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Artículo de método

Muestreo ambiental de microbios fotosintéticos y sus virus: del campo al laboratorio

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DOI:

10.3791/68379

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3 de julio de 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos métodos de muestreo de las zonas eufóticas de los ecosistemas marinos y de agua dulce para aislar cianofagos (y sus huéspedes) y procesos posteriores al muestreo que enriquecen genotipos individuales y caracterizan la dinámica de interacción virus-huésped.

Resumen

El muestreo ambiental de microorganismos fotosintéticos y sus virus desempeña un papel fundamental en la comprensión de la biodiversidad marina y de agua dulce contemporánea y la dinámica de los ecosistemas, así como en los impactos de los factores relacionados con el cambio climático (por ejemplo, el aumento de las temperaturas y la acidificación) en las trayectorias evolutivas de las especies y la composición de las comunidades. Desafortunadamente, la diversidad de la virosfera no admite un único flujo de trabajo experimental y de muestreo universal. De hecho, cada sistema de virus tiene características únicas, que requieren modificaciones en los protocolos estándar de virología para lograr los objetivos de la investigación. Aunque el descubrimiento y la caracterización de virus requieren enfoques específicos para el sistema objetivo, para todos los virus, los objetivos de la investigación son similares: aislar el virus; determinar el rango de hosts; confirmar la infección productiva; y caracterizar el virus, el huésped y la dinámica virus-huésped. Las descripciones sólidas de los sistemas virus-huésped consisten mínimamente en dilucidar los perfiles de morfología, fisiología, bioquímica y ómicas. Se puede obtener más información manipulando el sistema cambiando factores como la multiplicidad de infección, la temperatura, el pH, el cambio de huésped, la evolución dirigida o aplicando fármacos para observar la respuesta del sistema virus-huésped. Nuestro laboratorio estudia virus en todos los dominios de la vida (arqueas, bacterias y eucariotas). En este informe, detallamos métodos para muestrear microbios fotosintéticos de la zona eufótica de ambientes marinos y de agua dulce, centrándonos en el aislamiento de bacteriófagos (es decir, cianófagos) de cianobacterias. Las cianobacterias son especies clave para la producción primaria y el ciclo de nutrientes en estos ecosistemas acuáticos. El flujo de trabajo descrito se extiende desde el muestreo de aguas a diferentes profundidades hasta la caracterización de las características del sistema virus-huésped mediante el cultivo de medios líquidos y sólidos, métodos moleculares/genéticos avanzados y enfoques analíticos. Los métodos descritos son adaptables al descubrimiento de bacteriófagos y virus en sistemas virus-huésped en todos los dominios de la vida.

Introducción

Caracterizar la dinámica de infección y las relaciones evolutivas de los cianofagos y sus huéspedes es clave para comprender los estados actuales y futuros de los ecosistemas marinos y de agua dulce. Las técnicas avanzadas de secuenciación de alto rendimiento y los métodos analíticos modernos permiten la secuenciación rápida de los genomas de los cianófagos (y del huésped) para estudiar las relaciones virus-huésped 1,2. Sin embargo, los flujos de trabajo comienzan con el muestreo ambiental para aislar e identificar los virus y sus huéspedes 3,4,5. Debido a la diversidad de la virosfera, no existe un protocolo único para tomar muestras y caracterizar todos los virus y bacteriófagos. De hecho, cada sistema huésped de virus tiene sus características únicas. No obstante, los objetivos básicos son similares independientemente del sistema viral que se esté explorando: aislar el virus; determinar el rango de hosts; demostrar infección productiva en uno o más hospederos; Caracterizar la dinámica de infección por virus, huésped y virus-huésped utilizando enfoques cualitativos y cuantitativos. Una comprensión avanzada del sistema viral puede examinarse perturbando el sistema. El cambio de parámetros como la multiplicidad de infecciones (MOI)6, la temperatura, el pH, la cepa del huésped o la aplicación de fármacos para determinar cómo responde el sistema, proporciona información adicional sobre la naturaleza de la dinámica virus-huésped. La manipulación más avanzada, como la evolución dirigida, puede proporcionar información adicional sobre la posible trayectoria evolutiva del sistema y cómo los criterios de valoración coevolutivos pueden afectar a la comunidad microbiana y al ecosistema más amplios.

En este estudio, presentamos un modelo de protocolo (pero fácilmente adaptable) para el muestreo ambiental de microbios fotosintéticos como cianobacterias y microalgas, que desempeñan un papel crítico en el ciclo de nutrientes y la producción primaria en ecosistemas marinos, de agua dulce y otros ecosistemas acuáticos 7,8,9,10,11 . El flujo de trabajo se centra en aislar a los huéspedes de las zonas eufóticas de los entornos marinos y de agua dulce y sus virus y bacteriófagos, que son factores clave en estos ecosistemas12. Tanto los virus como los bacteriófagos afectan a las estructuras poblacionales eucariotas y procariotas e influyen en gran medida en la diversidad y la productividad de los ecosistemas13. Por lo tanto, el objetivo aquí es proporcionar un protocolo de muestreo y un flujo de trabajo posterior al muestreo que facilite el enriquecimiento de hosts y virus para investigar: dinámica de un solo virus/un solo host, multivirus/un solo host, un solo virus/multihost y multivirus/múltiples hosts; -sustratos ómicos que subyacen a la dinámica de infección virus-huésped; y las posibles trayectorias coevolutivas y los criterios de valoración evolutivos que afectan al sistema virus-huésped objeto de estudio y al ecosistema más amplio del que se extrajeron los virus y el huésped.

Específicamente, describimos un flujo de trabajo para el muestreo ambiental, el preprocesamiento de campo de muestras (es decir, antes de llegar al laboratorio), el posprocesamiento para el aislamiento de bacteriófagos (y virus), el enriquecimiento de cultivos de microorganismos de especies mixtas para identificar huéspedes permisivos, el desarrollo de aislados de una sola colonia de huéspedes putativos, confirmando una buena fe relación virus-huésped (es decir, infección productiva) y caracterización de las propiedades fundamentales de la infección (p. ej., virulencia). Los ensayos de infección no solo permiten calcular la virulencia relativa (VR)14 y la resiliencia del huésped (RR)15, sino que también incluyen pasos para extraer muestras de cultivo en puntos de tiempo clave para investigar los sustratos ómicos que subyacen a la fisiología observada (es decir, la dinámica de interacción virus-huésped). Por último, discutimos los posibles escollos, la solución de problemas y las soluciones, así como las formas de modificar los pasos seleccionados para apuntar a taxones específicos. El flujo de trabajo es aplicable a los sistemas cianófago-cianobacterias, ficodnavirus-microalgas y fuselovirus-arqueas termófilos16,17, lo que demuestra su utilidad en la caracterización de virus en los tres dominios de la vida: bacterias, eucariotas y arqueas.

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Protocolo

1. Muestreo ambiental

NOTA: Este protocolo describe el muestreo en alta mar de microbios fotosintéticos de la zona eufótica dentro de las 5 millas de la costa frente a la costa del sur de California. Sin embargo, el protocolo se ha adaptado para tomar muestras de lagos, lagos congelados o aguas termales geotérmicas (Figura 1).

  1. Muestreo ambiental en alta mar a lo largo de la costa del sur de California
    NOTA: Un buque de 6 m, en V profunda, con consola central (es decir, bote) con motores fuera de borda duales de 150 hp se cargó con equipo de investigación (Tabla de Materiales). Se seleccionaron tres sitios para el muestreo de zonas eufóticas: a) Sitio 1: N 30° 15.436, W 117° 31.551; b) Sitio 2: N 33° 12.521, W 117° 25.275; y c) Sitio 3: N 32° 59.914, W 117° 17.058. En cada sitio, se extrajeron 20 L de muestras de agua al mediodía de tres profundidades diferentes en cada sitio: < 3 m (muestra de superficie), 6 m y 14 m.
    1. Conjunto de bomba de transferencia: Al llegar a cada sitio de muestreo, despliegue el ancla del barco y registre las coordenadas GPS del sistema de navegación. Ensamble el sistema de muestreo.
      1. En resumen, coloque un extremo de la tubería de PVC azul flex-plus de 2,54 cm de diámetro interno (50 pies) en un filtro de succión de 2,54 cm para evitar que entren residuos grandes en el sistema de bombeo. Asegure la unión del tubo del filtro con cinta adhesiva. Coloque el extremo opuesto del tubo en el colector de admisión de la bomba de transferencia de acero inoxidable de 1 hp.
      2. Conecte una sección de 10 pies de manguera flexible de goma resistente al colapso de 2,54 cm de diámetro interno a la salida de la bomba. Conecte el cable eléctrico de la bomba de transferencia al generador inverter de gas de 3800 W. Una vez ensamblada, cebe la bomba de transferencia y pruébela para asegurarse de que el sistema de bombeo esté en funcionamiento (Figura 1, fila superior).
    2. Peso del tubo de transferencia: Asegure un extremo de una cuerda marina de nailon de 25 m de largo y 1,25 cm de diámetro al ojal de un ancla de hongo de 14 kg. Use cinta adhesiva para asegurar la cuerda al tubo de PVC azul cada 3 m con el filtro de succión colocado aproximadamente 1 m por encima del anclaje para evitar que el filtro se aloje en la arena o golpee las rocas bajo el agua. Utilice el ancla para sumergir el tubo de transferencia (tubo de PVC azul) y evitar que las fuertes corrientes subterráneas creen un gran ángulo entre el barco y el tubo, lo que daría profundidades de muestra inexactas. Baje el conjunto de ancla/cuerda y tubo a profundidad.
    3. Extracción de muestras de agua de mar: Una vez que la punta del tubo con el colador esté a la profundidad deseada, encienda el generador y la bomba. Vuelva a cebar la bomba o agite el tubo de transferencia para que el agua comience a bombear desde la profundidad. Una vez que se transfiere un flujo constante de agua desde la profundidad, descargue 1-2 volúmenes de tubo de regreso al océano para asegurarse de que el agua de la profundidad deseada fluya a través de la bomba. Recoja muestras de agua en jarras de agua de 20 L (Figura 1, fila superior, extremo derecho).
    4. Transporte de muestras a la estación de campo: Llene jarras de agua de 20 L hasta aproximadamente 18 L para permitir el intercambio de gases (por ejemplo, O2 / CO2) entre las muestras de agua y el espacio de cabeza durante el transporte. Antes de tapar las jarras de agua, registre la temperatura, el pH y la salinidad de las muestras de agua cruda. Luego, tape y coloque las jarras de agua en una cama de hielo en el almacenamiento de la subcubierta y cúbralas con una sábana ligera para evitar la sobreexposición a la luz solar y las altas temperaturas.
  2. Preprocesamiento de muestras de agua en el campo
    NOTA: A su llegada a una instalación en tierra (por ejemplo, habitación de hotel/sala de conferencias/estación de campo), se llevaron a cabo una serie de pasos de preprocesamiento para proteger el contenido microbiano dentro de las muestras de agua y para separar las diferentes fracciones de las muestras de agua de mar en función del tamaño de las partículas.
    1. Montaje del sistema de filtración: Asegure un extremo de una pieza de 1 m de largo de tubo de vinilo transparente de 9.525 mm de diámetro interno a la entrada de la lengüeta de la manguera en el puerto de vacío de una bomba de vacío de diafragma de aire portátil. Asegure el extremo opuesto de la misma manguera a un conjunto de ventosa de filtro de 1,0 L y 0,45 μm. Utilice conjuntos de copas de filtro de 0,45 μm y 0,22 μm en secuencia para separar diferentes fracciones de la muestra de agua de mar como se describe a continuación.
    2. Para comprobar si el sistema tiene fugas o filtros defectuosos/rotos, filtre 0,25 L de agua de mar a través de la copa de filtro de membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 μm. Un sistema sin fugas mostrará la succión entre el filtro y la rejilla una vez que la muestra de agua de mar se haya filtrado por completo.
    3. Filtración a través de un conjunto de copa de filtro de membrana de PES de 0,45 μm: Para aislar microorganismos fotosintéticos (por ejemplo, microalgas y cianobacterias), el objetivo es filtrar 2 L de muestra de agua de mar a través de la copa de filtro de membrana de PES de 0,45 μm utilizando dos copas de filtro de 1 L (o cuatro copas de filtro de 500 mL). Etiquete adecuadamente todas las botellas de filtrado con el tamaño del filtro, la profundidad de la que se tomó la muestra, la fecha y la designación del sitio de muestreo. Por último, tapón de rosca y cubra los frascos que contengan 0,45 μm de filtrado con un paño o funda semitransparente para evitar la luz solar excesiva.
      NOTA: No permita que el filtro en la copa del filtro se seque. Mantenga siempre una capa delgada de líquido en el filtro. El filtro acumulará residuos biológicos (por ejemplo, células). Si el filtro se obstruye con residuos, desenrosque con cuidado el conjunto de la copa y deje a un lado la copa del filtro usada, pero no deseche la copa obstruida. Coloque un nuevo filtro de 0,45 μm y continúe.
    4. Filtración a través de un conjunto de copa de filtro de membrana PES de 0,22 μm: Para aislar virus eucariotas grandes, utilice 1 L del filtrado de 0,45 μm del paso anterior (paso 1.2.3) y filtre a través de una copa de filtro de 0,22 μm. Etiquete adecuadamente la botella de ultrafiltrado con el tamaño del filtro, la profundidad de la que se tomó la muestra, la fecha y la designación del sitio de muestreo. Por último, tapón de rosca y tapa el frasco que contiene 0,22 μm de ultrafiltrado (procedente del filtrado de 0,45 μm).
      NOTA: No permita que el filtro en la copa del filtro se seque. Mantenga siempre una capa delgada de líquido en el filtro. El filtro acumulará desechos biológicos, que contienen muestras biológicas. Si el filtro se obstruye, desenrosque el conjunto de la copa y deje a un lado la copa del filtro usada. No deseche la taza obstruida. Coloque un nuevo filtro de 0,22 μm y continúe.
    5. Biomasa concentrada de un filtro de 0,45 μm: Vierta 48 mL de filtrado (de 0,22 μm de filtración) en cada uno de los dos tubos de centrífuga de polipropileno cónicos estériles de 50 mL. Utilice un bisturí estéril para cortar uniformemente a lo largo del borde más externo del filtro de 0,45 μm gastado dentro del conjunto de la copa. Utilice pinzas estériles para retirar el filtro húmedo y cargado de biomasa. Córtalo por la mitad. Enrolle la mitad del papel de filtro en un tubo cónico de 50 ml. Repita con la segunda mitad de la membrana del filtro y el segundo tubo. Enrosque las tapas de los tubos y asegúrelas con una película transparente. Etiqueta el tubo.
    6. Concentrado de biomasa de virus grandes a partir de un filtro de 0,22 μm: Vierta 14 mL de ultrafiltrado en cada uno de los dos tubos de centrífuga cónicos estériles de polipropileno de 15 mL. Utilice un bisturí estéril para cortar a lo largo del borde exterior del filtro de 0,22 μm usado dentro del conjunto de la copa. Utilice pinzas estériles para retirar el filtro húmedo y cargado de biomasa. Córtalo por la mitad. Enrolle e inserte la mitad del papel de filtro en uno de los tubos cónicos de 15 ml. Repita para la segunda mitad de la membrana del filtro y el segundo tubo cónico de 15 mL. Atornille las tapas de los tubos y asegúrelas con una película transparente (por ejemplo, Parafilm). Etiquete cada tubo con el tamaño del filtro (es decir, 0,22 μm), el sitio, la profundidad y la fecha.
    7. Conserve los 0,45 μm de filtrado restantes, así como los 0,22 μm de filtrado restantes para enviarlos de vuelta al laboratorio. Repita todo este proceso de filtración (pasos 1.2.2 a 1.2.6) para cada profundidad y sitio de muestreo.
      NOTA: El ultrafiltrado se utiliza en el laboratorio como base de medios (con minerales nativos y otros nutrientes).
      Microscopía de muestra cruda (opcional): Tome un tubo cónico de 50 ml con un filtro de 0,45 μm y agite suavemente. Utilice un gotero de plástico (o pipeta) para tomar 30-50 mL de agua de mar del tubo cónico de 50 mL y prepare un portaobjetos de microscopio de vidrio con la muestra y un cubreobjetos. Usando un microscopio de campo y una computadora, vea el contenido del portaobjetos del microscopio para detectar y registrar las características de los microorganismos observados (Figura 2D).

2. Procesamiento de muestras para concentrar virus/bacteriófagos y enriquecer huéspedes

NOTA: Este protocolo describe los primeros pasos de procesamiento necesarios una vez que las muestras llegan al laboratorio desde el sitio de campo. El transporte en avión frente a través de un vehículo por carretera puede requerir diferentes consideraciones. La viabilidad de la muestra ambiental disminuirá con cambios bruscos en la temperatura, el pH, la salinidad, la exposición o falta de exposición a la luz, la concentración de gas disuelto (por ejemplo, CO2 yO2) y el tiempo entre la extracción ambiental y el procesamiento en el laboratorio.

  1. Centrifugado, concentración y almacenamiento de virus y bacteriófagos
    NOTA: Una vez que las muestras llegan al laboratorio, el procesamiento dentro de las 8 horas posteriores a la llegada puede minimizar la pérdida de microbios viables debido al lapso de tiempo entre la extracción del sitio de la muestra y la llegada al laboratorio. Los pasos que se proporcionan a continuación proporcionarán alícuotas de suspensión concentrada de bacteriófagos (o virus) (es decir, existencias de trabajo) para su almacenamiento y uso a largo plazo.
    1. Ultrafiltrado concentrado: Para cada profundidad de muestreo por sitio, envíe los ~ 800 mL restantes de ultrafiltrado al laboratorio. Utilice un filtro centrífugo de espín 3K NMWL de 15 mL y centrifugue a 6000 x g durante 10-20 min para concentrar 50-100 mL de ultrafiltrado hasta 1,0-1,5 mL. Prepare las cuadrículas para la obtención de imágenes TEM como se describió anteriormente16 para evaluar si hay partículas similares a virus (VLP) en el ultrafiltrado concentrado resultante. Si se detectan VLP, divida el concentrado en alícuotas de 100 mL. Almacenar a 4 °C (o -20 °C para almacenamiento a largo plazo).
    2. Concentración de partículas del filtro de 0,22 μm: Utilice un bisturí estéril para raspar suavemente los residuos de los filtros de 0,22 μm y introducirlos en el ultrafiltrado dentro de los tubos de 50 ml en los que se transportaron los filtros. Utilice un conjunto de copa concentradora de espín NMWL de 10K para concentrar 50-200 mL de suspensión hasta un volumen de ~3 mL de retenido de muestra. Prepare las rejillas para la obtención de imágenes TEM como se describió anteriormente16 para determinar si hay VLP del filtrado de 0,45 μm que pueden haber sido capturadas en la superficie del filtro de 0,22 μm. Si se detectan VLP, divida el concentrado en alícuotas de 100 ml y almacene a 4 °C (o -20 °C para almacenamiento a largo plazo).
  2. Retenido concentrador y enriquecedor de espín a partir de filtros de 0,45 μm.
    NOTA: Los cultivos mixtos de microorganismos pueden contener huéspedes para los virus y bacteriófagos aislados anteriormente (pasos 2.1.1 y 2.1.2). La concentración de espín y el enriquecimiento de los cultivos mixtos proporcionan existencias de trabajo a partir de las cuales se desarrollan cultivos puros de huéspedes putativos (véase el paso 3).
    1. Concentración de suspensiones mixtas: Para cada profundidad de muestreo por sitio, envíe ~100 mL de ultrafiltrado con un filtro de 0,45 μm cargado de residuos celulares al laboratorio. Utilice un bisturí estéril para raspar los residuos del filtro de 0,45 μm y los introduzca en el ultrafiltrado de los tubos de 50 ml en los que se transportaron. Centrifugar la muestra a 2000 x g durante 10 min, 4 °C para granular la biomasa. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de BG-11 medio 1:8 diluido1:8 8 mediante una trituración suave con una pipeta.
    2. Retenido enriquecedor a partir de un filtro de 0,45 μm: Prepare seis cultivos paralelos en matraces Erlenmeyer deflectores de 250 mL que contengan: 50 mL de medio BG-11 (3 matraces) y una mezcla de ultrafiltrado del sitio de la muestra (40 mL) más BG-11 (10 mL). Inocular cada matraz con 0,5 mL de concentrado celular (a partir del paso 2.2.1). Incubar con agitación leve en un fotobiorreactor durante un mínimo de 7-10 días a 25 °C con una intensidad de luz establecida en 20-40 mmol de fotones/m2/s.19 Una vez que el crecimiento sea robusto (por ejemplo, OD730nm = 0,8), centrifugar a 2000 x g, 10 min, 4 °C a pellet. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio BG-11 diluido 1:8 mediante una trituración suave con una pipeta. Prepare 10-20 alícuotas de 0,5 mL de suspensión celular en criotubos con tapón de rosca para almacenamiento a -80 °C.

3. Desarrollo de cultivos puros de un solo genotipo de huéspedes microbianos

NOTA: Este protocolo describe los procedimientos para aislar y purificar huéspedes microbianos putativos para virus y bacteriófagos de cultivos mixtos procesados a partir de muestras ambientales recolectadas. Se pueden aislar y purificar múltiples fenotipos de huéspedes, lo que aumenta la probabilidad de detectar huéspedes permisivos para los virus y bacteriófagos presentes en las muestras de agua almacenadas (pasos 2.1.1-2.1.2).

  1. Placas de rayado y selección de aislados de una sola colonia
    NOTA: Se desarrollan múltiples cultivos puros de un solo genotipo a partir de cultivos mixtos para aumentar la probabilidad de aislar un huésped susceptible y permisivo de virus o bacteriófagos capturados durante el muestreo ambiental y para investigar la gama de huéspedes de virus y bacteriófagos.
    1. Desarrolle aislados de una sola colonia (SCI) como se describe a continuación.
      1. Prepare placas de agar BG-1120. Descongelar en hielo, una alícuota de la suspensión mezclada que se almacenó a -80 °C (a partir del paso 2.2.2). Utilice un bucle estéril para esculpir los concentrados de células en las placas de agar BG-11 utilizando técnicas estándar20. Incubar placas rayadas en un fotobiorreactor durante ~10 días a 25 °C con una intensidad de luz de 20-40 mmol fotón/m2/s o hasta que aparezcan colonias en las placas.
      2. Prepare ~10 cultivos de semillas en tubos de cultivo de 20 mL con 5 mL de medio BG-11 y/o 5 mL de una mezcla de ultrafiltrado del sitio de muestra y BG-11. Tome una lesión medular de la placa con un palillo de dientes estéril e inocule cada tubo individualmente dejando caer un palillo de dientes en cada tubo. Incubar con agitación leve en un fotobiorreactor durante un mínimo de 10-15 días a 25 °C con una intensidad de luz establecida en 20-40 mmol de fotón/m2/s o hasta que se detecte el crecimiento (por ejemplo, OD730nm = 0,4-0,8).
        NOTA: Si hay varios fenotipos de colonias (por ejemplo, morfología, transparencia, color) en la primera placa de rayas, seleccione colonias individuales para la inoculación de una variedad de fenotipos de colonias.
    2. Desarrollo de cultivos puros de existencias de trabajo: Una vez que se detecta un crecimiento positivo del cultivo de semillas, se repiten los procedimientos de rayas hasta que aparezca un solo fenotipo de colonia en las placas (Figura 3B y Figura 4B). Aumente los cultivos de semillas a 50 mL de cultivos en matraces deflectores de 250 mL (Figuras 3C y 4C) como se describe anteriormente (paso 2.2.2). Prepare ~20 alícuotas de 0,5 mL de suspensión de células SCI y pipetee en criotubos de rosca de 1,0 mL para almacenamiento a -80 °C.
      NOTA: Para desarrollar cultivos puros de cianobacterias, pueden ser necesarios antibióticos o antifúngicos (por ejemplo, imipenem, cicloheximida) para reducir la contaminación del cultivo21. El procedimiento de siembra es un punto de inflexión en el que se puede dirigir el aislamiento de cianobacterias o microalgas. Los parámetros de luz durante la incubación pueden variar en términos de intensidad de luz o ciclos de encendido y apagado.
  2. Caracterización de un solo genotipo y almacenamiento de existencias de trabajo
    NOTA: Para confirmar el aislamiento y enriquecimiento de los genotipos individuales de huéspedes putativos, se caracterizan morfológica y genéticamente los cultivos puros.
    1. Caracterización morfológica: Una vez que los ciclos de cultivo líquido y trabajo en placa de medios sólidos dan como resultado un fenotipo de una sola célula, caracterice los morfotipos microbianos mediante microscopía óptica (Figura 2A-C) y, si está disponible, microscopía electrónica de transmisión (TEM) y/o microscopía electrónica de barrido (SEM; Figura 3A y Figura 4A). Bajo microscopía óptica (por ejemplo, aumento de 60x-100x) se puede observar una organización celular unicelular, colonial, filamentosa, espiral, ramificada o de tricomas de color verde, marrón claro o transparente. Esto indicará una posible asignación taxonómica.
    2. Caracterización genética: Validar el aislamiento de un solo genotipo de microorganismo mediante la extracción de ADN de los cultivos puros putativos, seguida de la secuenciación parcial del genoma. En las cianobacterias, el gen 16S rRNA es a menudo un objetivo (Figura 5A)22. Un análisis filogenético 16S puede identificar el grupo taxonómico22. En las microalgas, el ARNr 18S a menudo se dirige23. En el caso de los aislados de interés o los nuevos aislados, se puede proceder a la secuenciación del genoma completo.

4. Desarrollo de suspensiones de virus/bacteriófagos de un solo genotipo

NOTA: Este protocolo describe los procedimientos para aislar y purificar múltiples suspensiones virales y bacteriófagos de un solo genotipo a partir de muestras ambientales.

  1. Dilución y TEM de concentrados VLP
    NOTA: Mediante el uso de TEM y ensayos de placa en placa24, se logra la confirmación de que las VLP son bacteriófagos (o virus) de buena fe que infectan las células huésped.
    1. Microscopía electrónica de transmisión de filtrados (0,45 μm y 0,22 μm): Utilice concentrados de filtración de 0,45 μm y 0,22 μm de muestras de agua cruda (ver paso 2.1) para preparar las rejillas TEM16 y la imagen para examinar la heterogeneidad de las partículas del virus (es decir, la diversidad de morfotipos). Diluya las muestras que den como resultado cuadrículas con alta confluencia (por ejemplo, 90%) antes de completar los pasos posteriores para lograr una confluencia del 30% al 50%. El conteo manual de partículas o el uso de software de imágenes se pueden emplear para estimar la confluencia celular en cuadrículas.
      NOTA: La alta confluencia en las rejillas puede resultar en la limpieza del césped anfitrión en placas de medios sólidos en lugar de la aparición de placas individuales que pueden seleccionarse. Por lo tanto, diluir las muestras antes de los análisis de placa puede ahorrar tiempo. Alternativamente, se pueden probar múltiples placas de césped huésped para detectar interacciones huésped-virus utilizando diluciones en serie de concentrados de VLP.
    2. Detección de la actividad de bacteriófagos (o virus) en el césped del huésped: En placas de agar BG-11, cultive céspedes putativos del huésped de cianobacterias (o microalgas) a partir de material de trabajo (paso 3.1.2). Pipetee 0,5 mL de suspensión VLP en 4,5 mL de medio sobre el césped (Figura 6A, izquierda) y agite suavemente hasta que toda la superficie del césped esté cubierta con suspensión. Incubar en un fotobiorreactor durante 3-10 días a 25 °C con una intensidad de luz de 20-40 mmol de fotones/m2/s o hasta que las placas sean visibles en las placas (Figura 6A, derecha).
  2. Raspado de placas y desarrollo de suspensiones de virus o bacteriófagos de un solo genotipo
    NOTA: Mediante el raspado de fenotipos individuales de placa y la propagación de bacteriófagos en cultivos líquidos del huésped, se confirman las interacciones de buena fe huésped-bacteriófago (o huésped-virus), lo que permite desarrollar reservas de trabajo de bacteriófagos (o virus) para ensayos de infección. Las existencias de trabajo de bacteriófagos (o virus) deben valorarse mediante uno de varios métodos (p. ej., qPCR, ensayos de placa) para proceder con los ensayos de infección en una multiplicidad definida de infección (MOI).
    1. Aislar y propagar un genotipo de bacteriófago (o virus): Una vez que se puedan ver placas individuales en las placas (debido a la dilución adecuada del concentrado de VLP), use un asa estéril para raspar una sola placa. Agite el asa en un cultivo de semillas de 10 mL del huésped (Figura 6B, izquierda). Incubar con agitación leve (por ejemplo, 70-120 rpm) en un fotobiorreactor durante 3-10 días a 25 °C con una intensidad de luz establecida en 20-40 mmol de fotón/m2/s o hasta que caiga un diámetro exterior de730 nm o se detecten restos celulares en el fondo del tubo, lo que indica muerte/lisis celular (Figura 6B, derecha)25.
      NOTA: Si se forman placas en el césped del huésped pero no hay signos de infección en el cultivo líquido, las placas pueden haber sido formadas por una bacteriocina26 en lugar de un bacteriófago (o virus). La TEM puede respaldar los ensayos en placa al indicar la muerte celular por infección bacteriófaga (o viral).
    2. Cuantificación del título de las existencias de bacteriófagos (o virus): El aislamiento de bacteriófagos (o virus) se logra utilizando los métodos de filtración y concentración de espín descritos anteriormente. Cuantificar los títulos de las suspensiones de bacteriófagos (o virus) mediante ensayos seriados de placa de dilución27. Alternativamente, realizar la extracción de ADN y la secuenciación y filogenética del genoma completo del virus (Figura 5B) para desarrollar cebadores para realizar el titulamiento de bacteriófagos basado en qPCR para establecer existencias de trabajo para ensayos de infección posteriores.
      NOTA: La propagación de genotipos de bacteriófagos individuales (o virus) puede aumentarse a cultivos de 50 mL o 100 mL si los volúmenes de título o material de trabajo son demasiado bajos para las necesidades experimentales. Considere la naturaleza del sistema virus-huésped (por ejemplo, alta virulencia o baja virulencia), la multiplicidad de infecciones (MOI) que se planea para los ensayos de infección y cuántos ensayos de infección se completarán para un proyecto cuando se desarrollen existencias de trabajo de bacteriófagos (o virus). No es aconsejable descongelar y volver a congelar las existencias de virus. Descongele y use un stock completo de virus de réplicas de la misma preparación con el mismo título para cada experimento. Otras técnicas de titulación pueden complementar los métodos descritos, incluyendo la ionización por electrospray/espectrometría de masas (ESI/MS)28.

5. Ensayos de infección

NOTA: Este protocolo describe los ensayos de infección por fagos del huésped (o virus del huésped) que se utilizan para: caracterizar cualitativamente la virulencia, el rango del huésped y el fenotipo de infección (un indicador de la estrategia de replicación) en medios sólidos; y evaluar cuantitativamente la cinética de crecimiento, la virulencia del virus14 y la resiliencia del huésped15 en cultivo líquido.

  1. Determinación de la virulencia relativa de bacteriófagos (o virus) y el rango de huéspedes en medios sólidos
    NOTA: Todos los ensayos de medios sólidos, incluidos los ensayos puntuales en el césped, los ensayos de placa de dilución en serie de una sola placa y los ensayos de placa de resistencia del huésped, proporcionan datos cualitativos sobre los parámetros de infección bacteriófago-huésped, como la virulencia del virus, el rango de huéspedes y la estrategia de replicación. Los ensayos de crecimiento de cultivos líquidos permiten realizar mediciones y modelos más cuantitativos de la dinámica virus-huésped.
    1. Ensayos de localización puntual en el césped: Para determinar el rango de hospedadores, prepare el césped de múltiples huéspedes putativos aislados de muestras ambientales o de cepas adquiridas de otros laboratorios o colecciones de cultivos. En el césped, detecte 2 μL de suspensión de bacteriófagos (o virus) en el césped con una pipeta. En una región separada de la misma placa, detecte el mismo volumen de Triton X-100 y agua nanopura (18MW) como controles positivos y negativos, respectivamente16. Llevar a cabo múltiples ensayos puntuales con un bacteriófago (o virus) determinado en múltiples huéspedes para evaluar el rango de huéspedes del bacteriófago16. Los fenotipos de la placa ofrecen información sobre la estrategia de replicación de bacteriófagos (o virus). Las placas que tienen bordes afilados y que se aclaran hasta el agar indican replicación lítica, mientras que las placas con bordes difusos o un halo pueden indicar replicación no lítica16,17.
      NOTA: Alternativamente, los ensayos de placa de dilución en serie de una sola placa indican si existe una relación lineal entre el tamaño de la placa y el título de bacteriófago. Use un marcador en la parte posterior del plato para dividir el plato en una cuadrícula o secciones de pastel. A continuación, utilizando el mismo volumen (es decir, 2 ml) pero con diluciones de suspensión de bacteriófagos (p. ej., 1:1, 1:4, 1:16, 1:64), realice el ensayo de localización puntual en el césped en una sola placa huésped.
    2. Ensayos de resistencia del huésped: Para determinar si un conjunto de bacteriófagos puede producir infección en un huésped determinado, prepare un césped huésped en un plato como se describió anteriormente. Con un marcador en la parte posterior del plato, divida el plato en una cuadrícula o secciones de pastel. A continuación, localice 2 ml de cada suspensión de bacteriófagos (o virus) en una sección de la rejilla (o pastel), utilizando Triton X-100 y agua nanopura como controles. Si todas las suspensiones de bacteriófagos (o virus) se agregan a títulos iguales, evalúe la virulencia relativa entre las cepas de bacteriófagos (o virus) en el huésped cualitativamente (es decir, placa más grande = virus más virulento).
  2. Cuantificación de la virulencia, la resistencia y el crecimiento en ensayos de infección por cultivos líquidos
    NOTA: Los resultados cualitativos iniciales proporcionan una base para dirigirse a pares específicos de bacteriófago-huésped y realizar análisis más cuantitativos de la dinámica de las interacciones virus-huésped. En el cultivo líquido, se genera una curva de crecimiento del huésped infectado y se compara con el crecimiento del huésped no infectado (control).
    1. Realice el ensayo de infección de un solo virus/huésped líquido en cultivo como se describe a continuación.
      1. Establecer cultivos líquidos paralelos (~6-12) de un microorganismo (por ejemplo, una cianobacteria) que haya demostrado ser susceptible y permisivo mediante ensayos de placas de medios sólidos (paso 5.1) en: 1,0 L (320 mL de cultivo), 500 mL (160 mL de cultivo) o 250 mL (80 mL de cultivo) - matraces de cultivo deflectores, como se describió anteriormente17. En un punto de tiempo predefinido (normalmente 0,5 o 1 tiempo de duplicación del huésped), inocular un subconjunto de cultivos paralelos a una densidad celular equivalente (por ejemplo, OD730 nm = 0,08) por triplicado con suspensión de bacteriófagos utilizando el volumen adecuado necesario para producir una multiplicidad de infección (MOI) preseleccionada con el título de material de trabajo disponible.
      2. Deje otros cultivos paralelos (también por triplicado) sin inocular (es decir, sin infectar) como controles. Opcionalmente, inocule un tercer conjunto de cultivos paralelos con una cepa diferente de bacteriófago (o virus) para realizar comparaciones entre emparejamientos selectos de bacteriófago-huésped. Deje que los cultivos crezcan en un fotobiorreactor durante 3-10 días a 25 °C con una intensidad de luz establecida en 20-40 mmol de fotones/m2/s.
      3. Genere curvas de crecimiento del huésped tomando lecturas deOD 730 nm a intervalos de tiempo regulares (por ejemplo, 8 h) de cultivos infectados y no infectados (control) con bacteriófagos (Figura 7A). Utilice la verificación TEM de cultivos de control no infectados (Figura 7C) y la infección productiva en cultivos de células huésped (Figura 7D). Los efectos citopáticos29,30 son fácilmente observables en la mayoría de las células infectadas, mientras que las células no infectadas no muestran signos de transformación morfológica o estrés.
    2. Análisis de referencia para ensayos de infección por cultivo líquido: A partir de los ensayos de infección por cultivo líquido de un solo virus/huésped único (SVSH), se pueden derivar varias métricas de referencia, tales como: tasa máxima de crecimiento específico (μmáx.)31, virulencia relativa de bacteriófagos (o virus)14 y resistencia relativa del huésped15- para una descripción más cuantitativa de la dinámica bacteriófago-huésped o virus-huésped (Figura 7B). Las métricas estándar notificables incluyen la tasa de crecimiento (a menudo informada como tasa de crecimiento específica máxima, o μmáx.) y la virulencia relativa (VR)14 en comparación con un control de huésped no infectado y/o un bacteriófago separado en el mismo huésped. También se pueden informar otras métricas, como la capacidad de carga del sistema (Nasíntota) y la resiliencia relativa del huésped (RR)15.

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Resultados

El uso de un generador eléctrico portátil de gasolina, una bomba de transferencia de agua y una tubería resistente al colapso sirve como una forma efectiva de extraer muestras de agua del océano, lagos, lagos congelados y otros ambientes acuáticos (por ejemplo, lagunas) a profundidades seleccionadas (Figura 1, tres filas superiores). Se requiere un equipo alternativo para aguas ácidas de alta temperatura de aguas termales geotérmicas, piscinas y ollas de lod...

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Discusión

La virosfera es vasta y diversa, por lo que requiere diferentes enfoques experimentales para estudiar diferentes sistemas virales. Esto incluye diferentes estrategias para aislar virus y sus huéspedes de diferentes entornos y diferentes métodos de procesamiento para garantizar que se puedan producir cultivos puros de huéspedes y sus virus a partir de muestras crudas. Estos cultivos puros se pueden utilizar en ensayos de infección por SVSH, tanto en medios sólidos como en cultivos líquido...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado en parte por la subvención n.º 1856091 (PI-Ceballos) de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (NSF) y la subvención n.º 2119968 (PI-Ceballos) de la NSF DBI. Los autores reconocen las contribuciones del Dr. Chinnapong Wangnai y el Dr. Chakrit Tachaapaikoon de la Universidad Tecnológica King Mongkut de Thonburi (Tailandia), quienes proporcionaron videografía y apoyo de campo para el muestreo ambiental, respectivamente. Los autores también agradecen al Dr. Jorge Armando Leiva Sanabria de la Universidad de Costa Rica - Guanacaste por su asistencia en la obtención de permisos de muestreo de los Parques Nacionales en Costa Rica y por ayudar en la recolección de muestras de las piscinas geotérmicas. Asimismo, los autores agradecen al Sr. Enrique Marroquín, Jr. (Universidad de California Merced) y a la Sra. Alexia Maceda (Universidad de Maine, Orono, ME, EE.UU.), quienes ayudaron con el muestreo en la costa del sur de California y en los lagos del norte de Minnesota, respectivamente. Los autores agradecen y reconocen el apoyo técnico de la Sra. Socheata Hour, quien calculó los parámetros de infección para el conjunto de datos φSBL14-SWII.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bomba de transferencia de acero inoxidable de 1 hpUtilitech, Charlotte, Carolina del Norte, Estados UnidosN/A
Tubos de 1,5 mlwww.eppendorf.com30123611
Concentrador de centrifugado 10K NMWL Centricon Plus 70www.sigmaaldrich.comUFC701008
Matraces Erlenmeyer con deflectores de 250 ml www.sigmaaldrich.comCLS4450250
Generador inversor de 3800 vatios Productos WEN, West Dundee, IL, EE. UU.WEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
Matraces Erlenmeyer con deflectores de 500 ml www.sigmaaldrich.comCLS4450500
Jarras de agua de 5 galoneswww.homedepot.comN/A
80 pies de largo, 0.5 " diámetro, nailonhttps://facomex.mx/producto/combo/N/A
Un Sailfish 2660 de consola central de 26 pies de profundidad con dos motores fueraborda Yamaha de 150 hp https://yamahaoutboards.com/N/A
Acetato de amonio (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Ácido bórico (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Centrífuga 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
Ácido cítrico (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Nitrato de cobalto (II) hexahidratado [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Manguera flexible de goma resistente al colapsoswanhose.comCELTF58050
Sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Tubos de centrífuga Corning de 50 ml www.sigmaaldrich.comCLS430291
Fosfato dipotásico (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Ácido etilendiaminotetraacético disódico (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume y espectrofotómetro y florómetrowww.denovix.comN/A
Cinta adhesivawww.homedepot.comN/A
Tubos Eppendorfwww.sigmaaldrich.comEP022364120
Etanolwww.sigmaaldrich.com64175
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
Citrato de amonio férrico (C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Tubo de PVC azul Flex-plus www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - Agitador de incubadora apilablewww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Microscopía electrónica Microscope_Transmission electrónica de sobremesa (TEM)delongamerica.comN/A
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Ancla de hongo recubierta de vinilo negro/30 lbswww.homedepot.comN/A
Placas de Petri, poliestirenowww.sigmaaldrich.comP5481
Copa de filtro de membrana de polietersulfona (PES) con 0,22 mmwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
Copa de filtro de membrana de polietersulfona (PES) con 0,45 mmwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
Xantogenato de etilo de potasio (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Carbonato de sodio (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Dodecil sulfato de sodio [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Molibdato de sodio dihidratado (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Nitrato de sodio (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanosulfónico aci (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Tritón X-100 www.sigmaaldrich.comT8787
Clorhidrato de Trizma (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Bomba de vacío/presión Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, EE. UU.EW-79204-00
Tubos de vinilo www.homedepot.comN/A
Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

Referencias

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