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Artículo de método

Fibroblastos asociados al cáncer de tumores mamarios de ratón como herramientas para estudios moleculares y computacionales

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DOI:

10.3791/68364

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3 de julio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe métodos para cultivar, manipular y analizar CAF murinos, incluidos ensayos funcionales in vitro/in vivo , transcriptómica y análisis computacional. Además, describe una plataforma basada en la web desarrollada para analizar los transcriptomas disponibles públicamente de los componentes estromales y epiteliales microdisecados de captura láser de una colección de tumores de cáncer de mama humanos.

Resumen

Un importante número de investigaciones ha confirmado el papel fundamental del microambiente tumoral (TME) en el crecimiento y la agresividad del cáncer de mama (CM). Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), el componente celular predominante del TME, influyen significativamente en su comportamiento a través de la compleja diafonía con el cáncer y otras células estromales en respuesta a las señales activadoras derivadas del tumor. Los modelos murinos se utilizan ampliamente para investigar los mecanismos que subyacen al papel de CAF en la progresión de la CM, ya que permiten evaluar el TME endógeno y la evaluación de la afectación del sistema inmune mediante estudios de xenoinjertos singénicos. Aquí, presentamos un conjunto de métodos para cultivar CAFs derivados de BC, manipular la expresión génica y evaluar sus funciones pro-tumorigénicas utilizando enfoques in vitro e in vivo . También describimos los protocolos para el perfil de expresión génica CAF y el análisis transcriptómico, junto con un procedimiento computacional para inferir firmas transcripcionales en tumores primarios utilizando datos de secuenciación masiva de ARN disponibles públicamente. Además, presentamos una herramienta fácil de usar y basada en la web para analizar los transcriptomas de los componentes estromales y epiteliales de tumores BC microdisecados con láser. En última instancia, estos métodos pueden proporcionar información valiosa sobre los mecanismos moleculares que impulsan las interacciones entre CAF y tumores y tienen potencial para identificar nuevas dianas terapéuticas.

Introducción

El cáncer de mama (CM) es la neoplasia maligna más común que afecta a las mujeres y se caracteriza por una heterogeneidad molecular significativa, con perfiles moleculares distintos que guían el diagnóstico, las decisiones de tratamiento y el pronóstico. El microambiente tumoral (TME, por sus siglas en inglés) también es muy heterogéneo y desempeña un papel fundamental en la progresión del tumor, la inmunidad y los resultados del tratamiento.

Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) son el tipo de célula más abundante en la EMT y reguladores clave del desarrollo tumoral. Contribuyen a la deposición y remodelación de la matriz extracelular, la angiogénesis, la evasión inmunitaria y la resistencia a los fármacos 1,2,3,4,5,6. Los CAF influyen en las células tumorales a través del contacto directo célula-célula, la liberación de vesículas extracelulares7 y la secreción de varios factores solubles 2,5 para promover el crecimiento tumoral, la invasión y la resistencia a la terapia 8,9,10. De hecho, las firmas génicas relacionadas con el estroma tienen valor predictivo para la progresión del CM y la respuesta al tratamiento y se asocian con la resistencia a la quimioterapia 11,12,13,14. Sin embargo, a pesar de la evidencia sustancial que sugiere que los CAF son un objetivo terapéutico atractivo, los ensayos clínicos dirigidos a estas células han fracasado en gran medida15. Uno de los principales desafíos es la limitada comprensión de los mecanismos moleculares por los cuales los CAF modulan el comportamiento tumoral. Los avances recientes en los análisis transcriptómicos espaciales y de una sola célula han proporcionado una visión más profunda de la complejidad de los CAF en BC 16,17,18,19,20,21, lo que ha permitido la identificación de distintos subtipos de CAF con programas funcionales específicos 16,22 y ha puesto de relieve aún más su complejidad y plasticidad23.

Los modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM), en los que los oncogenes o genes supresores de tumores se sobreexpresan o inactivan, son modelos bien establecidos para el estudio del cáncer humano 24,25,26,27. En comparación con los modelos singénicos, que implican el injerto de células tumorales en ratones de tipo salvaje23,28, los GEMM imitan con mayor precisión la progresión de varios pasos de la CM y las interacciones entre las células cancerosas y la TME. Sin embargo, la manipulación de las actividades de los CAF en los GEMM ha sido un desafío debido a su heterogeneidad, lo que dificulta la identificación de todos los subtipos de CAF sin efectos fuera del objetivo en otros componentes estromales o epiteliales5. La combinación de GEMMs con enfoques complementarios, como la manipulación in vitro de CAF, puede ayudar a generar modelos celulares para experimentos de pérdida de función tanto en entornos in vitro como in vivo. Sin embargo, el desarrollo de modelos celulares estables para explorar los roles funcionales de genes específicos sigue siendo un desafío debido a la rápida aparición de la senescencia.

Aquí, describimos una plataforma robusta para experimentos estables de pérdida de función en CAF, seguidos de análisis funcionales in vitro e in vivo y perfiles transcripcionales de las células modificadas; Este enfoque ofrece una estrategia integral para diseccionar la relevancia funcional de los genes expresados por CAF en el cáncer de mama, con ventajas en especificidad, reproducibilidad y adaptabilidad sobre los métodos existentes. Este enfoque también se complementa con una novedosa herramienta basada en la web para explorar transcriptomas de compartimentos estromales y epiteliales microdisecados mediante captura láser de tumores de mama humanos, lo que permite comparaciones entre especies y facilita la generación de hipótesis a partir de datos humanos.

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Protocolo

Este estudio cumple con todas las directrices institucionales en cuanto al manejo de ratones y la toma de muestras de tejidos. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las leyes y políticas nacionales e internacionales. Los ratones se alojaron en una unidad transgénica libre de patógenos específicos bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 22 °C con 50% de humedad y se les proporcionó alimento y agua ad libitum. Los procedimientos quirúrgicos deben seguir las instrucciones veterinarias institucionales para garantizar una anestesia y analgesia adecuadas, tanto durante el procedimiento como en el postoperatorio. La Tabla de Materiales proporciona detalles sobre los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Cultivo celular

  1. Cultivo de células a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 con 95% de humedad relativa, en DMEM (HEK293T, CAFs y CAFs inmortalizados (iCAFs)) o medio RPMI (4T1), suplementado con 100 U/mL de Penicilina, 100 μg/mL de Estreptomicina (1% Pen/Strepto).
    NOTA: Composición completa de los medios (cDMEM, cRPMI): 10% de FBS inactivado por calor, composición de los medios de inanición (sDMEM, sRPMI): sin FBS. Los tiempos medios de duplicación de las células: HEK293T e iCAF son de 24 h; Las celdas 4T1 son de 12h.
  2. Pase las células cuando alcance el 80% de confluencia, en una proporción no mayor de 1:5, nunca más de 10 veces después de la descongelación para evitar la deriva fenotípica, como se describe a continuación.
    1. Aspire el medio y agregue suavemente 7 ml de PBS al costado de un plato de 100 mm. Aspirar el PBS, añadir 1 mL de tripsina-EDTA. Incubar durante 2-3 min a 37 °C.
      PRECAUCIÓN: El EDTA está catalogado como un compuesto de riesgo de categoría 2 para la irritación de los ojos. Manéjelo en una capucha biológica/de humos con el EPP adecuado.
    2. Inactive la tripsina-EDTA con 5 mL de cDMEM, separe las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo y recoja en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 290 x g durante 5 min.
    3. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 mL de cDMEM. Para una división 1:5, siembre 1 mL de células resuspendidas en un plato de 100 mm que contenga 9 mL de cDMEM.
  3. Recuento de células: Cargue 10 μL de la suspensión de células del paso 1.2.3 en el lado de una cámara de recuento de Neubauer, cuente las células en los cuadrados grandes y multiplique el número obtenido por 1 x 104 para calcular el número de células contenidas en 1 mL de suspensión celular.
  4. Criopreservación: Congele el 50% de un plato de 100 mm (alrededor de 3 x 106 celdas) en 0,5 ml de medio de congelación helado (10% de DMSO en FBS inactivado por calor) como se describe a continuación.
    1. A partir de una placa de 100 mm, tripsinice las células como se describe en los pasos 1.2.1 y 1.2.2, excepto que las células se resuspenden en 1 ml de medio de congelación helado.
    2. Dispensar 0,5 mL en cada criovial y colocar a -80 °C en un recipiente que garantice una velocidad de enfriamiento de aproximadamente 1 °C/min. Cada alícuota se puede descongelar en un plato de 100 mm.
  5. Prueba de contaminación por micoplasma: Recoja 1 mL de sustrato de células confluentes cultivadas durante al menos 3 días. Hervir a 95 °C durante 20 min. Girar a 16200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Añadir 5 μL de sobrenadante a 45 μL de mezcla de reacción de PCR (0,15 mM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 1x tampón de reacción, 1 U de polimerasa Taq, 0,5 μM de cebadores A y B, ver Tabla 1). Realice PCR, incluidos los controles positivos y negativos, y separe los productos de PCR en un gel de agarosa al 1% junto con una escalera de ADN. Las muestras contaminadas con micoplasma mostrarán una banda de 600 pb.

2. Aislamiento de los CAF de los tumores mamarios

NOTA: Este paso está optimizado para tumores en estadio avanzado de 5-10 mm de diámetro (ver referencia29 ).

  1. Sacrificar al ratón por luxación cervical. Aislar tumores mamarios de al menos 125 mm3. Extirpar el tumor con cuidado, extirpando la piel circundante, el tejido mamario y las áreas necróticas visibles. Con unas pinzas, recoja en un microtubo de 1,5 ml colocado sobre hielo.
  2. Pesar el tumor con una balanza de precisión, extirpar un trozo cúbico de 0,1-0,3 g con un bisturí, transferir a un nuevo microtubo de 1,5 ml lleno de PBS helado y mantener el hielo. Asegúrese de que el tejido esté sumergido para evitar la deshidratación.
  3. Transfiera a un plato de 60 mm de diámetro, con hielo. Picar finamente en 1 mL de PBS con un bisturí hasta obtener trozos de 1-2 mm aproximadamente.
  4. Transferencia a un tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL por 0,1 g de tumor en cDMEM más 10 μg/mL de colagenasa. Enjuague el plato con 1 mL del mismo medio, utilizando una pipeta P1000 con una punta cortada para evitar daños celulares. Asegure la tapa con una película de sellado para evitar fugas.
  5. Incubar horizontalmente durante 1 h a 37 °C en un agitador orbital. Coloque un filtro de células de 70 μm sobre un tubo cónico de 50 mL y transfiera el homogeneizado con una pipeta serológica de 10 mL. Utilice la parte posterior de un émbolo de jeringa de 5 ml para moler y empujar la muestra a través del filtro.
  6. Utilice cDMEM (no exceda los 30 ml de volumen final) para recuperar todo del colador. Centrifugar las células a 129 x g a 4 °C durante 10 min y desechar el sobrenadante.
  7. Agregue 3 ml de tampón de lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK) para eliminar los glóbulos rojos (RBC). Cierre bien los tubos y mezcle por inversión. Incubar durante 5 min a RT en un agitador orbital.
  8. Detenga la lisis de los glóbulos rojos añadiendo PBS a un volumen final de 30 mL. Centrifugar las células a 129 x g a 4 °C durante 10 min y desechar el sobrenadante.
  9. Vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de cDMEM y cuente las células viables como en el paso 1.3 usando 10 μL de azul de metileno: las células vivas reducen el tinte a un producto incoloro y no se tiñen, mientras que las células muertas se tiñen de azul.
  10. Siembre un plato de 5 x 105 células/60 mm en 5 mL de cDMEM, incube 20 min a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 , recoja las células no adherentes y vuelva a colocarlas durante la noche.
  11. A las 48 h o 72 h, realizar tripsinización diferencial. Dado que los fibroblastos se desprenden más rápido que las células epiteliales y mioepiteliales30, proceda como se describe en el paso 1.2. Pero vigile de cerca el desprendimiento de células bajo un microscopio. Las células en forma de fibroblasto se volverán redondas y se desprenderán, mientras que las células epiteliales permanecerán unidas.
  12. Agregue cDMEM para inactivar la tripsina y recoja los CAF desprendidos, transfiriéndolos a una nueva placa de 60 mm en 5 mL de cDMEM. Pasaje primario CAFs 1:3 (ver paso 1.2) para tres pasajes, luego prepare alícuotas congeladas de pasaje temprano como se describe en el paso 1.4.

3. Inmortalización por transducción viral

NOTA: Algunos de los siguientes pasos deben realizarse en un entorno adecuado para el manejo de vectores retrovirales (por ejemplo, BSL2+); Revisa las reglas de tu institución.

  1. Preparación del virus recombinante
    1. Cultive HEK293T células y compruebe si hay contaminación por micoplasma (consulte el paso 1).
    2. Cubrir una placa de 100 mm de diámetro pipeteando 6 mL de una solución de 0,1 mg/mL de poli-L-lisina en ddH2O durante 5 min a RT, aspirar y dejar secar bajo el capó (alrededor de 10 min).
    3. Siembre 3 x 106 células HEK293T (paso bajo, micoplasma negativo) en 10 mL de cDMEM en la placa recubierta de poli-L-lisina del paso 3.1.2 (ver paso 1.3).
    4. Al día siguiente, prepare dos tubos que contengan 0,75 mL de medio optimizado para la transfección libre de antibióticos. A uno de ellos, añadir 30 μL de reactivo de transfección mediado por lípidos catiónicos (T1). Al segundo, agregue 2 μg de pCL-Ampho (vector de empaquetamiento retroviral) y 2 μg de vector de ADNc (T2) pBABE-neo largeT retroviral. Agregue T2 a T1, mezcle suavemente e incube durante 10 min.
    5. Distribuya uniformemente el medio sobre las células después de reemplazarlo con un medio optimizado para la transfección sin antibióticos + 10% de FBS inactivado por calor. Mueva la placa a una instalación de cultivo de tejidos de nivel de bioseguridad 2+ (BSL-2+). Reemplace el medio con cDMEM después de 6-12 h e incube las células durante 24-48 h.
    6. Filtre el medio que contiene las partículas pseudovirales a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm y almacene a 4 °C durante unos días o a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.
  2. Transducción viral de CAF
    1. Siembre 7,5 x 105 CAFs en cada una de las dos placas de 60 mm en 4 mL de cDMEM (ver paso 1.3) y cultívelas como en el paso 1.1.
    2. Al día siguiente, sustituya el medio de una placa por 2 ml del medio que contiene pseudovirus del paso 3.1.6 (CAF transducidos), añada 2 ml de cDMEM e incube durante 24 h. Deje el otro plato sin tocar (CAF sin transducir).
    3. Al día siguiente, repita el paso 3.2.2 en los CAF transducidos. Pasadas las 24 h, sustituya el medio de ambos platos por 4 mL de cDMEM.
    4. Después de otras 24 h, inicie la selección reemplazando el medio de ambos platos con cDMEM suplementado con 400 μg/mL G418. Reemplace el medio que contiene G418 cada 2-3 días hasta que no queden células vivas en el plato de control de CAF no transducidos.
      NOTA: Las células no transducidas son sensibles a G418 y morirán en un plazo de 7 a 10 días, lo que indica que solo las células transducidas resistentes a G418 habrán sobrevivido en la condición de CAF transducidas. Se debe determinar la concentración óptima de antibiótico para cada tipo de célula, realizando curvas de muerte (pruebe un rango de 50 a 1000 μg/mL de concentración de G418 durante 7-10 días y seleccione la dosis que mata todas las células dentro de los 10 días).
    5. Pase las celdas transducidas seleccionadas 2 veces en una proporción de 1:3 (consulte el paso 1.2) antes de salir de la instalación BSL. Prepare las alícuotas criopreservadas de los primeros pasajes como en el paso 1.4.
    6. Verificar que las células continúen proliferando sin mostrar un fenotipo senescente durante varios pasajes y proceder a la caracterización fenotípica y funcional (ver pasos 4 y 6-9).

4. Caracterización fenotípica

NOTA: Los marcadores CAFs como la actina alfa del músculo liso (α-SMA), la caveolina, la proteína activadora de fibroblastos (FAP), la N-cadherina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGFR-β), S100A4 y vimentina29 pueden evaluarse mediante RT-qPCR y Western Blot.

  1. RT-qPCR: Extraiga el ARN total con una solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina como se describe en la referencia15. Transcribir inversamente 2 μg de ARN total en un volumen de 20 μL, siguiendo las instrucciones del fabricante para las condiciones de reacción. Diluya el ADNc 1:20 y utilice 3 μL para realizar las reacciones RT-qPCR, siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla 1 para los cebadores).
    NOTA: Recomendamos preparar el ARN en un plato de 12 pocillos.
  2. Western blot
    1. Lavar 2 veces con PBS como se describe en el paso 1.2.1, añadir 0,2 mL de tampón de lisis helado, separar las células con un raspador y recogerlas en un microtubo de 1,5 mL como se describe en29. Dejar actuar durante 20 min en hielo.
    2. Centrifugar las muestras a 16.000 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Cuantificar las proteínas mediante ensayo colorimétrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice al menos 20 μg de proteína para el Western blot (consulte la Tabla 2 para anticuerpos).
      NOTA: Recomendamos preparar proteínas de no menos de 6 pocillos en un plato.
  3. Análisis de las proteínas secretadas
    1. Siembre 2 x 106 iCAF (ver paso 1.3) en un plato de 100 mm de diámetro en 10 mL de cDMEM y cultívelos como se describe en el paso 1.1.
    2. Después de 24 h, retire el medio, lave 2 veces con 10 mL de PBS e incube durante 48 h con 10 mL de sDMEM (consulte el paso 1.1) para generar medio acondicionado (CM).
    3. Después de otras 48 h, filtre el CM a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm en un tubo cónico de 15 mL. Sostenga la jeringa y el tubo con fuerza y esté preparado para cierta resistencia. CM puede almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
    4. Concentre CM aproximadamente 10 veces usando concentradores de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para generar CM concentrado (conCM). Cuantificar la conMC, hervir y realizar Western Blot (ver Tabla 2 para anticuerpos).

5. Análisis de knockdown de genes

NOTA: Para interferir de manera estable con la expresión génica, transducimos iCAFs con partículas lentivirales que expresan shRNAs específicamente diseñados. Estos pueden obtenerse clonando las secuencias diana en un vector lentiviral adecuado como pLKO.1-Puro, siguiendo los protocolos disponibles en https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. Las secuencias de diana específicas se pueden seleccionar utilizando herramientas de diseño de shRNA disponibles públicamente (es decir, GPP-Genetic Perturbation Portal del Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). Alternativamente, los conjuntos de vectores de segmentación prefabricados están disponibles comercialmente (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). Recomendamos diseñar 4-5 shRNAs diferentes contra cada gen y seleccionar los 2 mejores para los experimentos. Genere también vectores no objetivo como controles negativos. Algunos de los siguientes pasos deben tomarse en un entorno adecuado para el manejo de virus derivados del VIH (por ejemplo, BSL2+). Revisa las reglas de tu institución.

  1. Generación de partículas lentivirales
    1. Siembra 3 x 106 HEK293T celdas como en los pasos 3.1.1-3.1.3. Al día siguiente, prepare los complejos de ADN y reactivo de transfección mediados por lípidos catiónicos como en el paso 3.1.4, utilizando 9 μg y 3 μg, respectivamente, de los vectores de empaquetamiento pCMV-R8.74 y pCMV-VSVG, y 7 μg de la construcción pLKO.1 que contiene shRNA en 0,75 mL de medio optimizado para la transfección libre de antibióticos, y proceda como se describe en los pasos 3.1.5 y 3.1.6.
  2. Transducción de CAFs
    1. Infectar las células como se describe en los pasos 3.2.1, 3.2.2 y 3.2.4. Después de 24 h, retire el medio de infección e inicie la selección con 2 μg/mL de puromicina en cDMEM. Consulte la nota en el paso 3.2.5 para determinar la concentración óptima.
    2. Sustituir puromicina/cDMEM después de 48 h. La selección suele completarse en 3 días. Expanda y congele las celdas como en el paso 3.2.6. Evalúe la eficiencia de la reducción mediante RT-PCR y Western blot como se describe en los pasos 4.1. y 4.2.

6. Superactivación de iCAFs con CM a partir de células tumorales

NOTA: Los siguientes pasos ilustran los métodos para la caracterización in vitro de las actividades protumorales de iCAFs. Las actividades protumorales de los CAF pueden mejorarse incubándolos con CM de células tumorales BC de ratón (superactivación, s.a.), como se describe a continuación.

  1. Cuente 4T1 células BC murinas como se describe en el paso 1.3 y siembre 2 x 106 células en un plato de 100 mm de diámetro en 10 mL de cRPMI (ver paso 1.1).
  2. Después de 24 h, retire el medio, lave 2 veces con 10 mL de PBS e incube durante 48 h con 10 mL de sRPMI (consulte el paso 1.1) para generar CM.
  3. Al día siguiente, siembre 2 x 106 iCAFs en una placa de 100 mm de diámetro, en 10 mL de cDMEM (ver paso 1.3) y cultívelos como se describe en el paso 1.1. Filtre el CM a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm en un tubo cónico de 15 ml como en el paso 4.3.3.
  4. Superactivación (s.a.): retirar el medio de la placa iCAFs, lavar 2 veces con 10 mL de PBS y añadir el 4T1 CM filtrado (8-10 mL). Incubar durante 48 h para obtener s.a. iCAFs.

7. Proliferación de células tumorales

  1. Tratar previamente las células 4T1 durante 48 h con iCAFs CM, preparados como en los pasos 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. Tripsinícelos y cuéntelos, luego siembre 4 x 103 células/pocillo de una placa de 96 pocillos en 100 μL de cRPMI como se describe en el paso 1.3 y cultivo como en el paso 1.1. Placa técnica triplicada.
    1. Prepare un plato de 96 pocillos por día del curso de tiempo. El número de celdas sugerido aquí está optimizado para un protocolo de 4 días; Reducirlo durante más tiempo.
  3. Después de 4 h, o tan pronto como las células estén adheridas, retire el medio, lave con PBS agregando suavemente 100 μL, teniendo cuidado de no desprender las células apoyando la punta contra el borde del pocillo, con una pipeta multicanal y utilizando un depósito estéril. Retire PBS, luego agregue de manera similar 100 μL de sDMEM (control) o iCAF CM, ambos suplementados con FBS inactivado por calor al 2% (consulte los pasos 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. Después de 4 h, detenga la placa del día 0 como se describe en el punto 7.5. Para los otros puntos de tiempo, reemplace el medio cada dos días hasta el final del experimento.
  5. Para evaluar la densidad celular, retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y lave los pocillos 2 veces con 100 μL de PBS, como se describe en el paso 7.3.
  6. Bajo una campana extractora, agregue 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% a cada pocillo y fije las celdas durante 10 min en RT.
    PRECAUCIÓN: El PFA puede causar daños oculares graves e irritación de la piel; Es perjudicial si se ingiere e inhala y se sospecha que causa defectos genéticos y cáncer. Manéjelo en una campana extractora con el equipo de protección personal (EPP) adecuado.
  7. Lavar 3 veces con 100 μL de PBS como en el paso 7.3 y dejar secar bajo la campana extractora (unos 10 min).
  8. Incubar con 50 μL de violeta cristalino al 0,1% en metanol al 20% durante 10 min en RT.
    PRECAUCIÓN: El violeta cristalino puede causar daños oculares graves y se ha reportado como un peligro de categoría 4 por toxicidad aguda oral y un peligro de categoría 2 como carcinógeno. Manéjelo en una campana extractora con el EPP adecuado.
  9. Lavar 3 veces con 100 μL de ddH2O, vaciar los pocillos y golpear la placa con una almohadilla absorbente o una toalla de papel para eliminar completamente el líquido.
  10. Disuelva el violeta cristalino en 100 μL de ácido acético al 10% durante 15 min a RT y mida la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 600 nm en un lector de microplacas, utilizando 100 μL de ácido acético al 10% como blanco. Normalice el O.D. de ese día a 0 por condición.

8. Migración e invasión

  1. Pipetee 700 μL de DMEM suplementado con un 1% de FBS inactivado por calor, un 1% de Pen/Strepto, en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Coloque un inserto transpocillo de poro de 8 μm, recubierto (invasión) o no (migración) con matriz biológicamente activa, en cada pocillo. Deje que la placa en la incubadora se equilibre a 37 °C mientras recolecta y cuenta las células 4T1 como en el paso 1.3.
  2. Separe las células 4T1 pretratadas durante 48 h con iCAFs CM de una placa de 100 mm de diámetro como en los pasos 4.3.1, 4.3.2 y 4.3.3, utilizando 1 mL de 5 mM de EDTA en lugar de tripsina-EDTA.
  3. Agregue 5 mL de cDMEM, recoja las células en un tubo cónico de 15 mL y granule por centrifugación como en el paso 1.2. Vuelva a suspender las células en sDMEM, cuente como en el paso 1.3 y diluya hasta 1 x 105 células/100 μL.
  4. Agregue 100 μL de la suspensión celular a la cámara superior del transwell. Como control de siembra, siembre 100 μL de células en una placa de 24 pocillos, en 500 μL de cDMEM. Incubar durante 16 h (migración) o 24 h (invasión) y detener el experimento como se describe a continuación.
    NOTA: Los tiempos de incubación deben determinarse empíricamente si se utilizan celdas diferentes.
  5. Etiquete los insertos en su parte superior con un marcador fino y sumérjalos en un tubo cónico de 50 ml lleno de PBS para lavar con pinzas. Limpie cuidadosamente la parte interna del transwell con un bastoncillo de algodón.
  6. Bajo una campana extractora, incubar las muestras en 700 μL de PFA al 4% durante 10 min en RT (ver paso 7.6).
  7. Lavar 3 veces con 700 μL de PBS y dejar secar bajo el capó (unos 10 min). Incubar los insertos con 700 μL de violeta cristalino al 0,1% en metanol al 20% durante 10 min en RT (ver paso 6.10).
  8. Lave las inserciones 3 veces sumergiéndolas en un tubo cónico de 50 mL lleno de ddH2O con pinzas. Limpie cuidadosamente la parte interna del transwell con un bastoncillo de algodón. Guarde las muestras en RT y tome fotografías hasta 3 días después.
  9. Usando un microscopio de contraste de fase, tome una imagen con un objetivo de 10x para obtener imágenes de la mayor parte de la superficie del pocillo, luego adquiera imágenes de 5 áreas independientes con un objetivo de 20x.
  10. Disuelva el violeta cristalino en ácido acético al 10% de la siguiente manera: para pocillos, agregue 100 μL de ácido acético y mezcle en un agitador orbital durante 10 min a RT; en el caso de los transpocillos, colóquelos, con la superficie inferior hacia arriba, sobre un banco, deposite 50 μL de ácido acético en la superficie y mezcle por pipeteo hasta que el cristal violeta se disuelva por completo.
  11. Lea la absorbancia a 600 nm en una placa de 96 pocillos utilizando 50 μL del material disuelto del paso anterior. Use ácido acético al 10% como blanco.
  12. Normalice la densidad óptica (O.D.) del control de recubrimiento del paso 8.5 y exprese la migración o invasión en relación con la condición de control.

9. Crecimiento tumoral primario y formación de metástasis pulmonares

NOTA: El siguiente paso ilustra los métodos para la caracterización in vivo de las actividades protumorales de los CAF. Este paso está optimizado para evaluar las características protumorigénicas in vivo de los CAF mediante coinyección en modelos de ratón singénicos. Dado que tanto las células CAF como las 4T1 proceden del fondo de ratón BALB/c, se utilizan ratones BALB/c.

  1. A los 2 días antes de la inyección, numere ratones hembra BALB/c de 6 semanas de edad con marcas auriculares de identificación metálica y afeite la4ª región de la glándula mamaria con una afeitadora.
  2. Recoja y cuente las células 4T1 y los iCAF s.a., preparados como se describe en el paso 6. En un tubo cónico de 15 mL, mezclar 1 x 105 4T1 pilas y 3 x 105 s.a. iCAFs/ratón, considerando un exceso de al menos el 20%. Utilice 4T1 sólo como control.
  3. Centrifugar a 290 x g durante 5 min, resuspender en un volumen de PBS calculado para obtener el número anterior de células/ratones en 50 μL, transferir a un microtubo de 1,5 mL y mantener en hielo.
    NOTA: Por ejemplo, para inyectar 10 ratones, mezcle 1,2 x 106 4T1 células con 3,6 x 106 s.a. iCAFs, células de pellets, y vuelva a suspender en 600 μL de PBS. Inyecte 50 μL de suspensión celular por ratón.
  4. Prepare el área de trabajo limpiando y desinfectando la superficie de una campana de flujo laminar. Cubra una tabla de cirugía de espuma con una lámina protectora de banco.
  5. Anestesiar a los ratones de uno en uno, de acuerdo con los procedimientos institucionales (utilizamos inyección intraperitoneal de tiletamina base/zolazepam base + xilacina 70 mg/kg + 5 mg/kg). Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad. Con una punta de algodón, desinfecte la piel con una solución de povidona yodada.
  6. Use la prueba de pellizco del dedo del pie para asegurarse de que los ratones estén bajo la anestesia adecuada. Con una aguja hipodérmica, inyecte 50 μL de la suspensión celular en la4ª almohadilla de grasa mamaria. Utilice el pezón como referencia e inyecte unos 3 mm hacia la pierna ipsilateral.
  7. Inspeccione los ratones durante unas horas después de la inyección y en los días siguientes. Los tumores se vuelven palpables después de 4 días.
  8. Medir el tamaño del tumor cada 48 h con un calibrador, determinando los diámetros máximo y mínimo. Calcule el volumen del tumor utilizando la fórmula: (largo x ancho2)/2.
  9. Después de 10 días de la inyección, extirpe quirúrgicamente los tumores primarios como se describe a continuación.
    1. Prepare el área quirúrgica como en el paso 9.5. Esterilice las herramientas esterilizándolas en autoclave y colóquelas sobre una superficie estéril mientras trabaja. Esterilice las herramientas entre animales con un esterilizador de perlas calientes.
    2. Anestesiar a los ratones como en los pasos 9.6 y 9.7. Con una hoja de bisturí, haga una incisión de 5 a 8 mm cerca del tumor y retire suavemente la piel, creando una pequeña bolsa para acceder al tumor. Cauterice cualquier vaso sanguíneo visible con una pluma cauterizante de baja temperatura para evitar hemorragias al diseccionar.
    3. Use el bisturí para extirpar el tumor, tratando de no extirpar nada de piel. Vuelva a colocar los colgajos de piel en su posición original, suérelos con hilo quirúrgico 5-0 con una aguja de 17 mm 1/2c y agregue pegamento quirúrgico para sellar completamente la herida.
    4. No deje a los ratones desatendidos hasta que hayan recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Los animales que se sometieron a cirugía no son devueltos a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados.
  10. Monitorear de cerca a los animales después de la cirugía y en los días siguientes, administrar tratamiento analgésico si es necesario, de acuerdo con los protocolos institucionales. Utilizamos inyecciones subcutáneas de carprofeno (3-5 mg/kg).
  11. Pesar el tumor usando una balanza de precisión como en el paso 2.2. Secciona el tumor por la mitad con el bisturí. Coloque la mitad en un microtubo de 1,5 ml, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C para análisis moleculares. Fijar la otra mitad en 5 mL de PFA al 4% en un tubo cónico de 15 mL durante 24 h a 4 °C para el análisis histológico.
  12. En el día 21 después de la inyección, sacrifique los ratones por exposición a CO2 y recoja los pulmones tras la infusión intratraqueal con PFA al 4% como se describe a continuación. Trabaje debajo de una campana extractora.
    1. Abra la cavidad torácica con unas tijeras quirúrgicas. Retire la piel de la zona submandibular y de las glándulas salivales para exponer claramente la tráquea.
    2. Prepare una jeringa de aguja de 22 G que contenga una solución de PFA al 4%. Inserte la aguja en la tráquea del ratón, dirigiéndola hacia los pulmones mientras sujeta la tráquea hacia la cabeza. Inyecte la solución hasta que los pulmones se hinchen (alrededor de 2 ml).
    3. Diseccione los pulmones y colóquelos en un tubo de 15 ml que contenga una solución de PFA al 4%. Invierta suavemente el tubo unas cuantas veces y déjelo fijar durante 24 h a 4 °C.
  13. Realizar cortes semiseriados de los pulmones, y teñir con hematoxilina y eosina (H&E), un corte cada 50/100 μm hasta agotar la muestra, como se describe en la referencia31.
  14. Puntúe las metástasis tras el análisis guiado por software de las microfotografías de las secciones teñidas con H&E.

10. Firmas de expresión génica

  1. Defina una firma genética como se describe a continuación.
    1. Dependiendo del entorno experimental y de la cuestión biológica específica investigada, se obtiene una firma génica de varias maneras. Lo más común es evaluar la expresión diferencial entre dos afecciones (p. ej., CAF frente a contrapartes normales, o tratadas de varias maneras (p. ej., superactivadas o silenciadas) frente a no tratadas.
    2. Alternativamente, identifique los genes más variadamente expresados o informativos en las muestras analizadas (por ejemplo, genes con alta varianza o con altas cargas en los primeros componentes de un análisis de componentes principales). Aquí, usaremos una firma regulada por STAT3 como ejemplo. Esta firma se definió como los genes regulados a la baja tras el silenciamiento de STAT3 en BC CAFs29, como se describe a continuación. Para una descripción detallada de la secuenciación del ARN, ver referencias32,33.
  2. Extraiga el ARN total por triplicado técnico de cada muestra como en el paso 4.1.1 y evalúe la calidad del ARN para comprobar la integridad del ARN (RIN ≥ 9).
  3. Preparar bibliotecas a partir de 2 μg de ARN seleccionado poli(A) y secuenciarlas. Utilizamos la plataforma NextSeq 500.
  4. El mapa lee el ensamblaje de referencia Mus musculus mm9 mediante TopHat v2.0. 1034.
  5. Calcule los recuentos de genes utilizando la herramienta htseq-count del paquete HTSeq (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. Realice análisis de expresión diferencial mediante R y el paquete DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). Filtre los genes regulados a la baja con FDR < 0,05 para definir la firma STAT3.

11. Estimación de la expresión de la firma en tumores primarios

NOTA: Los siguientes pasos describen un procedimiento para estimar computacionalmente la expresión de la firma29 regulada por STAT3 a través de datos transcriptómicos disponibles públicamente de tumores primarios BC, probando su relación con la proporción estromal estimada en el mismo conjunto de muestras.

  1. Instale R (https://cran.r-project.org/) y RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). Ejecútelo e instale las bibliotecas necesarias: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. Descargue los datos de expresión génica del tumor primario, como los datos TCGA de https://portal.gdc.cancer.gov/, los datos METABRIC de http://synapse.org/ (syn1757063) u otros datos transcriptómicos del Ómnibus de Expresión Génica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) como matrices de expresión prenormalizadas. Los datos deben formatearse como una matriz numérica con filas como genes y columnas como muestras, y normalizarse en función de la plataforma y escalarse logarítmicamente mediante un desplazamiento de 1.
    1. Descargue la lista de ortólogos genéticos de ratones y humanos de Biomart en https://www.ensembl.org/biomart/martview/, seleccione la base de datos: ensembl genes, elija el conjunto de datos de genes humanos y haga clic en la selección de atributos en la pestaña de la izquierda.
    2. De las características preseleccionadas, abra la pestaña EXTERNO y marque el símbolo HIGNC, seleccione Homólogos en el cuadro de la parte superior de la página y marque Ortólogos de ratón / Nombre del gen de ratón.
    3. Haga clic en el botón Resultados en la esquina superior izquierda, seleccione el formato CSV y haga clic en el botón IR para descargar el archivo.
  3. Cargue la firma de expresión génica (un conjunto de genes) en R. En este caso, utilizamos la lista de genes regulados a la baja tras el silenciamiento de STAT3 en CAFs murinos.
  4. Cargue la lista de ortólogos genéticos de ratón humano en R y asigne la firma STAT3 a los ortólogos humanos correspondientes a través de la tabla Biomart.
  5. Cargue los datos de expresión génica del tumor primario en R y llame a la función GSVA con parámetros como un objeto ssgseaParam, incluidos los datos del tumor primario y una lista que comprenda la firma STAT3.

12. Probar la relación entre la expresión de la firma génica y las características clínicas

  1. Identificar las variables de interés. El porcentaje estromal representa la proporción de células en la muestra tumoral secuenciada que pertenecen al estroma tumoral. Utilice las siguientes características clínicas que a menudo se asocian con los datos ómicos: tamaño del tumor, estadio, edad del paciente en el momento del diagnóstico, estado de los ganglios linfáticos, estado de metástasis, etc. Las estimaciones precalculadas del porcentaje estromal están disponibles para TCGA.
    NOTA: Específicamente, las estimaciones estromales disponibles son: EDec Inmune/Estromal = Deconvolución Epigenómica del porcentaje estromal/inmune37; Puntuación inmunitaria = ssGSEA basada en perfiles de expresión génica de 141 genes inmunitarios38; LUMP = Desmetilación de leucocitos para pureza, que tiene un promedio de 44 sitios CpG inmunoespecíficos no metilados39; Puntuación estromal = ssGSEA basada en perfiles de expresión génica de 141 genes estromales38; IHQ = estimada mediante el análisis de imágenes de portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina producidos por el Nationwide Children's Hospital Biospecimen Core Resource40; ABSOLUTO = basado en datos somáticos de número de copias41.
  2. Descargue los datos de EDEc de las puntuaciones http://genboree.org/theCommons/documents/569, estromal e inmune de https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2), y los datos de pureza tumoral (LUMP, IHC, ABSOLUTE) de TCGAbiolinks. Para otros conjuntos de datos, calcule el porcentaje de estroma que hace uso del paquete GSVA, calculando el ssGSEA para el estroma y las firmas inmunes obtenidas de Yoshihara et al.38.
  3. Calcule la correlación entre el vector numérico de la proporción estromal estimada y el vector numérico de la expresión de la firma STAT3 en muestras de tumores primarios. Esto se puede lograr con la función cor.test en R.
  4. Descargue los datos clínicos asociados con el conjunto de datos transcriptómicos de los tumores primarios en forma de tabla con muestras en filas y características clínicas en columnas.
  5. Cargue los datos clínicos en R y compruebe que las muestras de la matriz transcriptómica y de la tabla de metadatos estén en el mismo orden que la función de coincidencia.
  6. Para variables numéricas (por ejemplo, tamaño del tumor), calcule la correlación entre el vector numérico de la expresión de la firma STAT3 en muestras de tumores primarios y los valores del vector de características clínicas con la función cor.test.
  7. Para las variables categóricas (por ejemplo, estado de metástasis), pruebe la diferencia en la expresión de la firma de STAT3 entre dos grupos de muestras (por ejemplo, tumores metastásicos frente a tumores no metastásicos) con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon no paramétrica (suponiendo que los dos grupos de muestras son independientes). Esto se puede lograr con la función wilcox.test en R.

13. Prueba de la regulación de la firma en el estroma tumoral

NOTA: La expresión de una firma estromal en tumores primarios analizados a través de la secuenciación masiva de ARN tiene la ventaja de basarse en grandes cohortes de pacientes con anotaciones clínicas detalladas. Por otro lado, solo la separación del estroma y el epitelio permite definir cambios en la expresión génica en cualquiera de los dos compartimentos celulares del tumor en comparación con el tejido normal42. MetaLCM es una ShinyApp que facilita el análisis de conjuntos de datos transcriptómicos de tumores de mama microdisecados con captura láser. A través de esta herramienta, el usuario puede buscar genes robustos expresados diferencialmente entre dos condiciones en conjuntos de datos transcriptómicos de tumores de mama microdisecados con captura láser y probar la regulación de firmas génicas previamente definidas en el estroma tumoral. En los siguientes pasos se describe cómo utilizar MetaLCM.

  1. Accede a la aplicación en el enlace https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/. Para iniciar el análisis, seleccione las características de las condiciones comparadas.
  2. Elija la dirección de la comparación. Al elegir genes regulados al alza, se muestran los genes con mayor expresión en la condición 1.
  3. Elija el umbral del valor p para la expresión diferencial y presione Ejecutar para ejecutar el análisis y cada vez que se cambie la configuración.
  4. Para restringir el análisis a una lista de genes predefinida, escriba símbolos de genes separados por comas o importe un archivo CSV que contenga símbolos de genes en una sola columna.
  5. Presione Enviar lista de genes para importar símbolos de genes. Presione Restablecer para restaurar el análisis utilizando todos los genes. Guarde la lista de genes expresados diferencialmente: cuando se proporciona una lista de genes, se realizan múltiples correcciones de pruebas solo en esos genes. La tabla comprende el logFC promedio, el valor p contraído y los valores logFC y p individuales para la expresión diferencial en cada conjunto de datos disponible.
  6. Traza un mapa de calor con los cambios en el plegamiento de los genes expresados diferencialmente. El mapa de calor muestra solo los genes expresados diferencialmente con el signo completamente coherente de expresión diferencial en todos los conjuntos de datos.

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Resultados

Evaluación in vitro de las actividades de CAF
La contribución de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) derivados de tumores mamarios a las características agresivas del cáncer de mama (BC) se estudió utilizando CAFs inmortalizados (iCAFs) generados de acuerdo con el paso 3. Los iCAFs se superactivaron como se describe en el paso 6, y luego se les privó de sDMEM para recolectar su CM, que se utilizó para tratar las células 4T1 durante 48 h (ver paso 7.1). A este tratamien...

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Discusión

En este estudio, presentamos protocolos optimizados para la inmortalización de CAFs murinos y la caracterización de sus actividades pro-tumorigénicas tanto in vitro como in vivo. En lugar de aislar selectivamente subtipos específicos de CAF en función de la expresión de marcadores, optamos por retener toda la población celular para preservar la heterogeneidad. Las células se caracterizaron funcionalmente como un todo y se analizaron sus perfiles de expresión génica para...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Asociación Italiana de Investigación del Cáncer (AIRC, IG16930 y IG24851 a V.P.); el Ministerio de Universidad e Investigación italiano (MIUR PRIN 2017 y 2022 a V.P.); la Fundación Truus y Gerrit van Riemsdijk, Liechtenstein, donación a V.P.; Región de Piamonte (desvío). A.S. contó con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación Italiana para la Investigación del Cáncer (FIRC), y L.A. contó con el apoyo de la Fondazione Umberto Veronesi.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Escalera de ADN de 1Kb másThermoFisher Scientific10787018
Placa de 24 pocillosSarstedt833922
Placa de 96 pocillosSarstedt833924
Ácido acéticoSigma Aldirch695092
EdadI-HFLaboratorios biológicos de Nueva InglaterraReferencia R3552Almacenar a -20 &grados; C
BetadineMeda Pharma23907076
Bü Cámara de escrutinio rkerVWR40443703
Cauterización de baja temperatura FineTip DispKeelerAX10339KL
CentrífugaEppendorf5810R
Tubo cónico 15 mLSarstedt62554502
Tubo cónico 50 mLSarstedt62547254
Microtubos Cryopure de 2 mlSarstedt72380992
Violeta cristalSigma AldirchC0775Almacenar en RT, usar en una campana extractora 
Placa de cultivo de 100 mm de diámetroSarstedt833902
Placa de cultivo de 60 mm de diámetroSarstedt833920
ddH20CaseroAlmacenar en RT, usar en una campana biológica
Calibrador digitalPreciva02-301-2
Microscopio digitalLeicaDM6B
DimetilsulfóxidoSigma AldirchD8418Uso en una campana biológica
Dulbecco' s Águila modificada' s Medio (DMEM)Gibco11965092Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica
EcoRI-HFLaboratorios biológicos de Nueva InglaterraReferencia R3101Almacenar a -20 &grados; C
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma AldirchE6758Almacenar en RT, usar en una campana biológica
Suero fetal bovino (FBS)Gibco16000044Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica
Puntas filtradas 10 µ LSarstedt703010255
Puntas filtradas 100 µ LSarstedt703030255
Puntas filtradas 1000 µ LSarstedt703060255
Puntas filtradas 20 µ LSarstedt703030265
Puntas filtradas 200 µ LSarstedt703031255
Filtropur S Plus 0,20 µ m Sarstedt831826102
Filtropur S Plus 0,45 µ m Sarstedt831826
Tijeras finas2Biol1406009
Pinza2Biol1102412
GeneticinaGibco10131035Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica
Reactivo de transfección Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668019Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica
Cámaras de invasión de Matrigel con 8 μ m Membrana de PET Corning354480
Lector de microplacas (absorbancia de 600 nm)PromegaGM3500
Microtubos 1,5 mL Sarstedt7269001
OptimemGibco31985047Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica
Paraformaldehído (PFA)Sigma Aldirch158127Almacenar en RT, usar en una campana extractora
pBABE-neo largeTcDNA Addgene1780Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica
pCL-AmphoNovus Biological 18746853Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica
pCMV-R8.74Addgene22036Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica
pCMV-VSVG Addgene8454Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica
Penicilina-Estreptomicina (Estreptoestreptopluma de pluma, 10,000 μ g/mL) Gibco15140122Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica
Microscopio de contraste de fases Olimpo BX42
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)CaseroAlmacenar en RT, usar en una campana biológica
pLKO.1-Puro Addgene10878Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica
Solución de poli-L-lisinaSigma AldirchP8920Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica
Diclorhidrato de puromicina de  Streptomyces albonigerSigma AldirchP8833
Búfer rCutSmart Laboratorios biológicos de Nueva InglaterraB6004Almacenar a -20 &grados; C
Afeitadora para roedoresAesculapGT416
Instituto Conmemorativo de Roswell Park (RPMI)Gibco61870010Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica
Hisopos sedientos de punta redondaSigma AldirchZ744127
EscalpeloGima27041
Balanza semimicro SecuraSartorioSECURA125-1S
Pipeta serológica 10 mL Sarstedt861254001
Pipeta serológica 2 mL Sarstedt861252001
Pipeta serológica 25 mL Sarstedt861256001
Pipeta serológica 5 mL Sarstedt861253001
Puntos 5-0Ethicon1866G
Jeringa 10 mLPentaferte00202250E14
Jeringa 5 mLPentaferte00202250E12
Jeringa Omnican Insulina 1 mLBraun9151125S
Tejido adesivoVetbond de 3M1469SB
Insertos Transwell 8 µ m poro Halcón353097
Insertos Transwell Matrigel 8 µ m poro Corning354480
Tripsina-EDTA (0,5%), sin rojo fenólicoGibco15400054
Concentrador centrífugo Vivaspin 20 MWCO 10.000 DíasSigma AldirchZ614602

Referencias

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