáncer colorrectal asociado a la colitis humana. Dados los desafíos de modelar el CCR humano debido a su etiología compleja, es importante enfatizar que, aunque el modelo AOM/DSS podría proporcionar algunos conocimientos sobre la patogénesis del CCR esporádico, es más apropiado para estudios sobre la neoplasia maligna asociada a la inflamación. Además, el cáncer inducido por AOM/DSS tiene una baja incidencia de metástasis33,34 y, por lo tanto, es inapropiado para estudiar la diseminación metastásica. A pesar de estas limitaciones, el modelo AOM/DSS es altamente penetrante, confiable, demuestra histopatología relevante para humanos e imita con precisión la progresión de la enfermedad de inflamación a displasia y adenocarcinoma, todo sin dejar de ser rentable. En este protocolo, proporcionamos recomendaciones para generar resultados reproducibles y minimizar los factores de confusión basados en los flujos de trabajo existentes 8,35.

La identificación de la dosis óptima de DSS a través de experimentos piloto de dosis-respuesta, teniendo en cuenta el sexo animal como una variable biológica 16,36,37, es el primer paso crítico hacia el establecimiento de un protocolo robusto de AOM/DSS (Figura 1). Encontramos que el tratamiento con DSS al 3% durante 7 días resultó en una disminución más significativa del peso corporal en las mujeres (~ 20%) en comparación con los hombres (~ 15%) (Figura 1B, D). Sin embargo, los ratones machos pueden ser más, menos o igualmente sensibles al DSS en comparación con las hembras. Esto puede atribuirse a diferentes cepas de ratones y variaciones en la composición del microbioma intestinal en las instalaciones de animales, lo que requiere un reajuste de la concentración de DSS adaptado a cada conjunto específico de experimentos. La concentración óptima de DSS es una compensación entre maximizar la inflamación del colon y la inducción tumoral sin exceder la toxicidad tolerable. En nuestra experiencia, lo más probable es que este equilibrio se logre con dosis de DSS, lo que resulta en una pérdida de peso corporal de aproximadamente el 20% después del primer ciclo. Los animales tienden a perder menos peso en el segundo ciclo de tratamiento, pero generalmente se observa una mayor reducción del peso corporal en el tercer ciclo de DSS, potencialmente debido a la formación de tumores en el colon. Por lo tanto, la pérdida de peso corporal del 25% puede adoptarse como un punto final humanitario para los protocolos institucionales de uso de animales. Además, la colitis por DSS bien calibrada da da como resultado gránulos de heces blandas pero aún formadas en lugar de diarrea y pruebas hemoccult positivas ocasionales, pero pocos casos de rastros de sangre visibles en las heces, y se espera que los animales se recuperen por completo dentro de las dos semanas posteriores al cese de la administración de DSS.

DSS es un polímero con un peso molecular que oscila entre 36.000 y 50.000 Da. Debido a la variabilidad de lote a lote en la fabricación de DSS, es esencial realizar experimentos de recalibración de dosis de DSS para cada nuevo lote del producto. Para mantener la consistencia, es práctico estimar la cantidad total de DSS necesaria para que todo el estudio se compre en el mismo lote. Además, este protocolo también describe los pasos para estandarizar la composición de la microbiota en toda la cohorte experimental de ratones durante la inducción de CAC, mitigando así los posibles efectos de la jaula para reducir la variabilidad. Como precaución adicional para minimizar los efectos de la jaula, se recomienda que los animales de diferentes grupos experimentales sean alojados en el mismo lugar siempre que sea posible. Dependiendo de los objetivos experimentales específicos y las políticas éticas de uso de animales, estas consideraciones deben reflejarse en experimentos piloto. La deriva de la microbiota también puede precipitarse por cambios en el lecho en una jaula húmeda con botellas de agua con fugas. Es mejor abstenerse de cambiar de jaula durante la administración de DSS y durante cinco días después. El uso de tubos de 50 ml para la administración de agua DSS reduce el riesgo de fugas y minimiza el desperdicio de DSS. Estas consideraciones logísticas pueden requerir una estrecha colaboración entre el personal de investigación y los técnicos de cuidado de animales que realizan servicios de cambio de jaulas y cría.

En este protocolo, también proporcionamos un flujo de trabajo básico para la recolección de tejidos y células, así como para la recopilación de datos. Esto incluye pruebas para detectar la presencia de sangre oculta (Figura 2C) y mapear tumores (Figura 3A). El modelo AOM/DSS es adecuado para ratones inmunocompetentes, lo que lo convierte en un sistema ideal para explorar el microambiente inmunitario tumoral debido al sistema inmunitario completamente intacto38,39, en contraste con los enfoques de xenoinjerto. En particular, es susceptible a la perturbación experimental del sistema inmunológico o los componentes del estroma, ya sea a través de un sistema Genético Cre-Lox para knock-ins / outs de genes específicos del tipo de célula o casetes reporteros, o injerto o agotamiento de poblaciones celulares específicas. Como ejemplo, al combinar el modelo AOM / DSS con el trasplante de médula ósea, investigamos previamente cómo las mutaciones en el sistema hematopoyético modulan la gravedad y la carga de CAC40. Para ayudar en tales estudios, existen excelentes métodos publicados para aislar leucocitos infiltrantes tumorales viables adecuados para análisis adicionales, como inmunofenotipado, ensayos funcionales y multiómica unicelular41. Finalmente, debido a la alta penetrancia y la latencia constante, el modelo AOM / DSS es adecuado para estudios terapéuticos preclínicos que utilizan la carga tumoral total como lectura primaria.

Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado en parte por los premios NIH R01 DK121831 (OAG) y R01 AI067846 (DA). OAG también recibió el apoyo de la Fundación Edward P Evans y la Fundación de la Familia Oxnard. DA cuenta con el apoyo del premio Merit Society. UFHCC es un centro oncológico designado por el NCI (P30 CA247796).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Polvo de azoximetanoSigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586Carcinógeno para inducir tumores de colon
Microcentrífuga de sobremesaNA  NAPara la preparación de muestras 
Ratones C57BL/6JLaboratory000664Cepa y edad según corresponda para cada estudio específico
Tubos cónicos, 50 mLFisher14955239Para administrar agua DSS
Sulfato de sodio de dextrano sal de sodio, MW ca 40,000Cayman Chemical 23250Inducir la inflexión del colon
Etanol, 70%Fisher 43655223Para desinfectar superficies de trabajo y herramientas de disección
Molienda de perlas de vidrio, 800 µ m VWR12621-148Para facilitar la homogeneización del tejido de colon/tumor
HemoCue America  Kit de prueba de sangre oculta en heces Hemoccult ICT Immunochemical Beckman CoulterHemoCue America 395065ACatálogo No.23280010Para la detección de sangre oculta en heces Jeringa de
insulina 27GX5/8 1CC BD 3294-12Para inyecciones de AOM
Bloqueador LixitNANAPara bloquear el suministro automático de agua a las jaulas de ratones, si está presente (proporcionado por el animalario, estéril).
Barra de agitación magnética y placa de agitaciónNANAPara disolver DSS 
Homogeneizador de microtubos, BeadBlaster 24 BenchmarkD2400Para homogeneizar colon/tumor
Ratón Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISAR& DSystems Catálogo No.DY1857Para detectar la lipocalina-2 a partir de muestras fecales
Solución NP-40, 10%Thermo Fisher Scientific85124Para lisis tumor/tejido de colon
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCAThermo Fisher ScientificA65453Para cuantificar la concentración de proteínas en lisados tisulares totales, o cualquier otro método apropiado
Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatoFisherPI78440Preparar muestras para el análisis de citoquinas/proteínas 
Tampón RLTplusQiagen1053393Para aislar el ARN, o cualquier otro método apropiado de aislamiento de ARN
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021Para preservar muestras de tejido antes del aislamiento de ARN
Kit de micropreparación RNeasyQIAGEN74004Para aislar ARN u otro método de aislamiento y purificación de ARN según corresponda
Boquilla de botella de agua para roedores (30 mm)VisiónTipo EPara administrar agua o solución DSS
Tijeras y pinzas estérilesNANAPara disección de tejidos
Agujas de jeringa, 27G x 1/2 pulgada de longitud (cortas)BD 305109Para la fijación de tejido de rollo suizo de colon 
Jeringas, Luer lock, 3 mLBD·nbsp;309657Para enjuagar los colones antes de la disección y la estadificación
TapeStationAgilentPara la concentración de ARN y la evaluación de la calidad/integridad
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15Dieta estándar para roedores, 18% de proteína, irradiada
Casete de tejidoVWR#87002-472Para preservar la muestra para su inclusión
Balanza de laboratorio de carga superior, 0-220 gNANAPara pesar animales
Whatman Blotting PaperVWR InternationalCat# 28298-020Para estadificación colones disecados para patología macroscópica y recuento de tumores
Jackson

Referencias

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Modelo de azoximetano y DSSc ncer de colon en ratonesc ncer relacionado con la inflamaci nhomogenizaci n de la microbiotatitulaci n de la dosis de DSSratones C57BL 6Jperfil de citocinasprocesamiento de tejidos
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