Secuenciación de amplicones utilizando las tecnologías de secuenciación de lectura larga

Morwasehla Modjadji; Brendon Coenrad Mann; Johannes Loubser; Jennifer Williams; Janré Steyn; Elizabeth Maria Streicher; Melanie Grobbelaar; Robin Mark Warren

doi:10.3791/68370

Artículo de método

Secuenciación de amplicones utilizando las tecnologías de secuenciación de lectura larga

DOI:

10.3791/68370

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29 de agosto de 2025

Morwasehla Modjadji¹ , Brendon Coenrad Mann¹ , Johannes Loubser¹ , Jennifer Williams¹ , Janré Steyn¹ , Elizabeth Maria Streicher¹ , Melanie Grobbelaar¹ , Robin Mark Warren¹

¹Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo se optimizó para la secuenciación profunda dirigida de 18 regiones de resistencia a los medicamentos en Mycobacterium tuberculosis utilizando una plataforma de secuenciación de lectura larga, seguida de un análisis con una línea de bioinformática específica para la tuberculosis diseñada para datos de lectura larga.

Resumen

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La Organización Mundial de la Salud (OMS) sigue haciendo hincapié en la necesidad urgente de contar con un método de diagnóstico rápido, rentable y fácil de utilizar para la tuberculosis (TB) y la tuberculosis resistente a los medicamentos (TB-DR). Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), respaldadas por la OMS, han mejorado significativamente la detección de la TB-DR. Entre estos, la NGS dirigida (tNGS) permite la detección enfocada de mutaciones genéticas asociadas con la resistencia a los medicamentos, eliminando la necesidad de diagnósticos tradicionales basados en cultivos. Un ensayo tNGS ampliamente utilizado proporciona pruebas rápidas y completas de susceptibilidad a los medicamentos, pero se ha optimizado principalmente para plataformas de secuenciación con alta precisión. Sin embargo, el alto costo de estos sistemas de secuenciación ha limitado la accesibilidad en los países de ingresos bajos y medianos, particularmente en África. Las tecnologías de secuenciación portátiles presentan una alternativa prometedora, ya que ofrecen flexibilidad y requisitos de infraestructura reducidos. En este estudio, se extrajo ADN de aislados de tuberculosis resistente a la rifampicina (TB-RR), se amplificó mediante un ensayo de tNGS y se secuenció en una plataforma de secuenciación portátil. Los mismos productos de amplificación también se secuenciaron en una plataforma de secuenciación de lectura corta de alta precisión para servir como referencia. Los datos del secuenciador portátil se procesaron utilizando una tubería bioinformática diseñada para la secuenciación de lectura larga, mientras que los datos de secuenciación de lectura corta se analizaron utilizando una aplicación web establecida. El análisis mostró que el enfoque de secuenciación de lectura larga identificó con éxito las variantes asociadas a la resistencia de alta frecuencia detectadas por la secuenciación de lectura corta, pero exhibió limitaciones en la detección de variantes de baja frecuencia.

Introducción

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La tuberculosis (TB) sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo y presenta un desafío continuo para la salud pública, especialmente en los países de ingresos bajos y medianos ^1,2. A pesar de las iniciativas destinadas a mejorar las medidas de control de la TB, los avances han sido lentos, en parte debido a las dificultades para lograr técnicas de diagnóstico rápidas, precisas, rentables e integrales ^3,4,5. Si bien los métodos de diagnóstico molecular com....

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Protocolo

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Esta investigación se llevó a cabo como parte del proyecto TS ELiOT, que recibió la aprobación ética del Comité de Ética de Investigación en Humanos (HREC) de la Universidad de Stellenbosch (N21/09/093) el 20 de octubre de 2021. Además, obtuvo la autorización de Western Cape Health Research para el uso de instalaciones gubernamentales. Las muestras se recolectaron a través de un esfuerzo de colaboración con NHLS Green Point y la Universidad de Stellenbosch, bajo el número de aprobación SU HREC N09/11/296. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Pr....

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Resultados

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El método de extracción de ADN seleccionado se eligió por su eficiencia y rendimiento superior en comparación con otras técnicas rápidas. Produjo constantemente ADN genómico (ADNg) de alta calidad, y la integración de un paso de limpieza basado en perlas ayudó a minimizar el tiempo de procesamiento y redujo los costos por muestra. Esto se logró eliminando la necesidad de evaluaciones de control de calidad adicionales, como mediciones espectrofotométricas, con fluorometría como única herr.......

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Discusión

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La plataforma de secuenciación de lectura larga demostró ventajas notables en este estudio, en particular su capacidad para lograr una secuenciación rápida con una amplitud de cobertura consistentemente alta. En todos los aislados secuenciados con éxito, se logró una amplitud de cobertura del 99,9%, lo que indica una representación casi completa de las regiones genómicas asociadas a la resistencia. La profundidad de cobertura promedio en todos los genes objetivo fue de 4462X, con el gen .......

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Agradecimientos

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Nos gustaría expresar nuestra sincera gratitud al Centro SAMRC para la Tuberculosis de la Universidad de Stellenbosch por proporcionar los recursos e instalaciones esenciales. También estamos profundamente agradecidos con el estudio TS ELiOT por suministrar las muestras que fueron parte integral de este estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo
15 mL y Tubos de unión Lo de 1,5 mL o 2 mL	Eppendorf	EP0030108051-250EA
Escalera de 1kb	Thermo Fisher Scientific	SM0311
Tubos de tapa de rosca de 2 mL	Especialidades Científicas Inc	P2TUB056C-0001.5ST
Cuentas de vidrio estériles de 2 mm	Sigma-Aldrich	Z273627-1EA
Cuenta de XP AMPure	Beckman Colter	A63881
Deeplex Myc-TB	GenoScreen	20090205
Cámara de electroforesis	Thermo Fisher Scientific	A25977
Alcohol etílico, puro	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Homogeneizador FastPrep	MP Biomedicina	116005500
Puntas de pipeta de filtro (10 y micro; L)	Bio-Smart Scientific	FT-10-R
Puntas de pipeta de filtro (1000 y micro; L)	Bio-Smart Scientific	FT-1000-R
Puntas de pipeta de filtro (20 y micro; L)	Bio-Smart Scientific	FT-20-R
Puntas de pipeta de filtro (200 y micro; L)	Bio-Smart Scientific	FT-200-R
Flow-cell	Oxford Nanopore Technologies	FLO-MIN114
Bloque calefactor	Eppendorf	5382000031
Matriz InstaGene	Bio-Rad	BBRD7326030
Estante magnético y	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	12321D
Microcentrífuga	Eppendorf y Eppendorf;	5406000046
Súbdito	Oxford Nanopore Technologies	MK1B
Kit de código de barras nativo V14	Oxford Nanopore Technologies	SQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix	NEB	M0367
Módulo de Ligadura Rápida NEBNext	NEB	E6056
NEBNext Ultra II Módulo de reparación de extremos/dA-retalado	NEB	E7546
Agua libre de nucleasas (NFW)	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Pipetas (P10, P20, P200 y P1000)	Eppendorf	EP3123000918-1EA
Tubos de ensayo de qubits	Thermo Fisher Scientific	P32856
Kit de ensayo Qubit dsDNA HS	Thermo Fisher Scientific	P33231
Fluorómetro de qubits	Thermo Fisher Scientific	P33226
Cepa de gel de ADN segura SYBR	Thermo Fisher Scientific	S33102
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	17852
Transiluminador Universal Hood III (Sistema Molecular Imager Gel Doc XR)	Bio-Rad	170-8170
Mezclador de vórtice	Lasec	WMBB0L0E0216

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tuberculosis report. Baltimore Health News. , WHO. (2022).
WHO Malaria Department report. Report 20-23. , WHO. (2023).
The End Strategy TB. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).
Cabibbe, A. M., et al.

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Long Read Sequencing Amplicon Sequencing Drug Resistant Tuberculosis Targeted NGS Portable Sequencing DNA Library Preparation Resistance Variant Detection Flow Cell Priming Gel Electrophoresis Bioinformatics Pipeline

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