Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos asociados al cáncer de próstata

El cáncer de próstata (CaP) es el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia en hombres en casi dos tercios de los países del mundo. En 2022, se notificaron aproximadamente 1,5 millones de nuevos casos, lo que provocó 3.97.000 muertes en todo el mundo. Estas cifras convierten al CaP en el segundo cáncer más común y la quinta causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer entre los hombres¹.

El CaP es una enfermedad multifocal y biológicamente compleja, caracterizada por una heterogeneidad intertumoral sustancial ^2,3,4, diversos subtipos moleculares y resultados clínicos variables ^5,6, todo lo cual influye significativamente en el pronóstico y la respuesta terapéutica⁷.

Si bien el papel crítico del microambiente tumoral (TME) en el inicio y la progresión del tumor de próstata está bien establecido ^8,9, las interacciones moleculares entre las células tumorales y el compartimento estromal circundante siguen sin comprenderse por completo. Si bien está bien establecido que el microambiente tumoral de próstata (TME) juega un papel crítico en el inicio y la progresión del tumor, las interacciones moleculares entre las células tumorales y el estroma circundante siguen sin estar suficientemente definidas. El TME comprende una variedad de células estromales, incluidas las de origen mesenquimal e inmunológico, que se activan en respuesta a señales derivadas del tumor y posteriormente adquieren funciones promotoras de tumores^10,11. Entre estos, los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) a menudo representan la población estromal más abundante. Los CAF contribuyen a la remodelación de la matriz extracelular (MEC), promueven el crecimiento tumoral y facilitan la invasión y migración de células cancerosas 4,11,12,13. A través de factores secretados e interacciones directas célula-célula, los CAF también influyen en la proliferación, la invasión y la resistencia a la terapia. En particular, los CAF son una población heterogénea. Aunque generalmente se asocian con funciones protumorigénicas, algunos subtipos pueden ejercer funciones supresoras de tumores^14,15. Es importante destacar que la ausencia de marcadores únicos para los CAF plantea desafíos para su identificación precisa y la disección funcional de sus diversos roles^12,16.

Un enfoque sólido para investigar la diafonía funcional entre los CAF y las células tumorales implica aislar los CAF primarios y los fibroblastos normales (NF) emparejados, y luego evaluar su influencia respectiva en los comportamientos de las células tumorales, como la proliferación, la migración, la formación de colonias y el crecimiento independiente del anclaje 17,18,19. Este artículo describe un protocolo refinado y altamente reproducible para aislar CAF y NF de muestras de prostatectomía radical de pacientes con CaP de alto riesgo. Un componente crítico de este protocolo es la identificación y disección precisas del tumor y las regiones libres de tumores por parte de un uropatólogo experto, lo que permite la derivación de CAF y NF del mismo paciente. Este enfoque de muestra emparejada ayuda a controlar la heterogeneidad intertumoral y las variables específicas de cada paciente que pueden influir en los fenotipos de fibroblastos 20,21,22. Para garantizar que haya suficiente tejido tumoral disponible, nos enfocamos en muestras de pacientes con una puntuación de Gleason ≥7.

La caracterización fenotípica confiable de los fibroblastos aislados requiere el uso de múltiples marcadores para distinguirlos de otros tipos de células, particularmente de las células epiteliales, que pueden compartir la expresión de marcadores superpuestos¹⁶. Dado que los fibroblastos primarios de CaP suelen sufrir senescencia después de 10-15 pasajes, lo que complica los análisis a largo plazo, también presentamos un protocolo para la inmortalización celular mediante la expresión estable de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT)²³.

Para explorar los efectos funcionales de los CAF y NF en las células tumorales, probamos y optimizamos varias estrategias experimentales. Dado que los CAF ejercen su influencia tanto a través de factores secretados como de contacto directo célula-célula²⁴, se desarrollan dos sistemas de ensayo complementarios: (1) tratamiento de células cancerosas con medio condicionado por fibroblastos (CM) y (2) cocultivo directo de fibroblastos y células tumorales. Estos ensayos evalúan las propiedades clave de las células cancerosas, incluida la proliferación, el crecimiento independiente del anclaje y la migración. Para estandarizar la influencia de los factores secretados, se concentraron y cuantificaron los medios condicionados de CAF y NF (conCM) en función del contenido total de proteínas.

La demostración de efectos funcionales significativos a través de estos ensayos puede respaldar la identificación de mediadores críticos de la tumorigénesis impulsada por CAF, ofreciendo objetivos potenciales para la intervención terapéutica.

Este estudio se realizó en pleno cumplimiento de las directrices institucionales para el uso de muestras clínicas, aprobadas por el Comité de Bioética del Hospital Città della Salute Molinette de Turín, Italia. Todas las muestras se obtuvieron después de la firma del consentimiento informado por parte de los pacientes participantes. La siguiente sección proporciona un protocolo detallado paso a paso para el aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y sus contrapartes de fibroblastos normales (NF) compatibles. El protocolo incluye la disección del tumor y las áreas no tumorales adyacentes, el procesamiento de tejidos, el cultivo celular y la caracterización fenotípica y funcional de las células aisladas. Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles dentro de un gabinete de bioseguridad certificado. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO₂ utilizando medio Eagle modificado de Dulbecco completo (cDMEM), suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, a menos que se indique lo contrario. Todos los pasos de centrifugación se realizan con el freno activado. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista completa de los reactivos, materiales y equipos utilizados a lo largo del protocolo. Esta metodología se ha optimizado para muestras de cáncer de próstata de alto riesgo, con una puntuación de Gleason de 4+3 o superior.

1. Disección de muestras quirúrgicas

NOTA: Este procedimiento se realizó en muestras quirúrgicas recolectadas de procedimientos de prostatectomía radical²⁵ realizados en pacientes con cáncer de próstata de alto grado (CaP), y se manejó siguiendo protocolos estandarizados, basados en guías institucionales internas y literatura internacional establecida y mejores prácticas 26,27,28.

1. Coloque la glándula prostática debajo de una capucha de bioseguridad sobre un paño estéril y oriéntela de acuerdo con los puntos de referencia anatómicos.
   NOTA: Este procedimiento debe ser realizado por un uropatólogo experimentado.
2. Con una cuchilla estéril, extraiga cortes de tejido de las áreas identificadas en el informe de biopsia preoperatoria como neoplásicas o libres de células tumorales.
3. Realizar un análisis criostático rápido²⁹ en ambas muestras de tejido, preparando secciones de tejido de 2,5 μm de espesor y tiñéndolas con hematoxilina y eosina (H&E) para verificar la presencia o ausencia de células tumorales en las regiones seleccionadas, de acuerdo con los criterios diagnósticos de adenocarcinoma prostático de la última edición de la clasificación de la OMS³⁰ (ver Figura 1A).
   NOTA: Si surgen discrepancias, repita el proceso de muestreo hasta obtener la confirmación histológica de las áreas neoplásicas y no neoplásicas.
4. Extraiga muestras de aproximadamente 10 mm² de las regiones neoplásicas y no neoplásicas, colóquelas en tubos cónicos de 15 ml que contengan 7 ml de tampón de almacenamiento de tejidos helado y manténgalas en hielo para procedimientos posteriores.
   NOTA: Las muestras se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 48 h en este tampón.

2. Aislamiento de fibroblastos

NOTA: Todos los procedimientos de procesamiento siguientes deben realizarse en hielo a 4 °C a menos que se indique lo contrario. Consulte la Figura 1 A para ver un esquema.

1. Día 1: Pesar las muestras de tejido.
   NOTA: Se obtienen 70-100 mg en promedio.
2. Pase a platos de 6 cm y realice cuatro lavados secuenciales, dos veces en 4 ml de PBS helado y dos veces en 4 ml de cDMEM helado, ambos suplementados con 200 U/ml de penicilina, 200 μg/ml de estreptomicina (2x), utilizando pinzas estériles para transferir el tejido de un plato a otro.
3. Alterar mecánicamente el tejido colocándolo en una placa de 6 cm sobre hielo, con 1 ml de DMEM suplementado con 100 U/ml de penicilina-G y 100 μg/ml de estreptomicina, luego picarlo en pequeños fragmentos (<1 mm²) con tijeras o cuchillas.
4. Transfiera a un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de cDMEM helado. Centrifugar a 754 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Utilice una pipeta de 10 ml para eliminar con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 5 ml de cDMEM helado. Centrifugar de nuevo a 754 x g durante 5 min a 4 °C.
6. Retire el sobrenadante como se indicó anteriormente y vuelva a suspender el sedimento en colagenasa II (1 mg / ml en DMEM), utilizando 1 ml / 100 mg de tejido. Cambie a un microtubo de 1,5 ml.
   NOTA: Debido a la variabilidad de los lotes de colagenasa, pruebe diferentes lotes y asegúrese de que tengan suficiente para realizar todos los aislamientos previstos.
7. Cubra los tubos con película de parafina y digiera las muestras O/N (8-12 h) a 37 °C con balanceo continuo.
   NOTA: Realice los siguientes pasos el día 2.
8. Transfiera las muestras a tubos cónicos de 15 ml y agregue 5 ml de cDMEM helado a la suspensión celular para inactivar la colagenasa, luego centrifugue a 754 x g durante 5 min a 4 ° C.
   NOTA: La colagenasa se elimina aspirándola a un recipiente que contenga detergente.
9. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 10 ml y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de tripsina / EDTA al 0,05%. Incubar durante 5 min a 37 °C, agitando ocasionalmente.
10. Agregue 1 ml de ADNasa I a las muestras y mezcle bien. Use una solución de 25 mg/ml recién preparada en PBS.
    NOTA: El tratamiento con DNasa I en esta etapa ayuda a obtener la solución unicelular.
11. Centrifugar a 754 x g durante 5 min a 4 °C.
12. Utilice una pipeta de 10 ml para aspirar el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 5 ml de cDMEM frío. Centrifugar a 754 x g durante 5 min 4 °C.
13. Resuspender células en cDMEM FBS al 20%. Colocar en placas e incubar a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad durante al menos 3 días. Tenga cuidado de no mover / inclinar el plato. Para 70-100 mg de tejido, distribuir la suspensión celular en 2 platos de 3,5 cm, en 2 mL de medio. Reduzca la escala en consecuencia si es necesario.
    NOTA: Menos de 50 mg de tejido resultarán en una derivación celular ineficiente. El esquema de división y congelación se muestra en la Figura 1B.
14. Después de 3 días, verifique la morfología / viabilidad de las células y reemplace 2/3 del medio para mantener los factores de crecimiento producidos por las células. Las células tardarán entre 7 y 10 días en alcanzar la confluencia, reemplazando el medio cada dos días.
15. Una vez confluentes, pasar las células a un plato de 10 cm en cDMEM de FBS al 20%.
16. Reemplace el medio cada dos días, usando medio FBS al 15% dos veces, luego una vez, 12.5%, luego 10%. Para los análisis FACS, las existencias de extracción y congelación de ARN y proteínas siguen el esquema de la Figura 1B.
17. Divida las células cuando aproximadamente el 100% confluente (aproximadamente 10 días). Lavar 2-3 veces con abundante PBS durante 5 min cada una. Agregue tripsina / EDTA al 1% (2x) y colóquelo en la incubadora, verificando si hay desprendimiento celular cada pocos minutos.

3. Condición de cultivo

1. Pase las células solo cuando el 100% confluya, no más de 1: 3.
2. Congelar las alícuotas correspondientes al 50% de una placa confluente de 10 cm en 0,5 mL de medio de congelación helado (10% de DMSO en FBS). Descongele cada alícuota en un plato de 10 cm.
   NOTA: El tiempo medio de duplicación es de 80-90 h.

4. Análisis FACS

NOTA: Este protocolo garantiza una caracterización confiable de la población de fibroblastos e identifica la posible contaminación de células epiteliales, endoteliales o inmunitarias. El análisis FACS se realiza en el pasaje 2, como se ilustra en la Figura 2A.

1. Recoja las células y vuelva a suspenderlas en tampón FACS (PBS más 2% FBS) a una concentración de 10⁶ células/ml.
2. Etiquete los tubos de citometría de flujo y agregue 1 x 10^{5 células} en un volumen de 100 μL en cada uno de ellos. Para la tinción con 4 anticuerpos, prepare 11 tubos para tener en cuenta tanto la tinción como la compuerta, de la siguiente manera (Tabla 1)
   NOTA: 1 tubo, sin anticuerpos (control sin teñir), para evaluar la autofluorescencia celular, 1 tubo con control de isotipo de anticuerpo, para evaluar una unión específica, 4 tubos, cada uno con un solo anticuerpo, para compensación; las perlas de compensación pueden reemplazar las células, 4 tubos de fluorescencia menos uno (FMO) para la compuerta, cada uno de los cuales deja fuera uno de los anticuerpos, 1 tubo con los 4 anticuerpos (muestra real). Se utilizan los siguientes anticuerpos marcados con fluorescencia (consulte la tabla de materiales): (1) Anti-EpCAM-PE (marcador de células epiteliales), (2) Anti-CD31-VioBlue (marcador de células endoteliales), (3) Anti-CD45-FITC (marcador de células inmunitarias), (4) Anti-CD90-APC (marcador de células de fibroblastos). Se pueden usar anticuerpos conjugados con otros fluoróforos, de acuerdo con los filtros de citómetro de flujo disponibles. Realice todos los pasos en hielo para preservar la viabilidad celular.
3. Incubar células con bloqueadores de receptores cristalizables de fragmentos (FcR), como anticuerpos anti-CD16/CD32 purificados o tampón de bloqueo (PBS 1%-2% BSA). Utilice 1-5 μL de reactivo de bloqueo de FcR por cada 100 μL de suspensión celular e incube a 4 °C durante 10-15 min.
4. Proceda directamente con la tinción sin lavar. Agregue las diluciones de anticuerpos apropiadas o los controles de isotipo correspondientes a los tubos, como se especifica en la Tabla 1.
5. Mezclar suavemente e incubar a 4 °C en la oscuridad durante 30 min.
6. Lavar con 2 ml de tampón FACS.
7. Centrifugar durante 5 min a 300 x g, a 4 °C.
8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón FACS nuevo.
9. Agregue un colorante de viabilidad (yoduro de propidio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
10. Adquiera las muestras en un citómetro de flujo.
11. Utilice controles de compensación de una sola tinción para configurar la matriz de compensación. Para el análisis de datos, aplique la siguiente estrategia de compuerta en gráficos de densidad FACS:
12. Activación de dispersión frontal y lateral: gráfico FSC-A vs. SSC-A y diseñar una región alrededor de la población celular principal para excluir los desechos celulares.
13. Para la exclusión de dobletes: grafique FSC-A vs. FSC-W (o FSC-H vs. FSC-A) y diseñar una región para excluir grupos de celdas, lo que mostrará un mayor ancho en relación con el área (o un mayor área en relación con la altura). Seleccione las celdas individuales y realice el mismo procedimiento, trazando SSC-A vs. SSC-W (o SSC-H vs. SSC-A) para aumentar la pureza de la población de una sola célula.
14. Grafique el colorante de viabilidad (es decir, yoduro de propidio) vs. SSC-A y seleccione células vivas negativas.
15. En células vivas, grafique CD326 (eje x) vs. CD31 (eje y); utilice las muestras de FMO correspondientes para establecer puertas con precisión. FMO permite tener en cuenta la propagación de la fluorescencia en un canal específico causada por los otros fluoróforos.
    1. Mirando la muestra de FMO CD326, dibuje una puerta de cuadrante que incluya todas las células en los cuadrantes izquierdos (es decir, negativo para CD326). Repita el mismo procedimiento usando la muestra de FMO CD31 para ajustar la puerta para tener todas las celdas FMO en los cuadrantes inferiores (es decir, negativas para CD31). Utilice este cuadrante para analizar las muestras y seleccione las celdas del cuadrante inferior izquierdo (CD31^- CD326^-).
16. Repita el mismo procedimiento trazando CD326 (eje x) vs. CD45 (eje y), utilizando el FMO CD326 y el FMO CD45 para establecer la puerta del cuadrante. Utilice este cuadrante para analizar todas las muestras y seleccionar las células del cuadrante inferior izquierdo (CD45-CD326^-).
17. Gráfico CD90 vs. SSC-A y use el FMO CD90 para establecer una región que excluya las células negativas e incluya solo CD90⁺. Utilice esta región para analizar todas las muestras, midiendo el porcentaje de células CD90⁺ . Los resultados representativos se muestran en la Figura 2A.

5. Inmortalización de fibroblastos

NOTA: La inmortalización de las poblaciones de CAF y NF se logra mediante transducción estable con un vector retroviral que expresa hTERT. A continuación se muestran los protocolos para preparar partículas pseudovirales infecciosas y transducir células.

1. Producción de partículas retrovirales
   1. Día 1, recubrimiento de poli-L-lisina y recubrimiento de celdas: Cubra un plato de 10 cm con 6 ml de solución de poli-L-lisina (0,1 mg / ml en H₂O), incube 5 min debajo de la campana TC, aspire y deje que el plato abierto se seque debajo del capó antes de sembrar 3 x 10⁶ HEK293T celdas.
   2. Día 2: Agregue 30 μL de reactivo de transfección mediado por lípidos catiónicos a 0,75 ml de medio optimizado para lipofección sin antibióticos.
   3. Paralelamente, agregue 2 μg de pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector y 2 μg de plásmidos pBABE-puro-hTERT a otros 0,75 ml de medio optimizado para lipofección libre de antibióticos.
   4. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
   5. Mezclar las dos diluciones en un tubo cónico de 15 ml e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
   6. Mientras tanto, reemplace el medio HEK293T con 6 ml de medio optimizado para lipofección complementado con un 10% de FBS.
   7. Distribuya suavemente los complejos de ADN en la superficie del plato e incube durante 6 h a O/N en una incubadora de_CO2 humidificada.
   8. Día 3: Sustituir el medio por 7 mL de cDMEM e incubar durante 48 h.
      NOTA: A partir de este paso, el trabajo debe realizarse en una instalación de cultivo de tejidos de nivel 3 de bioseguridad (BSL3), siguiendo las reglas institucionales.
   9. El día 5, recoja el medio que contiene virus y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
   10. Alícuota y conservar a -80 °C.
2. Transducción viral
   1. Día 1: Placa de fibroblastos de paso bajo al 60% de confluencia en 2 pocillos de una placa de 6 pocillos.
   2. Día 2: Reemplace el medio con 1 ml de la preparación retroviral pBABE-puro-hTERT producida anteriormente que contiene 8 μg / ml de polibeno e incube durante 12-16 h.
   3. Día 3: Reemplace el medio que contiene virus con 2 ml de cDMEM.
   4. Día 4: Después de 24 h, comience dos rondas de 48 h de selección de puromicina (2 μg / mL).
      NOTA: La concentración debe determinarse empíricamente para cada lote de antibiótico y tipo de célula, y se debe seleccionar la concentración más baja para matar todas las células dentro de los 4 días posteriores a la selección.
   5. Día 8: Verifique que todas las células de control no infectadas hayan muerto. Reemplace el medio con cDMEM y deje que las células infectadas crezcan hasta que confluyan antes de pasarlas 1:3. Deje que las células alcancen la confluencia y se dividan nuevamente 1:3. En esta etapa, las células pueden salir de la instalación BLS3.
      NOTA: Prepare alícuotas congeladas lo antes posible. Para asegurarse de que se haya producido la inmortalización, pase las células 5-6 veces y califique su morfología y tasas de duplicación, que no deberían cambiar con los pasajes. Comparar funcionalmente las células inmortalizadas con sus contrapartes primarias, utilizando los métodos que se describen a continuación.

6. Caracterización de fibroblastos

1. Analizar fenotípicamente las células aisladas para la expresión de marcadores CAF / NF y caracterizar funcionalmente sus posibles actividades prooncogénicas en las células tumorales.
   NOTA: Los oligonucleótidos y anticuerpos qPCR optimizados para evaluar los niveles de expresión de marcadores tanto a nivel de ARN como de proteína se informan en la Tabla 2 y la Tabla de materiales, respectivamente. Tenga en cuenta que los anticuerpos contra la proteína de activación de fibroblastos (FAP) a menudo no son específicos. Asegúrese de incluir controles positivos y negativos apropiados ^31,32. Se pueden utilizar diferentes métodos para evaluar la diafonía entre los fibroblastos y las células tumorales. Aquí, se describen dos enfoques alternativos, que consisten en tratar las células tumorales con un medio condicionado (CM) derivado de CAF o NF, o cocultivar fibroblastos y células tumorales. Se describe la eficacia de cualquiera de los enfoques para mejorar la proliferación de células tumorales.

7. Preparación y concentración del medio acondicionado

NOTA: El medio acondicionado se concentra y se dosifica con precisión después de la recolección para facilitar la comparación entre diferentes células.

1. Coloque las células al 70% de confluencia en un plato de 15 cm en cDMEM.
2. Al día siguiente, cambie a 15 ml de medio de inanición (DMEM sin FBS) e incube durante 48 h para producir el CM.
3. Recoja el CM, centrifugue a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y filtre a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar los restos celulares y esterilizar.
4. Transferir a tubos concentradores (MWCO 10.000 Da) y centrifugar 20 min a 2000 x g y 4 °C, o según las instrucciones del fabricante, para obtener aproximadamente 1 mL del CM concentrado (conCM), es decir, 15 x concentración.
5. Alícuota el conCM y almacenar a -80 °C.
6. Cuantifique el contenido de proteínas de la conCM recolectada mediante un ensayo colorimétrico de proteínas.
   NOTA: La concentración media obtenida es de 0,5 y 2 μg/μL. Todavía se pueden utilizar concentraciones más bajas.

8. Ensayo de proliferación

NOTA: La proliferación celular (utilizando líneas celulares PCa humanas DU145 o LNCaP) se evaluó utilizando un instrumento de análisis de células vivas en dos entornos diferentes, ya sea tratando las células tumorales con conCM o cultivándolas conjuntamente con CAF o NF. En este caso, se deben usar células tumorales fluorescentes. Los resultados representativos se muestran en la Figura 3.

1. Ensayo de proliferación tras el tratamiento con conCM
   NOTA: Este protocolo está optimizado para celdas DU145; diferentes celdas pueden requerir ajustes.
   1. Plaque las células tumorales en cDMEM en una placa de 96 pocillos (750 células/pocillo), considerando al menos 3 réplicas por afección, e incube O/N.
   2. Reemplace cDMEM con medio de inanición, suplementado o no, con 50 μg / ml de conCM.
   3. Transfiera la placa a la cámara del instrumento de análisis de células vivas dentro de la incubadora.
   4. Deje calentar a 37 °C durante 30 min, luego comience la primera exploración.
   5. Utilice el canal de contraste de fase, eligiendo un objetivo apropiado y el número de campos/pocillos deseados (se recomiendan 10x objetivo y 5 campos/pocillo) y el tipo de escaneo estándar. Eche cada 6 h durante 4-5 días (la duración debe determinarse empíricamente para las condiciones y los tipos de células).
   6. Realice el análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
   7. Calcule para cada pocillo (réplicas técnicas para cada condición) el cambio de pliegue en relación con su valor en el momento cero. Genere los gráficos correspondientes y evalúe la significación estadística utilizando el software adecuado.
2. Ensayo de proliferación en el cocultivo
   1. Coplaca 750 células DU145 que expresan RFP y CAF o NF en una proporción de 1:3 en cDMEM en una placa de 96 pocillos.
   2. Al día siguiente, cambie a FBS DMEM al 2%. Transfiera la placa a la cámara del instrumento de análisis de células vivas en la incubadora e inicie el escaneo estándar cada 6 h durante 4 días, utilizando tanto el contraste de fase como el canal naranja.
   3. Realice análisis de proliferación de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
   4. Calcule para cada pocillo (réplicas técnicas para cada condición) el cambio de pliegue en relación con su valor en el momento cero. Genere los gráficos correspondientes y evalúe la significación estadística utilizando el software adecuado.

9. Ensayo de migración de cicatrización de heridas

NOTA: Aquí, se presenta una versión automatizada del ensayo clásico de raspado³³ para medir la migración celular, utilizando un instrumento de análisis de células vivas.

1. Placas de células tumorales en una placa de 96 pocillos adecuada para el instrumento de análisis de células vivas para obtener una monocapa confluente.
2. Al día siguiente, tratar las células con 10 ug/mL de mitomicina C durante 2 h.
   NOTA: Este paso es esencial para evitar la proliferación celular durante el ensayo, lo que confundiría los resultados.
3. Aplique el rayado en los pocillos siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
4. Lavar con 100 μL de PBS para eliminar las células desprendidas.
5. Agregue medio de inanición, con 50 mg / ml o sin (control).
6. Coloque la placa en la cámara de análisis de células vivas de la incubadora.
7. Después de 30 min, programe el protocolo de exploración de cicatrización de heridas recomendado, cada 4 h durante 1 día o más, según las células y las condiciones.
8. Analice los resultados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).

10. Crecimiento independiente del anclaje mediante ensayo de agar blando

1. Placas CAF o NF al 70% de confluencia en placas de 12 pocillos, dejando tres pocillos vacíos como control.
2. Al día siguiente, prepare una solución madre de agar blando 4x (3,6%) agregando 0,45 g de agar de bajo punto de fusión a 12,5 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml en condiciones estériles.
3. Disolver en un horno microondas. Tenga cuidado con la ebullición excesiva que haría que la solución se concentre.
4. Enfriar a 37 °C, luego preparar una solución de trabajo 1x diluyendo 1:4 con cDMEM precalentado.
5. Aspire el medio de la placa de 12 pocillos y agregue 500 μL de solución de agar 1x a cada pocillo.
6. Dejar solidificar durante 20 min a 4 °C, mientras se almacena el resto de la solución de agar a 37 °C.
7. Mientras tanto, tripsinizar las células tumorales y preparar una suspensión celular de 2 x 10⁴ células/ml.
8. Mezcle volúmenes iguales de la suspensión celular y la solución de agar 1x pipeteando varias veces y dispense 500 μL (es decir, 5000 células) sobre la primera capa de agar en cada pocillo. Asegúrese de preparar al menos un 10% de exceso de suspensión celular.
9. Deje que el agar se solidifique incubando durante 20 min a 4 °C.
10. Agregue 1 ml de cDMEM a cada pocillo y renuévelo cada dos días aspirando suavemente el medio desde el borde del pocillo y agregando el medio fresco al centro, casi gota a gota para evitar desplazar la capa de agar blando.
11. Incube hasta que aparezcan colonias fácilmente visibles. Las células DU145 suelen tardar unos 12 días, con ligeras variaciones.
12. Deseche el medio y tiña las colonias agregando 200 μL de solución de cloruro de tetrazolio nitroazul (1 mg/mL en PBS). Incubar durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada.
13. Una vez teñidas las colonias, deseche la solución de tinte y adquiera imágenes con un microscopio estereoscópico. Coloque la placa en la platina del microscopio y ajuste el aumento a su valor más bajo (0,8x) para asegurarse de que todo el pocillo sea visible. Use la perilla de enfoque grueso para enfocar las colonias con nitidez, luego ajuste la configuración de iluminación y modo antes de capturar las imágenes.
14. Utilice el software apropiado³⁴ para cuantificar el número de colonias y el área ocupada siguiendo los pasos proporcionados en el Archivo complementario 1.
15. Puntúe la distribución del número y tamaño de las colonias (ver Figura 4).

Los pares CAF y NF de 7 pacientes con CaP de alto grado se aislaron con éxito con este protocolo. La edad de los pacientes en el momento de la cirugía y las puntuaciones de Gleason se resumen en la Tabla 3. Para evaluar la pureza de las poblaciones de fibroblastos derivados, se separaron dos CAF y NF primarios y se tiñeron con los anticuerpos fluorescentes indicados o con yoduro de propidio para evaluar la apoptosis. Los resultados representativos del análisis FACS posterior se muestran en la Figura 2A, destacando la estrategia de activación y los porcentajes de células positivas para cada marcador. El análisis incluyó marcadores de células epiteliales (EpCAM), células endoteliales (CD31), células inmunitarias (CD45) y fibroblastos activados (CD90). Los resultados confirman el aislamiento exitoso de fibroblastos puros, ya que las células fueron en su mayoría negativas para marcadores epiteliales, endoteliales o de células inmunes, y mostraron una positividad variable para CD90, que se considera un marcador de activación de CAF35,36. En muchos casos, particularmente en los primeros pasajes, los CAF mostraron una morfología más similar a la de un huso en comparación con los NF, como se muestra en la Figura 2B. Sin embargo, estas diferencias morfológicas tendieron a disminuir con los pasajes posteriores.

Para evaluar los efectos de los CAF y NF en la proliferación de células DU145, se realizaron ensayos de proliferación utilizando dos enfoques alternativos: tratamiento de células PCa con conCM de pares CAF / NF (Figura 3A, B) o colocación conjunta de células PCa y fibroblastos en una proporción de 1: 3 (Figura 3C, D). El uso de células fluorescentes RFP-DU145, que pueden ser detectadas específicamente por el filtro naranja del instrumento de análisis de células vivas, permitió distinguir entre los dos tipos de células. Los experimentos mostrados se realizaron utilizando CAF y NF derivados del mismo paciente. Ambos enfoques podrían demostrar la actividad proproliferativa de los fibroblastos. Sin embargo, las diferencias entre CAF y NF fueron evidentes principalmente con el enfoque conCM, como se muestra claramente en los gráficos (Figura 3B, D). Los efectos variables de conCM de diferentes pares CAF / NF se ilustran en la Figura 3E.

El crecimiento independiente del anclaje es una característica que a menudo se considera como un indicador de la capacidad metastásica. Entre varios métodos para evaluar los efectos de los CAF / NF en el crecimiento independiente del anclaje de las células de CaP, los mejores resultados se obtuvieron mediante el cocultivo de fibroblastos y células tumorales sin contacto directo. Los fibroblastos se sembraron en placas de 12 pocillos y se cubrieron con una capa de agar blando al 0,9% en cDMEM, sobre la cual se colocaron células tumorales en agar blando al 0,45% cDMEM. La formación de colonias se monitoreó durante 12 días. Las imágenes representativas de las colonias DU145 obtenidas se muestran en la Figura 4A, junto con los gráficos correspondientes que analizan el número de colonias de diferentes tamaños. Cabe destacar que tanto los CAF como los NF pudieron estimular de manera similar la capacidad de formación de colonias de las células DU145 en comparación con las células de control sembradas sin una capa alimentadora de fibroblastos. Las colonias también tendían a crecer, lo que sugiere una mayor proliferación. Un problema que hemos encontrado ocasionalmente con este ensayo es el desprendimiento temprano de la capa de fibroblastos, posiblemente debido a una densidad o temperatura incorrectas del agar blando al sembrar. En estos casos, el experimento se suspendió (Figura 4B).

También se evaluó el crecimiento independiente del anclaje inducido por CAF/NF tras el tratamiento con conCM. Brevemente, las células DU145 sembradas en agar blando se colocaron en capas con 1 ml de DMEM FBS al 5%, más o menos 50 μg/ml de conCM, reemplazándolo cada 4 días hasta la finalización del ensayo. Sin embargo, en estas condiciones, las células DU145 no pudieron formar colonias de buen tamaño y no se observó ninguna mejora en el tratamiento con conCM, como se muestra en la Figura 4C.

Figura 1: Esquemas de aislamiento y cultivo de fibroblastos. (A) Representación escalonada del procedimiento para la disección y aislamiento de fibroblastos de muestras de pacientes con CaP. Las imágenes representan las criosecciones de H&E que identifican el tumor y las regiones de tejido normal que se van a diseccionar. (B) Representación esquemática del esquema de división y congelación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis FACS e imágenes representativas de fibroblastos aislados. (A) Los fibroblastos del paciente 11 se derivaron de acuerdo con el procedimiento descrito en la Figura 1A, y el análisis citofluorimétrico se realizó en las células del pasaje 2 como se describe en la Figura 1B. Gráficos de densidad FACS representativos que muestran las estrategias de activación consecutivas (flechas rojas) utilizadas para evaluar la expresión de CD45, CD31, EpCAM y CD90 en la población celular derivada de áreas tumorales o no tumorales (CAF y NF, respectivamente). CD326 = EpCAM, marcador de células epiteliales; CD31, Marcador de células endoteliales; CD45, marcador de células inmunitarias; CD90, un marcador de activación de fibroblastos. Las células fueron negativas para los tres primeros marcadores y variables positivas para CD90. (B) Imágenes representativas del par aislado 11 NF y CAF durante el paso 2. Barras de escala = 2 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ensayos de proliferación en células DU145 PCa. (A, B) Tratamiento con conCM. Se sembraron 750 células DU145 en placas de 96 pocillos y, al día siguiente, se cambiaron a medio de inanición que contenía o no 50 μg/mL de conCM de par 11 CAF/NF como se describe en el texto y se colocaron en un instrumento de análisis de células vivas. (A) muestra cinco campos/pozos escaneados en los momentos indicados. El gráfico de proliferación relevante, calculado como el cambio de pliegue en la densidad celular para las tres condiciones, cada una normalizada a su valor de tiempo 0, se muestra en (B). (C,D) Se sembraron 750 células DU145 que expresan RFP en placas de 96 pocillos en cDMEM, ya sea solas o junto con CAF o NF del mismo paciente en una proporción de 1:3. Al día siguiente, las células se cambiaron a FBS DMEM al 2% y se colocaron en un instrumento de análisis de células vivas. En (C) se muestran 5 campos escaneados de las células fluorescentes/pocillos en los momentos indicados, mientras que (D) muestra el gráfico de proliferación relevante, calculado como cambio de pliegue en el área del objeto naranja, que representa las células tumorales, para las tres condiciones, cada una normalizada a su valor de tiempo 0. Efectos variables de la conCM derivados de 7 pacientes diferentes CAF / NF está representada en (E). Los datos se muestran como media +/-SEM de pozos triplicados. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las tres condiciones (ANOVA de dos vías en medidas repetidas con la prueba posterior de Tukey). *p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001. Barras de escala = 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ensayos de agar blando. (A) El crecimiento independiente del anclaje de las células DU145 se evaluó sembrando células tumorales en una matriz de agar sobre una capa alimentadora de CAF o NF del mismo par que se había sembrado el día anterior, o sin células alimentadoras como control (Ctrl), actualizando el medio con 10% FBS DMEM cada dos días como se describe en el texto. Los gráficos representan la media +/- SEM del número de colonias, ya sea puntuando todas las colonias ≥8 × 103 μm2, o ≥16 × 103 μm2 de tamaño. (B) muestra un experimento como en (A), que tuvo que suspenderse debido al desprendimiento de la capa de alimentación. Consulte el texto para obtener más detalles. (C) Las células DU145 se sembraron en agar blando como se describe en el texto, y se trataron / o no con conCM derivado de CAF o NF en FBS DMEM al 5%. Medium no se actualizó. En estas condiciones, las colonias crecieron significativamente menos que cuando se usaron células alimentadoras de CAF / NF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Preparación de muestras de FACS. La tabla especifica cómo preparar tubos de citometría de flujo para la tinción con cuatro anticuerpos, configurar la compuerta y diseñar el protocolo para el análisis FACS. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Secuencias de cebadores para qRT-PCR. La tabla enumera las secuencias de cebadores directos e inversos utilizadas para evaluar la expresión de genes marcadores CAF conocidos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Información de los pacientes. La tabla informa las edades en la prostatectomía radical (RP) y las puntuaciones de Gleason de todos los pacientes de los que se derivaron pares de CAF y NF. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Calibración de imágenes para ensayo de agar blando. Procedimiento de análisis de imágenes paso a paso para puntuar las colonias y medir el área total ocupada. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.