Este protocolo proporciona un procedimiento integral para aislar, expandir e inmortalizar fibroblastos de prostatectomías radicales. Además, describe ensayos desarrollados para evaluar los efectos funcionales de la diafonía fibroblasto-células tumorales, aprovechando tanto el tratamiento con medio condicionado como el cocultivo.
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Artículo de método
Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos asociados al cáncer de próstata
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células tumorales pueden moldear activamente el estroma tumoral para que adopte propiedades protumorigénicas, lo que lo convierte en un punto focal de la investigación del cáncer. Entre los componentes del estroma, los fibroblastos asociados al cáncer (CAF), a menudo el tipo de célula más abundante en el microambiente tumoral (TME), juegan un papel fundamental en la promoción de la progresión del cáncer a través de sus interacciones con las células tumorales y otros componentes del estroma. Dilucidar los mecanismos detrás de estas interacciones requiere métodos sólidos para aislar y caracterizar los CAF, que también pueden sentar las bases para desarrollar nuevas terapias contra el cáncer dirigidas a CAF. Este estudio presenta un método para aislar fibroblastos tanto del tumor como de las regiones normales adyacentes de muestras de prostatectomía radical obtenidas de pacientes con cáncer de próstata (CaP). Este enfoque permite el aislamiento simultáneo de CAF y sus contrapartes normales (NF) del mismo individuo, proporcionando un sistema experimental emparejado. Se proporcionan protocolos detallados para el mantenimiento de los CAF y NF primarios para los análisis in vitro posteriores, así como para su inmortalización para facilitar los estudios a largo plazo. También describimos ensayos funcionales diseñados para comparar los efectos de los CAF y NF en los comportamientos de las células cancerosas, incluida la proliferación, la migración y el crecimiento independiente del anclaje. Se detallan dos enfoques complementarios: tratamiento de células cancerosas con medios condicionados (CM) derivados de fibroblastos y cocultivo directo de fibroblastos con células tumorales. Juntas, estas metodologías representan un conjunto de herramientas integral para investigar la interacción dinámica entre los CAF y las células tumorales, no solo en el CaP, sino potencialmente en una variedad de cánceres humanos. Además, la caracterización molecular de estas interacciones puede revelar mediadores clave de la oncogénesis impulsada por CAF, ofreciendo objetivos prometedores para la intervención terapéutica.
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia en hombres en casi dos tercios de los países del mundo. En 2022, se notificaron aproximadamente 1,5 millones de nuevos casos, lo que provocó 3.97.000 muertes en todo el mundo. Estas cifras convierten al CaP en el segundo cáncer más común y la quinta causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer entre los hombres1.
El CaP es una enfermedad multifocal y biológicamente compleja, caracterizada por una heterogeneidad intertumoral sustancial 2,3,4....
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Protocolo
Este estudio se realizó en pleno cumplimiento de las directrices institucionales para el uso de muestras clínicas, aprobadas por el Comité de Bioética del Hospital Città della Salute Molinette de Turín, Italia. Todas las muestras se obtuvieron después de la firma del consentimiento informado por parte de los pacientes participantes. La siguiente sección proporciona un protocolo detallado paso a paso para el aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y sus contrapartes de fibroblastos normales (NF) compatibles. El protocolo incluye la disección del tumor y las áreas no tumorales adyacentes, el procesamiento de tejidos, el cu....
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Resultados
Los pares CAF y NF de 7 pacientes con CaP de alto grado se aislaron con éxito con este protocolo. La edad de los pacientes en el momento de la cirugía y las puntuaciones de Gleason se resumen en la Tabla 3. Para evaluar la pureza de las poblaciones de fibroblastos derivados, se separaron dos CAF y NF primarios y se tiñeron con los anticuerpos fluorescentes indicados o con yoduro de propidio para evaluar la apoptosis. Los resultados representativos del análisis FACS poste.......
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Discusión
La derivación y el análisis de células a partir de tejido CaP proporcionan un modelo experimental relevante, particularmente considerando que los modelos animales disponibles no replican completamente la anatomía de la próstata humana y la progresión de la enfermedad37. Las glándulas prostáticas de los chimpancés son anatómicamente similares a las de los humanos, pero muestran una progresión lenta y estocástica de la enfermedad, además de implicar limitaciones éti.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Asociación Italiana de Investigación del Cáncer (AIRC), IG16930 y IG24851 a V.P; el Ministerio de Universidad e Investigación italiano (MIUR PRIN 2017 y 2022 a V.P.); la Fundación Truus y Gerrit van Riemsdijk, Liechtenstein, donación a V.P.; Región de Piamonte (Desviar). A.S. contó con el apoyo de una beca postdoctoral de la Fundación Italiana para la Investigación del Cáncer (FIRC), y L.A. contó con el apoyo de la Fondazione Umberto Veronesi. Figura 2 fue creado con BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 12 pocillos | Sarstedt | 833921 | |
| Placa de 24 pocillos | Sarstedt | 833922 | |
| Placa de 6 pocillos | Sarstedt | 833920 | |
| Placa de 96 pocillos | Sarstedt | 833924 | |
| Cartucho de ratón anti-GAPDH (6C5) | Sigma Aldrich | CB1001 | Fuente: Mouse; Dilución para WB: 1:1000 |
| AMNa | Sigma Aldrich | A5228 | Fuente: Mouse; Dilución para WB: 1:3000 |
| Caveolina | Tecnología de señalización celular | CST3267 | Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000 |
| CD31-VioBlue | Milteny Biotec | 130-119-980 | Citometría de Flujo Ab, Marcador de Células Endoteliales |
| CD326-PE (EpCAM) | Milteny Biotec | 130113-826 | Citometría de flujo Ab, marcador de células epiteliales |
| CD45-FITC | Milteny Biotec | 130-110769 | Citometría de flujo Ab, marcador leucocitario Pan |
| CD90-APC | Milteny Biotec | 130-114-903 | Citometría de flujo Ab, marcador de fibroblastos |
| Colágeno VI (COL6A1) | Abcam | AB182744 | Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000 |
| Tubo cónico 15 mL | Sarstedt | 62554502 | |
| Tubo cónico 50 mL | Sarstedt | 62547254 | |
| Microtubos Cryopure de 2 ml | Sarstedt | 72380992 | |
| Placa de cultivo de 100 mm de diámetro | Corning | 353003 | |
| Placa de cultivo de 100 mm de diámetro | Corning | 353025 | |
| Placa de cultivo de 60 mm de diámetro | Corning | 353002 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma Aldirch | D8418 | Uso en una campana biológica |
| Dulbecco' s Águila modificada' s Medio (DMEM) | Gibco | 11965092 | Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica |
| FAP | Abcam | AB53066 | Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:500 |
| Reactivo de bloqueo de FcR, humano | Milteny Biotec | 130-059-901 | Bloqueador de Fc |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 16000044 | Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica |
| Puntas filtradas 10 µ L | Sarstedt | 703010255 | |
| Puntas filtradas 100 µ L | Sarstedt | 703030255 | |
| Puntas filtradas 1000 µ L | Sarstedt | 703060255 | |
| Puntas filtradas 20 µ L | Sarstedt | 703030265 | |
| Puntas filtradas 200 µ L | Sarstedt | 703031255 | |
| Filtropur S Plus 0,20 µ m | Sarstedt | 831826102 | |
| Pinza | 2Biol | 1102412 | |
| FSP1/S100A4 | Tecnología de señalización celular | D9F9D (13018) | Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:2000 |
| IL6 | Tecnología Abclonal | A0286 | Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000 |
| ImagenJ | Instituto Nacional de Salud | Versión 1.53c | Software para el análisis de imágenes |
| Placa de 96 pocillos Incucyte ImageLock | Sartorio | BA-04857 | |
| Incucyte® SX5 | Sartorio | SX5 | Instrumento de análisis de células vivas |
| Reactivo de transfección Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Reactivo de transfección mediado por lípidos catiónicos |
| MACS® Solución de almacenamiento de tejidos | Milteny Biotec | 130-100-008 | |
| Lector de microplacas (absorbancia de 600 nm) | Promega | GM3500 | |
| Microtubos 1,5 mL | Sarstedt | 7269001 | |
| NCAD | Abcam | AB18203 | Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000 |
| Nitro Blue Tetrazolium | Sigma Aldirch | N5514 | |
| Parafilm | Sigma Aldirch | HS234526B | |
| pBABE-puro-hTERT | Addgene | 1771 | Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica |
| pCL-Ampho | Novus Biological | NBP2-29541 | Almacenar a -20 &grados; C, uso en una campana biológica |
| PDGFRB | Santa Cruz | SC-432 | Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000 |
| Penicilina-Estreptomicina (PS, 10,000 μ g/mL) | Gibco | 15140122 | Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica |
| Microscopio de contraste de fases | Olimpo | BX42 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Casero | NaCl, 137 mM; KCl, 2,7 mM; Na2HPO4, 10 mM;KH2PO4, 1,8 mM. Autoclave y Tienda en RT | |
| Solución de poli-L-lisina | Sigma Aldirch | P8920 | Almacenar a 4 ° C, uso en una campana biológica |
| Clorhidrato de puromicina | Sigma Aldirch | P8833 | |
| Balanza semimicro Secura | Sartorio | SECURA125-1S | |
| Pipeta serológica 10 mL | Sarstedt | 861254001 | |
| Pipeta serológica 2 mL | Sarstedt | 861252001 | |
| Pipeta serológica 25 mL | Sarstedt | 861256001 | |
| Pipeta serológica 5 mL | Sarstedt | 861253001 | |
| ESTADÍSTICA3 | CST | 9139 | Fuente: Mouse; Dilución para WB: 1:1000 |
| STAT3 Y705 | CST | 9131 | Fuente: Conejo; Dilución para WB: 1:1000 |
| microscopio estereoscópico | Leica | MZ125 | |
| Jeringa 10 mL | Pentaferte | 00202260D12 | |
| TermoMixer | Eppendorph | 22331 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), sin rojo fenólico | Gibco | 15400054 | |
| Vim | Santa Cruz | SC-6260 | Fuente: Mouse; Dilución para WB: 1:2000 |
| Concentrador centrífugo Vivaspin 20 | Sigma Aldirch | Z614602 | MWCO 10,000 Días |
| Tijeras Wagner | 2Biol | 14070-12 |
Referencias
- Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
- Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumo....
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Reimpresiones y permisos
