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Artículo de método

Preparación automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940 en un módulo de síntesis para la obtención de imágenes PET del microambiente tumoral

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DOI:

10.3791/68356

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25 de abril de 2025

 ,  ,  , 
1Nuclear medicine department, Institut régional du Cancer de Montpellier (ICM), University of Montpellier, 2IBMM, University of Montpellier, CNRS, ENSCM

En este artículo

Resumen

Esta investigación describe el proceso automatizado para la producción de [68Ga]Ga-3BP-3940 con el sintetizador GAIA V2, para la obtención de imágenes PET de la proteína de activación de fibroblastos. También se presentan los resultados de las pruebas de control de calidad realizadas en tres lotes de ensayo.

Resumen

Se ha desarrollado un método rápido y eficiente en el módulo de síntesis GAIA para el radiomarcaje automatizado de galio-68 de 3BP-3940, una sonda de imagen molecular dirigida a la proteína de activación de fibroblastos para la tomografía por emisión de positrones del microambiente tumoral. Las condiciones de reacción incluyeron tampón acetato (concentración final: 0,1 M), metionina como agente antirradiólisis (concentración final: 5,4 mg/mL) y 30 μg de 3BP-3940, con calentamiento durante 8 min a 98 °C. Fue necesario un paso final de purificación en un cartucho C18 para obtener un producto radiomarcado de alta pureza. Por el contrario, el generador de 68Ga se utilizó directamente sin un paso de concentración en un cartucho de intercambio catiónico. La producción de tres lotes de validación confirmó la fiabilidad del método, permitiendo la síntesis de [68Ga]Ga-3BP-3940 en 22,3 ± 0,6 min con alta pureza radioquímica (RCP), determinada tanto por radio-HPLC (99,1% ± 0,1%) como por radio-TLC (99,2% ± 0,1%). El rendimiento radioquímico promedio, basado en los valores de RCP medidos por radio-HPLC, fue del 74,4% ± del 3,3%. La estabilidad del producto radiomarcado se demostró hasta 4 h después de la preparación. Este protocolo proporciona una metodología fiable, rápida y eficiente para la preparación de [68Ga]Ga-3BP-3940, que puede trasladarse fácilmente a un entorno clínico.

Introducción

En los últimos años, el tratamiento del microambiente tumoral (TME) ha atraído un interés considerable en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas1. La abundancia de tipos de células, moléculas de señalización y macromoléculas de matriz extracelular (MEC) dentro del TME ofrece una amplia gama de posibles objetivos moleculares2. Entre las células huésped residentes e infiltrantes, los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) forman un subconjunto distinto de fibroblastos dentro de la TME, fenotípicamente diferente de los fibroblastos normales. Los CAF desempeñan un papel crucial en la progresión tumoral, la metástasis, la evasión inmunitaria y la resistencia a la terapia a través de características celulares y moleculares únicas3. Estas células mesenquimales exhiben un fenotipo activado marcado por la expresión de la proteína de activación de fibroblastos (FAP). Molecularmente, los CAF secretan una compleja matriz de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento (p. ej., TGF-β, IL-6 y CXCL12) y proteínas de la MEC (p. ej., colágeno, fibronectina), que remodelan la MEC y fomentan un entorno protumorigénico4.

Al ser una proteína altamente específica que se sobreexpresa y localiza en la superficie extracelular de la membrana de CAF, la FAP presenta todas las características de una diana molecular fiable, especialmente para aplicaciones de medicina nuclear y radiofármacos5. En este contexto, se desarrollaron e introdujeron rápidamente en el uso clínico inhibidores de la FAP basados en quinolina(FAPI), funcionalizados con un grupo DOTA 6,7,8. Específicamente, FAPI-04 y FAPI-46 radiomarcados con galio-68 (emisor de β+, t1/2 = 68 min) para imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) han demostrado un valor significativo en enfermedades fibróticas, cardiología y oncología 8,9, particularmente para cánceres donde [18F]fluorodesoxiglucosa ([18F]FDG) tiene una utilidad limitada10. Sin embargo, si bien sus contribuciones a la oncología y a la imagen de enfermedades no malignas son innegables, los FAPI de moléculas pequeñas exhiben ciertas limitaciones para las aplicaciones de terapia con radionúclidos dirigidos (TRT), particularmente debido a su tiempo de residencia intratumoral subóptimo, lo que puede conducir a la irradiación involuntaria del tejido sano11. Para abordar esta cuestión, se han explorado varias estrategias, como el diseño de ligandos polivalentes11,12 o el uso de radionucleidos terapéuticos con vidas medias cortas 13,14,15. También se han desarrollado nuevos andamios moleculares con una alta afinidad por la FAP y que desencadenan una alta proporción de internalización celular.

Uno de ellos es el derivado pseudopeptídico FAP-2286. Contiene una secuencia de 7 aminoácidos, ciclados y unidos a un quelante de DOTA por una fracción16 de 1,3,5-bencenotrimetanotiol. Un estudio inicial en humanos demostró que [68Ga]Ga-FAP-2286 exhibe un perfil de biodistribución similar al [68Ga]Ga-FAPI-46, con una absorción fisiológica ligeramente mayor en el hígado, los riñones y el corazón17. En este estudio, 64 pacientes, principalmente con cánceres de cuello, hígado, estómago, páncreas, ovarios y esófago, se sometieron a imágenes PET con [68Ga]Ga-FAP-2286 para la estadificación del cáncer o la detección de recurrencia: la captación de [68Ga]Ga-FAP-2286 fue notablemente mayor que la de [18F]FDG en tumores primarios, metástasis de ganglios linfáticos y metástasis a distancia, lo que mejoró el contraste de la imagen y la detectabilidad de la lesión. Todos los tumores primarios fueron visibles con [68Ga]Ga-FAP-2286 PET/CT, mientras que [18F]FDG PET/CT no detectó casi el 20 % de las lesiones. Para los ganglios linfáticos comprometidos, las tasas de detección fueron más altas con [68Ga]Ga-FAP-2286, así como para las metástasis óseas y viscerales. En otro estudio en un grupo más pequeño de 21 pacientes con una variedad de enfermedades cancerosas, también se demostró la excelente sensibilidad de este agente de imagen, lo que refleja la eficacia diagnóstica de [68Ga]Ga-FAP-228618. Estudios más específicos se han centrado en un único tipo de cáncer, como el urotelial o el de pulmón, destacando una vez más el alto potencial de [68Ga]Ga-FAP-2286 para la imagen molecular clínica 4,5. En cuanto al tratamiento, en un estudio preliminar se investigó el uso de FAP-2286 radiomarcado con lutecio-177 (emisor de β, t1/2 = 6,7 d) en 11 pacientes con diversos cánceres progresivos y metastásicos19. La mayoría de los pacientes recibieron dos ciclos de tratamiento espaciados por 8 semanas, y la dosis promedio administrada por ciclo fue de 5,8 ± 2,0 GBq de [177Lu]Lu-FAP-2286. El fármaco demostró una retención intratumoral prolongada, con una vida media efectiva de aproximadamente 44 h en las metástasis óseas. Dados los efectos secundarios aceptables, estos hallazgos allanaron el camino para ensayos clínicos a mayor escala: la seguridad y eficacia de [177Lu]Lu-FAP-2286 se están evaluando actualmente en el ensayo clínico de fase 1/2 LuMIERE, patrocinado por Novartis (NCT04939610)7,8. En la literatura se documentan otros protocolos de investigación de menor escala 9,20 y se han publicado múltiples reportes de casos 21,22,23,24,25,26, que demuestran la eficacia y excelente tolerabilidad de esta TRT.

Las mínimas modificaciones estructurales realizadas en el FAP-2286 condujeron al analógico optimizado 3BP-3940 (Figura 1)27. Aunque la literatura científica sobre esta molécula vectorial sigue siendo limitada, se han realizado estudios preliminares tanto para aplicaciones de imagen como terapéuticas. En un informe preliminar se describe el uso de [68Ga]Ga-3BP-3940 en 18 pacientes con varios carcinomas metastásicos terminales y se concluye que este radiofármaco es un agente de imagen PET adecuado, destacando su excelente relación tumor-fondo y su muy baja captación renal28. En otro trabajo, un solo paciente con cáncer de páncreas con metástasis hepáticas recibió 150 MBq de [68Ga]Ga-3BP-3940 para la PET, lo que demostró una intensa captación en el tumor primario y las lesiones metastásicas29. Posteriormente, el mismo paciente recibió una dosis única de 9,7 GBq de [177Lu]Lu-3BP-3940 para TRT. El tratamiento fue bien tolerado, sin cambios significativos en las constantes vitales ni en los parámetros biológicos. En un estudio diferente se presentaron los resultados iniciales en humanos de un abordaje teranóstico con 3BP-3940: los pacientes fueron seleccionados con imágenes PET de [68Ga]Ga-3BP-3940 y luego se les administró 3BP-3940 marcado con diferentes isótopos (177Lu, 90Y o 225Ac), administrados solos o en combinaciones en tándem (p. ej., 177Lu + 225Ac) en 1-5 ciclos de tratamiento30. Los resultados incluyeron una remisión completa, cuatro remisiones parciales, tres enfermedades estables y 12 progresiones de la enfermedad. La mediana de supervivencia global de la cohorte (n = 28) fue de 9 meses desde el inicio de la TRT.

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Figura 1: Estructura química de [68Ga]Ga-3BP-3940. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El proceso de radiomarcaje de 68Ga para radiofármacos experimentales como FAP-2286 y 3BP-3940 generalmente implica un módulo de síntesis para automatizar el paso de preparación. En particular, la automatización de métodos garantiza la solidez del proceso y el cumplimiento de las GMP y minimiza la exposición a la radiación del operador en comparación con los métodos de preparación manual 31,32,33. En muchos casos, las autoridades reguladoras esperan que dicho protocolo forme parte de un expediente de medicamento en investigación (IMPD) antes de autorizar a un centro a fabricar el radiofármaco experimental correspondiente34. Hasta la fecha, se dispone de muy poca información detallada sobre el radiomarcaje automatizado de 68Ga de pseudopéptidos anti-FAP en la literatura 29,35,36,37,38. Además, los datos reportados generalmente se aplican solo a un modelo dado de sintetizador. El tipo de generador de 68Ga utilizado también puede aportar ciertas especificidades, ya que las diferentes soluciones disponibles en el mercado se caracterizan por volúmenes específicos de eluido de 68Ga3+ en HCl (normalmente 0,1 M), lo que puede tener un impacto directo en las condiciones de radiomarcaje automatizado.

En este contexto, presentamos un protocolo detallado para el radiomarcaje automatizado rápido y eficiente del pseudopéptido 3BP-3940 con 68Ga, utilizando el módulo de síntesis GAIA V2. Este sintetizador se basa en el uso de un conjunto de tubos que comprende tres rampas de cinco colectores cada una, conectadas a una bomba peristáltica para controlar el flujo de fluido. También cuenta con un horno de vial para el calentamiento del medio de reacción, varias sondas de radiactividad y un sensor de presión para monitorear estos parámetros dentro del sistema. Aunque no está tan extendido como otros modelos, este autómata se utiliza de forma rutinaria en nuestro centro y está instalado en un número creciente de instalaciones 31,39,40,41,42,43,44. En este trabajo se utilizó un generador GALLIAD de 68Ge/68Ga sin prepurificación del eluido de 68Ga. Este método está diseñado para ofrecer una solución robusta, rápida y conveniente para la producción de [68Ga]Ga-3BP-3940, optimizando también la protección radiológica para los operadores durante el radiomarcado. Este es también el primer protocolo de preparación de este radiofármaco que se informa sobre este modelo de sintetizador específico, y con tanto detalle.

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Protocolo

NOTA: Este protocolo implica trabajar con radioisótopos. Cualquier persona que lleve a cabo este procedimiento debe estar debidamente capacitada en el manejo de materiales radiactivos no sellados y debe contar con la aprobación del oficial de seguridad radiológica de su institución. El sintetizador automatizado debe colocarse en una celda caliente blindada designada. Cualquier procedimiento manual que involucre materiales radiactivos también debe llevarse a cabo en una celda caliente blindada o detrás de un blindaje de radiación adecuado.

1. Preparación de reactivos

NOTA: Los reactivos necesarios para la producción automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940 (ver Tabla de Materiales) se prepararon en una unidad de preparación de radiofármacos (sala limpia de grado C GMP). Los reactivos se pueden preparar en cualquier orden y hasta 2 horas antes de la síntesis.

  1. Preparación de la solución tampón (acetato de sodio 0,8 M)
    1. Adquiera la siguiente materia prima: acetato de sodio trihidrato EMPROVE API Ph Eur, BP, JP, USP, FCC, E262.
    2. En un recipiente estéril (por ejemplo, tubo de microcentrífuga, 5 mL) correctamente identificado, pese una masa exacta de trihidrato de acetato de sodio cercana a 544,32 mg utilizando una balanza de precisión.
    3. Utilizando una micropipeta calibrada y conos estériles, solubilice el acetato de sodio en un volumen de agua para inyección (WFI) cercano a 5 mL para que el WFI sea como se describe a continuación.
      Volumen WFI = (masa tampón pesada x 5)/544,32
    4. Agite la solución en vórtice y pásela pasar por un baño ultrasónico (40 kHz, ~1 min) para facilitar la solubilización.
    5. Con una jeringa de 10 ml equipada con una aguja de 21 G, extraiga la solución tampón. Instale un filtro de 0,22 μm entre la jeringa y una aguja nueva, luego filtre la solución tampón directamente en un vial sellado estéril debidamente identificado (por ejemplo, TC-ELU 5) después de la desinfección de su tabique.
  2. Preparación de una solución compuesta antirradiólisis (metionina 10 mg/mL)
    1. Adquiera la siguiente materia prima: L-Metionina (Ph. Eur., USP) pura, grado farmacéutico.
    2. En un recipiente estéril (por ejemplo, tubo de microcentrífuga de 5 mL) correctamente identificado, pese una masa exacta de L-metionina cercana a 50 mg utilizando una balanza de precisión.
    3. Utilizando una micropipeta calibrada y conos estériles, solubilice la L-metionina en un volumen de WFI cercano a 5 mL para que el WFI sea como se describe a continuación.
      Volumen WFI = (masa tampón pesada x 5)/50
    4. Agite la solución en vórtice y pásela pasar por un baño ultrasónico (40 kHz, ~1 min) para facilitar la solubilización.
    5. Con una jeringa de 10 ml equipada con una aguja de 21 g, extraiga la solución de metionina. Instale un filtro de 0,22 μm entre la jeringa y la aguja nueva, luego filtre la solución directamente en un vial sellado estéril debidamente identificado (por ejemplo, TC-ELU 5, Curio) después de la desinfección de su tabique.

2. Preparación de equipos para controles de calidad

  1. Control del pH del producto final
    1. Detrás de un escudo protector adecuado, coloque una tira de papel de pH para el control posterior del producto final.
  2. Control de pureza radioquímica por radio-TLC
    1. Prepare dos tanques de migración TLC que contengan las fases móviles adecuadas. Fase móvil A: tampón de citrato 0,1 M pH 4 en agua, con Rf esperado = 0-0,2 para [68Ga]Ga-3BP-3940 y Rf = 0,8-1 para 68Ga3+ libre. Fase móvil B: tampón de acetato de amonio 1 M en una mezcla 1:1 de agua y metanol (v/v), con Rf esperado = 0-0,2 para los coloides de [68Ga]galio y Rf = 0,8-1 para [68Ga]Ga-3BP-3940.
    2. Detrás de un escudo protector adecuado, coloque los dos tanques de migración de TLC junto a dos placas iTLC-SG para el control posterior del RCP del producto final.
    3. Encienda el radiocromatógrafo y abra el software de adquisición asociado en el ordenador de mando. Introduzca previamente la información de identificación para el primer análisis que se va a realizar.
  3. Control de pureza radioquímica por radio-HPLC
    1. Compruebe que el modelo de columna necesario para el análisis (C18 ACE Equivalence) esté instalado en el sistema.
    2. Prepare la fase móvil fresca para HPLC, es decir, agua para HPLC + 0,1% de TFA (disolvente A) y acetonitrilo + 0,1% de TFA (disolvente B). Conecte las botellas de disolvente A y disolvente B a las líneas correspondientes de la radio-HPLC.
    3. Encienda la computadora operativa y conéctela al software de control.
    4. Si es necesario, abra la válvula de purga en el módulo de la bomba y purgue las líneas que se utilizarán para el análisis (es decir, la línea A y la línea B). Cierre la válvula de purga después de esta operación.
    5. Permita que el sistema se equilibre con una proporción de disolvente igual al inicio del gradiente (es decir, 95% A/5% B) con un flujo de 0,6 mL/min durante al menos 20 min. Para la secuencia de análisis de HPLC [68Ga]Ga-3BP-3940, utilice el caudal mantenido en 0,6 mL/min y programe el gradiente de fase móvil de 0,1% TFA en agua (A) a 0,1% TFA en acetonitrilo (B) de la siguiente manera: 0 - 1 min 95/5 A/B; Gradiente lineal de 1 a 8 min de 95/5 A/B a 60/40 A/B; 8 - 9 min 60/40 A/B; Gradiente lineal de 9 a 10 min de 60/40 A/B a 95/5 A/B; 10 - 12 min 95/5 A/B.
    6. Seleccione el método analítico con el gradiente de fase móvil descrito en el paso 2.3.5., luego introduzca previamente la información de identificación para el primer análisis que se realizará.
    7. En un recipiente blindado, prepare un vial de HPLC con un inserto de vidrio para recibir la muestra que se va a analizar y colóquela detrás de un escudo protector adecuado.

3. Preparación del módulo de síntesis

  1. Encienda la alimentación y la luz de la celda blindada. Encienda la computadora portátil que controla el sintetizador e inicie sesión en el software del módulo.
  2. Si es necesario, retire el kit viejo del sintetizador y deseche los desechos en los contenedores apropiados.
  3. Realice la limpieza del interior de la caja blindada que alberga el módulo de síntesis y del propio sintetizador de acuerdo con las normas de higiene aplicables.
  4. En el software del sintetizador, presione Usuario, luego seleccione un nombre de usuario e ingrese la contraseña asociada en la ventana emergente. Presione Método y seleccione el protocolo automatizado previamente configurado para la síntesis [68Ga]Ga-3BP-3940.
  5. Presione Preparación e ingrese el título de la síntesis, el número de lote del vector, el número de lote del kit de reactivos y cualquier comentario en el cuadro de texto correspondiente. También se puede configurar y seguir una lista de verificación con los distintos pasos de preparación del kit en esta etapa (Figura complementaria 1).

4. Preparación del casete de síntesis e instalación del casete

  1. Limpie el banco de trabajo del laboratorio de radiofarmacia con una toallita y el desinfectante detergente adecuado y coloque un paño estéril sobre el banco de trabajo.
  2. Obtenga un casete de etiquetado estéril [68Ga]Ga (referencia RT-01-H) y un kit de reactivos (Figura complementaria 2). Las 3 rampas del conjunto de tubos se identifican como A, B y C de izquierda a derecha en el módulo; los colectores de cada rampa están numerados del 1 al 5 de arriba a abajo (rampas A y C) o de izquierda a derecha (rampa B).
  3. Ensamble el casete siguiendo los pasos a continuación.
    1. Desenvuelva la envoltura del casete [68Ga]Ga, compruebe si hay algún daño y apriete cada conexión Luer del casete. Retire todas las tapas de las espigas.
    2. Con una jeringa Luer Lock de 5 mL y una aguja de 21G, extraiga 5 mL de absoluto de etanol del kit de reactivos y páselo muy lentamente sobre el cartucho C18 , luego extraiga 5 mL de WFI (no suministrado en el kit) y páselo muy lentamente sobre el mismo cartucho C18 para preacondicionarlo.
    3. Coloque la rampa A del conjunto de tubos en el módulo de síntesis y gire los dos pestillos para mantener la rampa en su lugar. Conecte el extremo libre del tubo vertical A1 a una aguja de 19G e insértelo en el vial de desechos.
    4. Añada una aguja de ventilación al vial de residuos y colóquelo hacia atrás, de forma óptima detrás del recipiente blindado que recibirá el vial de evacuación. Coloque un filtro de 0,22 μm en la posición A4.
    5. Conecte el tubo horizontal A1 al sensor de presión en la parte inferior izquierda del panel frontal del módulo.
    6. Con un adaptador macho/macho, conecte en posición horizontal A5 una extensión de 30 cm terminada por un filtro terminal de 0,22 μ y una aguja 20G de 80 mm.
    7. Inserte la aguja de 20G mencionada anteriormente en un vial de evacuación estéril y sellado (por ejemplo, TC-ELU 5), agregue una aguja de aireación y coloque el vial de evacuación en su recipiente blindado.
    8. Coloque la línea de tubería que conecta la vertical A1 con la vertical C1 detrás de los ganchos de retención por encima de la rampa B.
    9. Conecte los colectores horizontales A2 y B1 con una línea de extensión corta (ya sea no incluida en el kit, o la que inicialmente está conectada en la posición C5 horizontal), utilizando el adaptador ya montado en la posición A2.
    10. Coloque la rampa B en el módulo de síntesis y gire los dos pestillos para mantener la rampa en su lugar.
    11. Conecte el cartucho C18 preacondicionado a la posición C2 horizontal, manteniendo el adaptador que conecta la válvula B5 horizontal a C2 a su izquierda.
    12. Coloque la rampa C en el módulo de síntesis y gire los dos pestillos para mantener la rampa en su lugar.
    13. Con un adaptador macho/macho, conecte una línea de extensión de 50 cm desde la horizontal C5 al generador GALLIAD 68Ga.
    14. Coloque el vial de reacción de vidrieras del juego de tubos en el horno del módulo. Coloque con cuidado el tubo de la vertical A5 a la vertical C5 en la bomba peristáltica, cierre la bomba, verificando que el tubo esté correctamente colocado, y pase el tubo a través del sensor de actividad en el lado izquierdo de la bomba.
  4. Realice una comprobación intermedia para asegurarse de que el casete y el tubo están ensamblados en el radiosintetizador como se muestra en la Figura 2, sin reactivos todavía.

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Figura 2: Configuración del módulo de síntesis. (A) Configuración para la síntesis automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940 en el módulo de síntesis. (B) Detalles sobre las posiciones de reactivos para la producción automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940 utilizando un módulo de síntesis GAIA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Instalación de reactivos

  1. Una vez que se hayan instalado las rampas en el módulo, instale los reactivos como se describe a continuación.
    1. Conecte la bolsa WFI de 250 ml del kit de reactivos al tubo C4 mediante el adaptador Spike y cuelgue la bolsa en el gancho dedicado en el lado derecho del módulo.
    2. Con una jeringa Luer Lock de tres piezas de 3 mL equipada con una aguja de 20 G, extraiga 1,5 mL de la solución de L-metionina 10 mg/mL preparada anteriormente, conecte la jeringa al tubo horizontal C1 y cuelgue la jeringa en la ranura dedicada en el lado derecho del módulo. Deje aproximadamente 2 ml de aire entre la superficie del líquido y el sello del émbolo de la jeringa para garantizar una transferencia completa del líquido.
    3. Utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de 20 G, extraiga 750 μL de la solución de L-metionina de 10 mg/mL previamente preparada e inyecte en el vial de NaCl al 0,9% (engarce azul) del kit de reactivos, después de la desinfección del tabique.
    4. Con una jeringa Luer Lock de tres piezas de 10 ml con una aguja de 20 g, extraiga el contenido del vial de NaCl + L-metionina al 0,9 % (engarce azul), ajústelo a 8,6 ml, retire la espiga en la posición B4 y, a continuación, conecte la jeringa en B4. Deje aproximadamente 2 ml de aire entre la superficie del líquido y el sello del émbolo de la jeringa para garantizar una transferencia completa del líquido.
    5. Con una jeringa Luer Lock de tres piezas de 3 ml con una aguja de 20 g, extraiga el contenido del vial de etanol al 60% (engarzado naranja) después de desinfectar el tabique. Compruebe que el volumen sea al menos igual a 1,5 ml, retire el pico en la posición B5 y, a continuación, conecte la jeringa a B5. Deje aproximadamente 2 ml de aire entre la superficie del líquido y el sello del émbolo de la jeringa para garantizar una transferencia completa del líquido.
    6. Utilizando una jeringa de 1 mL de bajo volumen muerto con una aguja de 20 G, extraer 0,25 mL de la solución tampón de acetato de sodio de 0,8 M previamente preparada e inyectar en el vial que contiene 30 μg de 3BP-3940 para solubilizarlo mediante ciclos sucesivos de inyecciones/reaspiraciones. Extraiga la solución de 0,25 ml en la misma jeringa, desconecte la aguja y coloque la jeringa tampón + vectorial en B3. Deje aproximadamente 0,25 ml de aire entre la superficie del líquido y el émbolo de la jeringa para garantizar una transferencia completa del líquido.
  2. Realice una comprobación final antes del inicio de la síntesis como se describe a continuación.
    1. Verifique que todos los reactivos estén conectados al casete o tubo, como se muestra en la Figura 3.
    2. Asegúrese de que cada una de las conexiones del kit esté lo suficientemente apretada. Asegúrese de que ningún tubo esté apretado o en ángulo.
  3. El sistema está listo. Cierre el panel frontal y encienda la ventilación de la celda blindada.

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Figura 3: Configuración del kit. Instalación final del conjunto de tubos y reactivos en el sintetizador para el radiomarcaje de 3BP-3940 con 68Ga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Secuencia de radiomarcaje automatizada para la producción de [68Ga]Ga-3BP-3940

  1. Haga clic en Ejecutar síntesis cuando todos los reactivos estén colocados en las rampas y toda la información se registre correctamente en el software.
  2. Un perfil típico de la distribución de la radiactividad en el conjunto de tubos a lo largo de la secuencia de síntesis se muestra en Figura 4. Siga los pasos sucesivos del método automatizado para preparar [68Ga]Ga-3BP-3940 como se describe a continuación.
    1. Pruebas de integridad del kit: después de una breve purga del tubo hacia el vial de residuos (esencialmente para eliminar cualquier resto de líquido en el cartucho de C18 ), el sistema aumenta su presión interna abriendo A4 y bombeando aire filtrado a través de la bomba peristáltica. Tan pronto como el sensor de presión conectado a A1 detecta una presión de tubería > 1500 mbar, el sistema se cierra y la bomba peristáltica se detiene. Si la caída de presión no supera los 400 mbar durante 15 s, evalúe que la prueba de integridad del kit ha sido exitosa y comience la síntesis. Si la prueba falla, sospeche de una fuga del sistema y aborte la secuencia de síntesis.
    2. Adición de vector al vial de reacción: Asegúrese de que el 3BP-3940 solubilizado en la solución tampón se introduzca en el vial de reacción en aproximadamente 30 s, a través del colector B2.
    3. Adición de L-metionina al vial de reacción: Asegúrese de que la solución de metionina contenida en la jeringa en C1 se transfiera al vial de reacción a través del colector B2, bajando por la rampa C y luego subiendo la rampa A para ramificarse en la rampa B por el colector A2.
    4. Activación del cartucho C18 con WFI: Asegúrese de que el WFI contenido en la bolsa en C4 pase sobre el cartucho C18 , también enjuagando las rampas A, B y C en los caminos seguidos por las soluciones vectorial y de metionina. A continuación, las mismas rutas se enjuagan con aire filtrado para garantizar que no quede agua en la tubería para los pasos siguientes.
    5. Elución del generador en vial de reacción (intervención manual): Para eluir el generador GALLIAD, gire la perilla verde en la parte superior del generador a 90° hasta la posición de carga antes de esperar 10-20 s: este tiempo permite que el generador prepare un volumen de eluido fijo de 1,1 mL. Regrese la perilla verde a su posición inicial y haga clic en el prompter en el software de control. A continuación, la bomba peristáltica extrae el eluido de 68Ga en el vial de reacción durante un periodo de 3 minutos. Durante este intervalo de tiempo, la temperatura del vial de reacción se eleva gradualmente a 60 °C durante 1 min, luego a 90 °C durante 2 min, para alcanzar la temperatura establecida para el paso de radiomarcaje más rápidamente.
    6. Radiomarcado: Compruebe que al inicio de la etapa de radiomarcaje se aplique una temperatura de consigna de 120 °C durante 30 s para permitir un calentamiento rápido y eficiente. Compruebe que la temperatura de consigna se ajusta a 98 °C durante 2 minutos. Debido al calentamiento y al aumento de presión en el vial de reacción, parte del medio de reacción tiende a fluir de regreso hacia el tubo conectado a B2. Para limitar esto, se establece una purga de línea de 10 segundos después de 2 minutos de calentamiento; A continuación, el radiomarcaje continúa durante unos 5,5 minutos.
    7. Atrapamiento en el cartucho C18 : Asegúrese de que el aire filtrado sea bombeado al recipiente de reacción por C3. La presión ejercida sobre la superficie del líquido permite que el medio de reacción fluya hacia arriba a través de la tubería conectada en B2 y luego al cartucho SPE. A continuación, el vial de reacción se enjuaga con WFI de la bolsa en C4, y este líquido de enjuague se transfiere al cartucho SPE de la misma manera. Finalmente, el cartucho se enjuaga con WFI fresco y se enjuaga con aire filtrado.
    8. Elución del cartucho de C18 y formulación (adición de NaCl 0,9% + L-metionina): El cartucho SPE retiene inicialmente el producto radiomarcado y los coloides de galio y permite el paso de 68Ga3+ libre. Para eluir el cartucho y recuperar [68Ga]Ga-3BP-3940 en el vial terminal, asegúrese de que se extraigan fracciones sucesivas de etanol al 60% y metionina ~0,9 mg/mL en NaCl 0,9% (3x 0,5 mL cada una) sobre el cartucho para la elución. A continuación, todo el contenido de la jeringa en B4 se pasa a través del cartucho C18 en una etapa de formulación para lograr una concentración final de etanol del <10% en el vial terminal.
    9. Prueba de integridad del filtro (intervención manual): Después de la síntesis y extracción del vial terminal, siga las instrucciones que solicitan conectar el filtro terminal al vial de desecho y retire el filtro de ventilación del vial de desecho para verificar la integridad del filtro terminal mediante una prueba de punto de burbuja. Durante la prueba de punto de burbuja, el filtro se humedece inicialmente mediante WFI durante 30 s. Después de purgar las líneas, la presión en el sistema se incrementa lentamente hasta >2500 mbar durante <2 minutos, durante los cuales el sintetizador comprueba que no haya aumento de presión en la salida del filtro. Luego, el sistema aumenta lentamente la presión para verificar el punto de burbuja. El sintetizador finalmente registrará la presión cuando la presión aumente en la salida del filtro para determinar la presión del punto de burbuja.
  3. Al final de la síntesis, el software autómata genera un informe de síntesis que describe el curso del radiomarcaje y el seguimiento de las temperaturas en el vial de reacción, las presiones en el sistema y las cantidades de radiactividad involucradas (Figura 4). Como complemento, calcule manualmente el rendimiento radioquímico corregido por desintegración (RCY) de acuerdo con la fórmula:
    RARO = figure-protocol-3
    con actividades residuales que describen las actividades restantes en el vial de reacción, en el cartucho C18 y en el vial de desecho al final de la síntesis.

figure-protocol-4
Figura 4: Perfil de distribución típico de la radiactividad dentro del módulo. (A) vial de reacción; (B) Cartucho C18 durante la síntesis de [68Ga]Ga-3BP-3940. El flujo de eluido de 68Ga en el vial de reacción se produce a los 6 min. La actividad permanece en el vial de reacción durante toda la reacción de radiomarcaje. Después de 16 minutos, la actividad se transfiere al cartucho SPE. El cartucho se eluye después de 19,5 min, después de lo cual permanece una actividad residual de alrededor de 150 MBq en la fase estacionaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Dispensación y controles de calidad de [68Ga]Ga-3BP-3940

  1. Transfiera el vial terminal a una celda blindada apropiada para la medición de la radiactividad y la preparación de la dosis para el paciente.
  2. Mida la actividad del vial terminal con un calibrador de dosis correctamente calibrado y registre la preparación en el ordenador.
  3. Identifique correctamente el vial y colóquelo en un recipiente blindado adecuado. Utilizando técnicas asépticas y técnicas de protección radiológica adecuadas, extraiga una muestra de ~0,5 ml del vial terminal para controles de calidad.
    1. Evalúe la apariencia de la preparación mediante inspección visual. Evalúe el pH de la preparación depositando una gota de solución de producto en la tira de papel de pH.
    2. Mida la pureza radioquímica por radio-TLC depositando una gota de solución de producto en cada una de las dos placas iTLC-SG previamente preparadas. A continuación, permita que las placas migren a las fases móviles correspondientes y sean leídas por el radiocromatógrafo. Integre el radiocromatograma resultante midiendo el área bajo la curva de la señal del producto y la señal de impurezas, luego calcule la pureza radioquímica de acuerdo con la fórmula:
      RCP (%) = 100 - %Impureza AUC 1 - %Impureza AUC 2
    3. Mida la pureza radioquímica por radio-HPLC inyectando ~50 μL de la preparación en el vial de HPLC preparado previamente (consulte el paso 2.3.7). Coloque el vial en el muestreador automático de HPLC en la posición requerida e inicie la secuencia de análisis. Una vez que la muestra se haya inyectado en el sistema, retire el vial del muestreador automático y reemplácelo en su recipiente blindado para minimizar la irradiación. Al final del análisis, integre el radiocromatograma resultante midiendo el área bajo la curva de la señal del producto y las señales de impurezas, luego calcule la pureza radioquímica de acuerdo con la fórmula:
      RCP (%) = 100 - Σ(%impurezas AUC)
    4. Verifique la vida media (contador gamma) del radioisótopo contenido en la preparación agregando ~ 5 μL de preparación a un tubo contador gamma que contenga 1 mL de WFI. Cuente el tubo con el contador gamma 10 veces consecutivamente (recuentos de 1 minuto cada uno). Calcule la vida media en función de la desintegración radiactiva observada en las 10 mediciones.
    5. Realice el ensayo de identidad radionucleídica en la misma muestra que el ensayo de vida media mediante la realización de un análisis de espectrometría gamma utilizando el contador gamma, buscando los picos de 511 keV y 1077 keV de los fotones de aniquilación.
    6. Evaluar la pureza radionuclidica después de un período de desintegración de 48 h de la muestra anterior. Realice una medición de 120 minutos en el contador gamma, lo que permite la detección de cualquier actividad residual de 68Ga formada in situ a partir de la ruptura de 68Ge y otras impurezas de radionúclidos de vida media larga.

8. Estabilidad de la preparación [68Ga]Ga-3BP-3940

  1. Evalúe tres lotes de prueba para determinar su estabilidad a lo largo del tiempo. Para ello, extraiga aproximadamente 200 μL de preparación del vial terminal cada hora inmediatamente después de la EoS y hasta 4 h después de la síntesis.
  2. Realice un análisis de radio-HPLC en cada punto de tiempo para medir RCP por HPLC de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Realice análisis de Radio-TLC en cada punto de tiempo para medir RCP por TLC de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.

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Resultados

El proceso de síntesis desarrollado en el módulo GAIA permite el radiomarcaje rápido de 68Ga de 3BP-3940 en 21-22 min. Este protocolo fue diseñado para trabajar con el generador GALLIAD de grado farmacéutico de 68Ge/68Ga, que produce 1,1 mL de eluido de 68Ga en 0,1 M de HCl. El volumen y la molaridad del tampón de reacción se ajustaron finamente de acuerdo con esta cantidad de ácido para obtener un pH de reacción entre 3,5 y 4, necesario para un radiomarcaje óptimo

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Discusión

En este trabajo se presenta un protocolo de preparación automatizado compatible con GMP para la síntesis de [68Ga]Ga-3BP-3940 utilizando un módulo GAIA y un generador GALLIAD. Este método se adaptó de los protocolos utilizados en nuestro centro para el radiomarcaje de galio-68 de vectores como los ligandos PSMA44 y otros inhibidores de FAP 43,46 para la imagen clínica del PET, con ligeras modifi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen asociaciones comerciales ni fuentes de financiación que puedan dar lugar a un conflicto de intereses real o percibido en relación con este trabajo para divulgar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Yasmine Soualy, Stéphane Renaud y Élodie Gaven por su ayuda en la preparación de las reacciones de radiomarcaje presentadas en este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtros 0,2 µVWR514-0515Para la filtración de soluciones tampón y antioxidantes y producto final de radiomarcaje
Acetonitrilo para HPLCSigma Aldrich34851-2,5LPara el control HPLC de la pureza radioquímica
Acetato de amonioSigma Aldrich238074Para la preparación de una de las fases móviles para el control TLC
Columna C18 para HPLCVWREQV-3C18-1503Para el control de la pureza radioquímica por HPLC
Calibrador de dosis calibrado (CRC25)Capintec-Paramedir la radiactividad del producto final y los diversos componentes del módulo posterior a la síntesis
Solución tampón de citrato, pH 4Thermofisher258585000Fase móvil para controles TLC
Tubo de Eppendorf 5 ml BiopurSigma AldrichEP0030119479Para la preparación de soluciones tampón y antioxidantes
Línea de extensión (30 cm)Vygon1159.03Para la conexión del generador al conjunto de tubos Generador de
galio-68IRE Elit-Parageneración in situ de cloruro de galio de [68Ga]contador de
gamma (Hidex AMG)Hidex-Parala evaluación de la vida media y la pureza radioquímica
Estación de HPLCShimadzu-Para el control HPLC de la pureza radioquímica
Placas iTLC-SGAgilentSGI0001Para el control TLC de la pureza radioquímica
L-metioninaAppliChemA1340Para la preparación de soluciones antioxidantes
Adaptador macho/machoVygon893.00Para la conexión del generador al grupo de tubos
MetanolSigma Aldrich320390-1LPara la preparación de una de las fases móviles para el control TLC
Agujas (21G, Sterican)B Braun4657543BPara transferencias de solución antes del radiomarcado
Papel de pHVWR85409.600Para probar el pH del producto de radiomarcado
Pipeta 1000 µ L (Gilson PIPETMAN)Fisher Scientific12346132-1000Para medición y transferencia precisa de líquidos
Pipeta 200 µ L (Gilson PIPETMAN)Fisher Scientific12326132-200Para medición y transferencia precisa
de líquidos Puntas de pipeta, 100-1000 μ LCharles RiverD1000IWPara medición y transferencia precisa
de líquidos Puntas de pipeta, 2-200 μ LCharles RiverD200IWPara medición y transferencia precisas de líquidos
RadiocromatógrafoElysia-Raytest-Parael control TLC de la pureza radioquímica
Radiosensor para HPLCElysia-Raytest-Parael control HPLC de la pureza radioquímica
Kit de reactivosABXRT-101Proporciona etanol 60%, NaCl 0.9%, bolsa WFI, cartucho C18, 0.2 µ filtro terminal, agujas de aireación, aguja terminal y vial de residuos
Recipiente blindadoLemerPaxPara la atenuación de la radiación del producto de radiomarcado
Espátula de plástico de un solo usoCorning3005Para la preparación de reactivos
Acetato de sodio trihidrato EMPROVESigma Aldrich1.28204Para la preparación de tampones
de reacción Viales sellados estériles (tipo vidrio 1)CuriumTC-ELU-5Para el acondicionamiento final de soluciones tampón, antioxidantes y de radiomarcaje
Juego de tubos estérilesABXRT-01-HPara la síntesis automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940
Agua estéril para riegoB Braun0082479EPara la preparación de una de las fases móviles para el control de TLC
Módulo de síntesis (GAIA)Elysia-Raytest-Para la síntesis automatizada de [68Ga]Ga-3BP-3940
Jeringa (1 ml, bajo volumen muerto)B Braun9166017VPara péptido en el tampón y adición de metionina en NaCl 0,9%
Jeringas (10 ml)Becton Dickinson309649Para metionina en NaCl 0,9% y
jeringas de acondicionamiento (3 ml)Becton Dickinson309658Para metionina y etanol 60% de acondicionamiento
Tanques de migración TLCFisher Scientific50-212-281Para el control TLC de la pureza radioquímica
Ácido trifluoroacético (apto para HPLC)Sigma Aldrich302031-100MLPara el control HPLC de la pureza radioquímica
Tubos para contador gamma--Para la preparación de ensayos de pureza radioquímica y de vida media
Baño ultrasónicoSelecta3000683Para la sonicación de soluciones preparadas
Molécula vectorial (3BP-3940)MedChemExpressHY-P10131 Molécula vectorial a radiomarcar
Vial para HPLC con inserto de vidrioSigma Aldrich29385-U y SU860066Para el control HPLC de la pureza radioquímica
Mezclador de vórticeVWR444-5900PPara agitar las soluciones preparadas
Agua para HPLCSigma Aldrich34877-2.5L-MPara el control HPLC de la pureza radioquímica
Agua para inyección, matraces de 10 mLAguettan34009 370 641 0 1Para soluciones preparación
la

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