Artículo de método

Secuenciación de amplicones utilizando las tecnologías de secuenciación de lectura larga

DOI:

10.3791/68370

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29 de agosto de 2025

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1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo se optimizó para la secuenciación profunda dirigida de 18 regiones de resistencia a los medicamentos en Mycobacterium tuberculosis utilizando una plataforma de secuenciación de lectura larga, seguida de un análisis con una línea de bioinformática específica para la tuberculosis diseñada para datos de lectura larga.

Resumen

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La Organización Mundial de la Salud (OMS) sigue haciendo hincapié en la necesidad urgente de contar con un método de diagnóstico rápido, rentable y fácil de utilizar para la tuberculosis (TB) y la tuberculosis resistente a los medicamentos (TB-DR). Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), respaldadas por la OMS, han mejorado significativamente la detección de la TB-DR. Entre estos, la NGS dirigida (tNGS) permite la detección enfocada de mutaciones genéticas asociadas con la resistencia a los medicamentos, eliminando la necesidad de diagnósticos tradicionales basados en cultivos. Un ensayo tNGS ampliamente utilizado proporciona pruebas rápidas y completas de susceptibilidad a los medicamentos, pero se ha optimizado principalmente para plataformas de secuenciación con alta precisión. Sin embargo, el alto costo de estos sistemas de secuenciación ha limitado la accesibilidad en los países de ingresos bajos y medianos, particularmente en África. Las tecnologías de secuenciación portátiles presentan una alternativa prometedora, ya que ofrecen flexibilidad y requisitos de infraestructura reducidos. En este estudio, se extrajo ADN de aislados de tuberculosis resistente a la rifampicina (TB-RR), se amplificó mediante un ensayo de tNGS y se secuenció en una plataforma de secuenciación portátil. Los mismos productos de amplificación también se secuenciaron en una plataforma de secuenciación de lectura corta de alta precisión para servir como referencia. Los datos del secuenciador portátil se procesaron utilizando una tubería bioinformática diseñada para la secuenciación de lectura larga, mientras que los datos de secuenciación de lectura corta se analizaron utilizando una aplicación web establecida. El análisis mostró que el enfoque de secuenciación de lectura larga identificó con éxito las variantes asociadas a la resistencia de alta frecuencia detectadas por la secuenciación de lectura corta, pero exhibió limitaciones en la detección de variantes de baja frecuencia.

Introducción

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La tuberculosis (TB) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo y presenta un desafío continuo para la salud pública, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos 1,2. A pesar de las iniciativas destinadas a mejorar las medidas de control de la TB, los avances han sido lentos, en parte debido a las dificultades para lograr técnicas de diagnóstico rápidas, precisas, rentables e integrales 3,4,5. Si bien los métodos de diagnóstico molecular como los ensayos de sonda lineal (LPA) y las pruebas automatizadas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) han acelerado la identificación de la tuberculosis y la tuberculosis resistente a los medicamentos (DR-TB), su detección limitada de mutaciones restringe las pruebas exhaustivas de susceptibilidad a los medicamentos (DST). Esta limitación es particularmente significativa en los países con alta carga de TB 6,7,8,9.

Para abordar estas limitaciones, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha recomendado el uso de tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), que han surgido como herramientas poderosas para la vigilancia de la TB y la detección de resistencia10,11. Tanto los enfoques de secuenciación del genoma completo (WGS) como los de NGS dirigida (tNGS) ofrecen una cobertura de mutaciones más amplia, lo que permite la identificación de variantes asociadas a la resistencia en múltiples fármacos 8,12,13,14,15. Si bien la secuenciación del genoma completo (WGS) proporciona un informe completo de DST, su dependencia del cultivo lo hace inadecuado para el diagnóstico rápido, ya que el cultivo puede demorar hasta seis semanas 15,16,17. La NGS dirigida ofrece una mejor alternativa ya que no depende de la cultura; La secuenciación se puede realizar directamente a partir de muestras clínicas18. Como resultado, la OMS ha recomendado el uso de tres ensayos de tNGS para DST: Ensayo Deeplex Myc-TB: Este ensayo detecta resistencia a rifampicina, isoniazida, fluoroquinolonas, aminoglucósidos (amikacina, kanamicina, capreomicina), etambutol, pirazinamida y etionamida 19,20,21. Ensayo de tuberculosis centinela: se dirige a la resistencia a la rifampicina, la isoniazida, las fluoroquinolonas y los fármacos inyectables de segunda línea18,20. Ensayo de TB-AQ: Identifica la resistencia a la rifampicina, la isoniazida, las fluoroquinolonas y los fármacos inyectables de segunda línea. Estos ensayos se han optimizado para su uso en la plataforma de lectura corta debido a su alta precisión20. Las plataformas de lectura larga ONT MinION, por otro lado, proporcionan datos en tiempo real, portabilidad y el potencial de implementación rentable22,23. Sin embargo, el uso generalizado de NGS está limitado por las demandas de infraestructura y costo, especialmente con sistemas de lectura corta10.

El ensayo Deeplex es el más completo de los tres ensayos recomendados. El ensayo fue diseñado originalmente para realizar PCR multiplex en 18 regiones asociadas con la resistencia a 13 medicamentos antituberculosos. Sin embargo, la OMS lo recomendó para 10 medicamentos antituberculosos, lo que indica suficiente sensibilidad y especificidad. Este estudio lo optimizó para su uso con ONT MK1B MinION, una plataforma de secuenciación de lectura larga. El sistema de celda de flujo portátil y reutilizable de esta plataforma reduce tanto los costos de infraestructura como los costos potenciales de secuenciación por muestra 4,22,23. Si bien se han desarrollado otros ensayos compatibles con lectura larga, tienden a tener un alcance de DST limitado, generalmente dirigidos solo a un rango estrecho de genes de resistencia. Por el contrario, el ensayo ofrece una amplia cobertura de objetivos, lo que lo convierte en una herramienta de diagnóstico más completa para DSTdescentralizado 24,25. En la Tabla 1 se proporciona una lista detallada de las dianas genómicas amplificadas por el ensayo y sus correspondientes asociaciones farmacológicas, destacando las capacidades diagnósticas del ensayo25.

Antes de la extracción de ADN, las muestras deben descontaminarse e inactivarse en condiciones de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3), siguiendo las precauciones de seguridad necesarias 25,26,27. La amplificación interna y los controles externos deben incorporarse en cada ejecución, con un seguimiento de la contaminación a través de controles negativos y evaluaciones de laboratorio de rutina25. Las métricas de calidad importantes, incluida la profundidad de lectura, la amplitud de la cobertura y el éxito de la amplificación, deben evaluarse después de la secuenciación. Para la secuenciación dirigida, la OMS aconseja una profundidad de lectura mínima de 100x para cada amplicón y una cobertura adecuada de todas las regiones de resistencia a los medicamentos objetivo para permitir la detección de variantes menores que están presentes en ≥5%28. La Organización Mundial de la Salud respalda estos métodos de secuenciación dirigida para identificar la resistencia a los medicamentos de primera y segunda línea, suponiendo que se establezcan sistemas de garantía de calidad y que todas las regiones objetivo estén suficientemente cubiertas28.

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Protocolo

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Esta investigación se llevó a cabo como parte del proyecto TS ELiOT, que recibió la aprobación ética del Comité de Ética de Investigación en Humanos (HREC) de la Universidad de Stellenbosch (N21/09/093) el 20 de octubre de 2021. Además, obtuvo la autorización de Western Cape Health Research para el uso de instalaciones gubernamentales. Las muestras se recolectaron a través de un esfuerzo de colaboración con NHLS Green Point y la Universidad de Stellenbosch, bajo el número de aprobación SU HREC N09/11/296. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la muestra

  1. Inactivación por calor
    1. Incube los cultivos MGIT a 80 °C durante 1 h para lograr una inactivación completa por calor en condiciones BSL-3.
    2. Proceda con la extracción de ADN utilizando el método InstaGene29.
  2. Extracción de ADN
    1. Coloque 5 ml de cultivo de MGIT inactivado por calor en un tubo de 15 ml.
    2. Centrifugar a 4000 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Retire con cuidado el sobrenadante pipeteando, dejando el sedimento.
    4. Añadir 200 μL de reactivo de extracción de ADN basado en quelación al sedimento e incubar a 56 °C durante 15 min.
    5. Transfiera la solución a un tubo con tapón de rosca de 2 ml y agregue tres perlas de vidrio de 2 mm de diámetro a cada uno.
    6. Agite durante 10 s para esparcir las células y coloque los tubos en una incubadora de baño seco a 100 °C durante 8 min.
    7. Homogeneice las muestras con el homogeneizador de perlas con los siguientes ajustes: 3 ciclos de 20 s a 4,0 m/s.
    8. Centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente y transferir cuidadosamente 130 μL del sobrenadante (líquido que contiene ADN) a un tubo de 1,5 mL, evitando sedimentos y residuos.
    9. Vuelva a suspender las perlas moviendo o agitando en vórtice y agregue 156 μL de las perlas al tubo de 1,5 ml que contiene el ADN extraído.
    10. Pipetear lentamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    11. Coloque los tubos en una rejilla magnética durante 5 minutos para separar las perlas unidas al ADN.
      NOTA: Un sobrenadante transparente debe aparecer sobre una bolita compacta de perlas magnéticas oscuras en el lado del tubo que mira hacia el imán, lo que indica que está listo para la eliminación del sobrenadante.
    12. Pipetea el sobrenadante sin alterar las cuentas.
    13. Agregue 100 μL de etanol al 80% recién preparado al gránulo de perlas mientras está en la rejilla y déjelo durante 30 s, luego retire el etanol. Repita el paso de lavado.
    14. Seque al aire el gránulo de perlas a temperatura ambiente durante 5 min. Asegúrese de que el gránulo de perlas se vea mate y no quede líquido visible antes de continuar con el siguiente paso.
    15. Retire el tubo de la gradilla magnética.
    16. Agregue 25 μL de agua libre de nucleasas (NFW) directamente a las perlas secas y vuelva a suspender pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
    17. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    18. Regrese el tubo a la gradilla magnética durante otros 5 minutos.
    19. Transfiera con cuidado el ADN eluido (sobrenadante) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
    20. Mida la concentración de ADN utilizando el reactivo de cuantificación dsDNA basado en fluorescencia de alta sensibilidad.
      NOTA: El ADN se puede almacenar en un congelador a -20 °C o proceder con PCR.
  3. Amplificación (PCR)
    1. PCR multiplex y limpieza posterior a la PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante25.
    2. Mida la concentración de ADN utilizando el reactivo de cuantificación dsDNA basado en fluorescencia de alta sensibilidad.
  4. Electroforesis
    1. Prepare un gel de agarosa al 2% disolviendo el polvo de agarosa en 1x tampón TAE a través del calentamiento por microondas hasta que se derrita por completo.
    2. Agregue 5 μL de tinción de gel de ADN fluorescente no tóxico a la agarosa derretida y mezcle bien.
    3. Vierta la mezcla de gel en una bandeja de fundición de gel equipada con un peine para formar pocillos.
    4. Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente.
    5. Una vez solidificado, retire el peine y coloque la bandeja de gel en el tanque de electroforesis lleno de 1x tampón TAE.
    6. Cargue 5 μL de una escalera de ADN kb mezclada con 5 μL de tampón de carga en el primer pocillo.
    7. Para cada producto de PCR, mezcle 5 μL del producto con 5 μL de tampón de carga y cargue en pocillos individuales.
    8. Deje correr el gel a 100 V durante 1 h.
    9. Visualice las bandas de ADN utilizando el sistema de documentación de gel con transiluminación.

2. Preparación de la biblioteca ONT

  1. Preparación final
    1. Calcule 100 ng de cada muestra de amplicón en función de la concentración y transfiera el volumen requerido a un tubo de PCR limpio.
    2. Para calcular la masa total (en ng) de amplicones en una muestra dada, multiplique la concentración de la muestra (ng/μL) por su volumen restante (μL) después del control de calidad (QC).
      NOTA: Por ejemplo, si una muestra tiene una concentración de 2 ng/μL y un volumen restante de 1 μL después del control de calidad, la masa total del amplicón es:
      Masa total = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      Para preparar 10 ng de amplicones para la secuenciación, use la fórmula de dilución:
      C1V1 = C2V2
      Donde: C1 = 45 ng, V1 = desconocido, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      Por lo tanto, se deben usar μL de la muestra inicial de amplicón para obtener 10 ng de ADN para la secuenciación.
    3. Ajuste el volumen total de cada muestra a 12,5 μl utilizando NFW.
    4. Mezcle las muestras suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces y gire brevemente.
    5. Agregue 1,75 μL de tampón de reacción de reparación final y cola A y 0,75 μL de mezcla de enzimas de reparación final y cola A a cada muestra.
    6. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces y gire brevemente hacia abajo.
    7. Incubar los tubos en un termociclador a 25 °C durante 30 min, seguido de 65 °C durante 30 min.
      NOTA: En esta etapa, si el usuario decide interrumpir el proceso, es aconsejable utilizar perlas para la purificación del ADN preparado para el final. El ADN purificado se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de siete días.
  2. Ligadura de código de barras nativa
    1. Descongele y prepare las perlas magnéticas para la purificación del ADN y la selección del tamaño, las perlas de limpieza de ADN paramagnéticas, EDTA y códigos de barras nativos (NB01-96) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y luego colóquelas en hielo.
    2. En los nuevos tubos de PCR, agregue lo siguiente en secuencia: 2,75 μl de agua libre de nucleasas, 1 μl de ADN preparado en los extremos, 1,25 μl de códigos de barras nativos (NB01-96) y 5 μl de mezcla de enzimas de ligadura de ADN.
    3. Mezcle cada reacción pipeteando suavemente 10 veces, centrifugue brevemente con una microcentrífuga e incube durante 20 min a temperatura ambiente.
    4. Agregue 1 μL de EDTA a cada pocillo, mezcle bien pipeteando y centrifugue brevemente.
    5. Muestras con código de barras en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    6. Vuelva a suspender las perlas de limpieza de ADN mediante vórtice y agregue 0,7 veces el volumen total de la muestra agrupada (por ejemplo, para 23 muestras con un volumen total de 253 μL, agregue 177,1 μL de perlas).
    7. Mezclar la solución pipeteando e incubar en un HulaMixer durante 10 min a temperatura ambiente.
    8. Prepare 2 ml de etanol al 80% mezclando 1600 μL de etanol puro con 400 μL de NFW.
    9. Coloque el tubo en una gradilla magnética durante 5 minutos hasta que el eluido sea transparente e incoloro.
    10. Retire y deseche el sobrenadante sin alterar el gránulo.
    11. Lave las perlas con 700 μL de etanol al 80% recién preparado sin alterar el gránulo, luego retire y deseche el etanol.
    12. Repita el paso de lavado con etanol.
    13. Centrifugar el tubo brevemente, volver a la rejilla magnética y eliminar el etanol residual.
    14. Deje que las perlas se sequen al aire durante 30 s.
    15. Retire el tubo de la gradilla magnética, vuelva a suspender las perlas en 35 μl de agua libre de nucleasas con un movimiento suave e incube a 37 °C durante 10 min.
    16. Vuelva a colocar el tubo en la gradilla magnética hasta que el eluido sea transparente e incoloro.
    17. Transfiera 35 μl del eluido a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml para los pasos posteriores.
      NOTA: La biblioteca se puede almacenar a 4 °C durante la noche en esta etapa.
  3. Ligadura y limpieza del adaptador
    1. Prepare el kit de reactivos de ligadura rápida de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y colóquelo en hielo.
    2. Mezcle el adaptador nativo (NA) y la ligasa rápida pipeteando y luego colóquelo en hielo.
    3. Descongele el tampón de elución (EB) a temperatura ambiente, vórtice, centrifugue y colóquelo en hielo.
    4. Descongele el tampón de fragmentos cortos (SFB) a temperatura ambiente, vórtice, centrífuga y colóquelo en hielo.
    5. En un tubo de microcentrífuga de baja unión de 1,5 ml, mezcle lo siguiente: 30 μl de muestra con código de barras agrupada, 5 μl de adaptador nativo (NA), 10 μl de tampón de reacción de ligadura rápida y 5 μl de ADN ligasa T4 de acción rápida.
    6. Pipetear suavemente para mezclar, centrifugar brevemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
    7. Vuelva a suspender las perlas de limpieza de ADN mediante vórtice y agregue 20 μL (0,4x) de perlas a la reacción.
    8. Mezclar suavemente pipeteando e incubar en un HulaMixer durante 10 min a temperatura ambiente.
    9. Granular las perlas en una rejilla magnética y aspirar el sobrenadante sin alterar el sedimento.
    10. Lave las perlas agregando 125 μL de tampón de fragmentos cortos (SFB), vuelva a suspender con un movimiento, centrifugue brevemente y regrese al bastidor magnético.
    11. Granular las perlas y aspirar el sobrenadante; Repita el paso de lavado una vez.
    12. Centrifugar brevemente, devolver el tubo a la rejilla magnética y aspirar cualquier sobrenadante residual.
    13. Retire el tubo de la gradilla magnética y vuelva a suspender las perlas en 15 μl de tampón de elución (EB).
    14. Centrifugar brevemente e incubar a 37 °C durante 10 min para eluir el ADN.
    15. Coloque el tubo en la rejilla magnética, peletice las perlas hasta que el eluido sea transparente e incoloro, y aspire 15 μL del eluido en un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml.
    16. Cuantificar 1 μL del eluido.
    17. Diluya la biblioteca a 20 fmol (calcule usando la calculadora NEB) y use 12 μL de la biblioteca preparada de 20 fmol para la secuenciación en la celda de flujo R10.4.1.
      NOTA: La biblioteca ahora se puede almacenar a -20 °C, lo que permite un uso repetido.
  4. Cebado y carga de la celda de flujo de secuenciación de nanoporos
    1. Descongele el tampón de secuenciación (SB), las perlas de biblioteca (LIB), la atadura de celda de flujo (FCT) y el lavado de celda de flujo (FCF) a RT, mézclelos por vórtice y gírelos hacia abajo.
    2. Prepare la mezcla de cebado de celda de flujo combinando 5 μl de albúmina de suero bovino (BSA, 50 mg/ml), 30 μl de atadura de celda de flujo (FCT) y 1170 μl de lavado de celda de flujo (FCF), mezclando la solución por inversión y pipeteo.
    3. Abra el puerto de cebado de la celda de flujo, aspire ~ 20 μL de tampón para eliminar las burbujas de aire, cargue 800 μL de la mezcla de cebado en el puerto de cebado sin introducir burbujas de aire y espere 5 min.
    4. Prepare la biblioteca mezclando 37,5 μl de tampón de secuenciación (SB), 25,5 μl de perlas de biblioteca (LIB) o solución de biblioteca (LIS) y 12 μl de la biblioteca de ADN de 20 fmol en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezclando bien mediante pipeteo.
    5. Vuelva a cebar la celda de flujo levantando suavemente la tapa del puerto de muestra de la celda de flujo, cargando 200 μL de la mezcla de cebado en el puerto de cebado sin introducir burbujas de aire y preparando la biblioteca para la carga.
    6. Mezcle suavemente la biblioteca preparada pipeteando y cargue 75 μl de la biblioteca en el puerto de muestra de la celda de flujo de secuenciación gota a gota, asegurándose de que cada gota fluya hacia el puerto antes de agregar la siguiente.
    7. Cierre la tapa del puerto de muestra de la celda de flujo, asegurándose de que el tapón ingrese al puerto de muestra de la celda de flujo, luego cierre el puerto de cebado.
    8. Conecte el dispositivo de secuenciación portátil a una computadora (con una fuente de alimentación ininterrumpida) e inicie la secuenciación utilizando un software de control y análisis del dispositivo de secuenciación.
  5. Parámetros de software
    NOTA: Esta aplicación de software, desarrollada por ONT, se utiliza para la gestión integral de las ejecuciones de secuenciación y la generación de informes detallados.
    1. Para iniciar el proceso de secuenciación, seleccione la opción Iniciar seguido de Iniciar secuenciación.
      NOTA: A continuación, se le pedirá que designe una carpeta para el almacenamiento de archivos y proporcione un nombre para su ejecución de secuenciación, por ejemplo, "sequencing_run_1". A continuación, haga clic en Continuar con la configuración para seleccionar el nombre del kit adecuado, como library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, y personalice el tiempo de ejecución deseado, por ejemplo, 20 h (el tiempo máximo de ejecución es de 72 h).
    2. A continuación, elija el tipo de archivo de salida, seleccionando entre opciones como POD5 para lecturas de salida sin procesar y FASTQ para salidas denominadas a base. Posteriormente, seleccione el modelo FAST-Basecalling.
    3. Tenga en cuenta que algunas de las configuraciones predeterminadas incluyen un escaneo frecuente de poros cada 1,5 h, una longitud de lectura mínima de 200 pb y una puntuación de calidad mínima de 8. Por último, revise la configuración y comience el proceso de lectura.

3. Análisis posterior a la secuenciación

  1. Requisitos del sistema
    NOTA: Guía para configurar el entorno y analizar los datos de secuenciación del amplicón de Mycobacterium tuberculosis mediante la canalización ONT-TB-NF. Las instrucciones se adaptan tanto a los usuarios de Windows (a través de WSL) como a macOS.
    1. Utilice lo siguiente: Sistema operativo: Windows 10/11 (con WSL2) o macOS; Memoria: Mínimo 8 GB de RAM (se recomiendan 16 GB); Almacenamiento: Al menos 50 GB de espacio libre en disco; Internet: Necesario para descargar paquetes y datos; Permisos: Capacidad para instalar software y administrar entornos.
  2. Asegúrese de la siguiente configuración del entorno: Usuarios de Windows (mediante WSL2). Habilite WSL2.
    1. Abra PowerShell como administrador y ejecute: wsl - install.
    2. Reinicie el equipo cuando se le solicite.
  3. Instalar Ubuntu
    1. Después de reiniciar, inicie Microsoft Store, busque Ubuntu e instale la versión preferida (por ejemplo, Ubuntu 22.04 LTS).
    2. Inicie Ubuntu desde el menú Inicio .
    3. Cree un nuevo nombre de usuario y contraseña de UNIX cuando se le solicite.
    4. Listas de paquetes de actualización: sudo apt update && sudo apt upgrade -y.
  4. Usuarios de macOS
    1. Instale Homebrew (si aún no está instalado): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. Instale los paquetes necesarios: brew install git wget
  5. Instalación de Conda o Mamba
    1. Visite la página de descarga de Miniconda para descargar el instalador correcto para el sistema operativo.
    2. Para instalar Miniconda, ejecute el instalador y siga las instrucciones en pantalla. Una vez completada la instalación, reinicie el terminal.
    3. Configurar canales de Conda:
      conda config --add canales predeterminados
      conda config --add channels bioconda
      conda config --add channels conda-forge
    4. Instalación de Mambaforge (Mamba)
      Para Linux:
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      Para macOS:
      wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Instalar Mambaforge: bash Mambaforge-*.sh
    6. Siga las instrucciones para completar la instalación y reinicie su terminal para activar Mamba.
  6. Configuración de la canalización ONT-TB-NF
    1. Crear un nuevo entorno Conda: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. Alternativamente, use Mamba: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. Activar el entorno: conda activate ont_tb_env
    4. Instalar Nextflow: curl -s https://get.nextflow.io | bash, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. Clonar el repositorio ONT-TB-NF: GIT CLONE https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. Extraer las imágenes de Docker necesarias (si se utiliza Docker)
      Docker Pull HKUBAL/CLAIR3: V0.1-R12
      Docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. Ejecución de la canalización
    1. Concatene los archivos FASTQ de Basecalled de cada muestra de forma independiente mediante el siguiente comando.
      gato *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      nextflow ejecutar run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /ruta/a/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /ruta/a/amplicon_regions.bed \
      hilos 16 \
      output_dir /absolute/path/to/output_directory
  8. Archivos de salida e interpretación
    1. Tras la ejecución correcta, asegúrese de que la canalización genere las siguientes salidas en el directorio de salida especificado:
      1. Lecturas alineadas: archivos *.bam.
      2. Llamadas variantes: *.vcf archivos que contienen SNP e indels.
      3. Informes resumidos: archivos *.csv o *.tsv que resumen las mutaciones de resistencia a los medicamentos y otras métricas relevantes.
      4. Informes de control de calidad: archivos *.htmL generados por herramientas como MultiQC.
      5. Registros: registros detallados de la ejecución de la canalización.
      6. Archivos intermedios: Almacenados en el directorio work/ (se pueden eliminar después de una ejecución exitosa).
        NOTA: En caso de encontrar errores de permisos, es esencial verificar que se posean los permisos necesarios para leer y escribir archivos, así como para ejecutar scripts. Con respecto a los problemas ambientales, asegúrese de que se active el entorno Conda apropiado antes de ejecutar el gasoducto. Para aquellos que utilizan perfiles de Docker, es imperativo confirmar que Docker está instalado y operativo. Además, se deben monitorear meticulosamente los recursos del sistema para evitar cualquier limitación de memoria o almacenamiento durante la ejecución. En la Figura 1 se presenta una descripción general de estas metodologías.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método de extracción de ADN seleccionado se eligió por su eficiencia y rendimiento superior en comparación con otras técnicas rápidas. Produjo constantemente ADN genómico (ADNg) de alta calidad, y la integración de un paso de limpieza basado en perlas ayudó a minimizar el tiempo de procesamiento y redujo los costos por muestra. Esto se logró eliminando la necesidad de evaluaciones de control de calidad adicionales, como mediciones espectrofotométricas, con fluorometría como única herr...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La plataforma de secuenciación de lectura larga demostró ventajas notables en este estudio, en particular su capacidad para lograr una secuenciación rápida con una amplitud de cobertura consistentemente alta. En todos los aislados secuenciados con éxito, se logró una amplitud de cobertura del 99,9%, lo que indica una representación casi completa de las regiones genómicas asociadas a la resistencia. La profundidad de cobertura promedio en todos los genes objetivo fue de 4462X, con el gen ...

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Agradecimientos

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Nos gustaría expresar nuestra sincera gratitud al Centro SAMRC para la Tuberculosis de la Universidad de Stellenbosch por proporcionar los recursos e instalaciones esenciales. También estamos profundamente agradecidos con el estudio TS ELiOT por suministrar las muestras que fueron parte integral de este estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
15 mL y Tubos de unión Lo de 1,5 mL o 2 mLEppendorfEP0030108051-250EA
Escalera de 1kbThermo Fisher ScientificSM0311
Tubos de tapa de rosca de 2 mLEspecialidades Científicas IncP2TUB056C-0001.5ST
Cuentas de vidrio estériles de 2 mmSigma-AldrichZ273627-1EA
Cuenta de XP AMPureBeckman ColterA63881
Deeplex Myc-TB GenoScreen20090205
Cámara de electroforesisThermo Fisher ScientificA25977
Alcohol etílico, puroSigma-AldrichE7023-500ML
Homogeneizador FastPrepMP Biomedicina116005500
Puntas de pipeta de filtro (10 y micro; L) Bio-Smart ScientificFT-10-R
Puntas de pipeta de filtro (1000 y micro; L) Bio-Smart ScientificFT-1000-R
Puntas de pipeta de filtro (20 y micro; L) Bio-Smart ScientificFT-20-R
Puntas de pipeta de filtro (200 y micro; L) Bio-Smart ScientificFT-200-R
Flow-cell Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114
Bloque calefactorEppendorf5382000031
Matriz InstaGeneBio-RadBBRD7326030
Estante magnético yThermo Fisher Scientific y nbsp;12321D
MicrocentrífugaEppendorf y Eppendorf;5406000046
SúbditoOxford Nanopore TechnologiesMK1B
Kit de código de barras nativo V14 Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367
Módulo de Ligadura Rápida NEBNextNEBE6056
NEBNext Ultra II Módulo de reparación de extremos/dA-retaladoNEBE7546
Agua libre de nucleasas (NFW)Thermo Fisher ScientificAM9937
Pipetas (P10, P20, P200 y P1000)EppendorfEP3123000918-1EA
Tubos de ensayo de qubitsThermo Fisher ScientificP32856
Kit de ensayo Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificP33231
Fluorómetro de qubitsThermo Fisher ScientificP33226
Cepa de gel de ADN segura SYBRThermo Fisher ScientificS33102
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific17852
Transiluminador Universal Hood III (Sistema Molecular Imager Gel Doc XR)Bio-Rad170-8170
Mezclador de vórticeLasecWMBB0L0E0216

Referencias

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