Visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular

Resumen

Este protocolo combina el aclaramiento óptico y el inmunomarcaje para obtener imágenes confocales de volumen completo de organoides de retina de montaje completo. Preserva la estructura 3D, lo que permite una visualización detallada de las vías neuronales clave, mejorando el estudio de la maduración de la retina, la organización espacial y sus posibles aplicaciones en el modelado de enfermedades y la medicina personalizada.

Resumen

Los organoides de la retina derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos son intrincadas estructuras 3D que imitan la retina humana, ofreciendo una poderosa plataforma para estudiar el desarrollo de la retina, los mecanismos de la enfermedad y las posibles estrategias terapéuticas. Además, al derivarse de los pacientes, son cada vez más populares, ya que son muy prometedores como herramienta para la medicina personalizada. A diferencia de los cultivos celulares 2D convencionales, los organoides de retina conservan la arquitectura 3D nativa de la retina, lo que permite una representación más realista y estudios más relevantes fisiológicamente. Sin embargo, su complejidad estructural, alta densidad celular y composición diversa presentan desafíos significativos para la caracterización.

Para abordar estos desafíos y mejorar nuestra comprensión de la maduración de los organoides de la retina mientras preservamos el contexto 3D, combinamos métodos de aclaramiento óptico con inmunomarcaje para visualizar toda la estructura de los organoides de montaje completo con microscopía confocal. Para ello, empleamos un método de limpieza compatible con objetivos de apertura numérica baja y alta, lo que facilita la obtención de imágenes de volumen completo y la captura de ciertas regiones de interés con resolución celular. Utilizando este enfoque, identificamos la morfología y distribución en 3D de las tres principales rutas neuronales responsables de la transmisión de información visual: fotorreceptores de cono y bastone, células bipolares y ganglionares. Nuestros hallazgos arrojan más luz sobre las técnicas de visualización para abordar la organización espacial de las células de la retina dentro del organoide.

Introducción

Organoides de la retina

Los organoides de la retina son estructuras 3D complejas que imitan la retina humana, ofreciendo una valiosa plataforma para estudiar el desarrollo de la retina, los mecanismos de la enfermedad y las^{posibles estrategias} terapéuticas. Mantienen la arquitectura 3D natural de la retina, demuestran fidelidad transcriptómica y competencia funcional, reproduciendo la fototransducción y la conectividad sináptica². Además, imitan de cerca el desarrollo in vivo ^3,4, lo que permite una representación más realista en comparación con los cultivos celulares planos. En estudios previos, Isla-Magrané et al. establecieron un protocolo de dos pasos para obtener organoides multioculares derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) para modelar las características celulares del ojo humano en desarrollo ^5,6. Debido a la escasez de tejido fetal, la investigación sobre el desarrollo del ojo humano se ha restringido a estudios anatómicos.

Los organoides de la retina obtenidos con este protocolo exhibieron una estratificación adecuada y contenían todos los subtipos principales de células de la retina, como fotorreceptores, células bipolares, células ganglionares, células amacrinas y horizontales, y macroglía, junto con características morfológicas clave y una organización y conexiones espaciales correctas. Los modelos de organoides, aunque son una solución potencial, exhiben una variabilidad significativa, lo que dificulta el logro de resultados consistentes. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de emplear una variedad de tecnologías avanzadas en modelos humanos más confiables. Hasta la fecha, estos organoides solo se han estudiado utilizando secciones histológicas, ya que su compleja composición celular, densidad y tamaño dificultan la penetración de la luz, lo que resulta en un rendimiento deficiente de las imágenes ópticas en las capas más profundas, lo que limita el análisis exhaustivo.

Imágenes de montaje completo

Las técnicas histológicas tradicionales, que implican la sección y tinción de tejidos fijos, pueden proporcionar información detallada sobre regiones específicas, pero no logran capturar la arquitectura general y las relaciones espaciales dentro de todo el organoide. Para superar esta limitación, las imágenes de montaje completo surgen como una herramienta valiosa para el estudio de los organoides de la retina. Las imágenes de montaje completo permiten la visualización de todo el organoide en su forma 3D intacta, preservando la distribución espacial de los tipos de células y los componentes de la matriz extracelular. Este enfoque es particularmente beneficioso para investigar la composición celular dentro y entre los organoides, proporcionando una comprensión más completa de sus procesos de desarrollo y organización funcional. Sin embargo, debido a su densidad celular y compactación, los organoides de la retina son opacos (Figura 1, sin aclarar). La opacidad inherente de las muestras provoca la dispersión de la luz, lo que dificulta la visualización detallada de las estructuras internas mediante microscopía. Aquí, las técnicas de limpieza óptica emergen como una herramienta poderosa.

Técnicas de limpieza óptica

El aclaramiento óptico se refiere a los tratamientos fisicoquímicos que hacen transparentes las muestras biológicas gruesas mediante la homogeneización de los gradientes del índice de refracción (IR) del tejido para que coincidan con los del agente aclarante y la eliminación de las sustancias que absorben la luz⁷. Estos métodos reducen drásticamente la dispersión de la luz y aumentan la transparencia. Esta transformación nos permite ver a través de todo el organoide de la retina, lo que permite un análisis exhaustivo de su intrincada organización y morfología celular a través de técnicas de imagen de montaje completo. En la práctica, esto se logra impregnando la muestra con una sustancia RI alta y eliminando lípidos y pigmentos.

Existen diferentes métodos de aclarado, que difieren en varios aspectos (por ejemplo, grado de transparencia, compatibilidad con técnicas microscópicas, muestras y moléculas fluorescentes, viabilidad, duración), pero ninguno se destaca como el mejor protocolo común⁸. Se clasifican en cuatro grandes grupos: (1) inmersión simple, (2) hidrofóbica a base de solvente orgánico, (3) basada en hiperhidratación y (4) basada en transformación de tejidos o inclusión en hidrogel, como bien lo resume Avilov et al⁷. Todos los métodos incluyen un paso para la coincidencia de IR, generalmente sumergiendo la muestra en una solución que coincida con el IR promedio del tejido. En los métodos hidrofóbicos, los lípidos y el agua se eliminan sumergiendo la muestra en una concentración creciente de disolvente orgánico (como metanol o propanol).

El protocolo presentado es un método optimizado que integra el aclaramiento óptico con el inmunomarcaje para facilitar la visualización en 3D de todo el montaje de organoides de la retina con microscopía confocal, lo que permite obtener imágenes de volumen completo al tiempo que preserva la integridad estructural. Este enfoque permite la identificación de tipos clave de células de la retina dentro del organoide, proporcionando a los investigadores una poderosa herramienta para investigar la maduración de los organoides de la retina y la organización espacial en un contexto fisiológicamente relevante.

Protocolo

1. Preparación de anticuerpos secundarios fluorescentes a medida

NOTA: Este enfoque sirve como alternativa al uso de anticuerpos fluorescentes comerciales (consulte la discusión sobre las ventajas de preparar anticuerpos secundarios fluorescentes). Además, este protocolo se puede utilizar para conjugar fluoróforos con anticuerpos primarios en caso de que se deba realizar inmunofluorescencia directa y el anticuerpo primario fluorescente no esté disponible comercialmente. El control de la relación entre fluoróforos y anticuerpos mediante el ajuste de la cantidad de fluoróforo en la reacción de marcaje produce anticuerpos conjugados más brillantes. Sin embargo, los anticuerpos secundarios hechos a medida son menos estables y la concentración del conjugado resultante es 10 veces menor que la de los anticuerpos fluorescentes comerciales. Este protocolo es una adaptación del trabajo descrito por Bálint et al⁹.

1. Disuelva 1 mg del fluoróforo en DMSO anhidro y alícuota en tubos para obtener un final de 0,02 mg de fluoróforo por tubo. Retire todo el DMSO con un concentrador de vacío rápido, funcionando durante 1 h y 30 min. Almacenar alícuotas a -20 ºC protegido de la luz. Para Alexa Fluor 405, el H₂O ultrapuro es el disolvente adecuado para fabricar alícuotas.
2. Para realizar la reacción de etiquetado, disuelva una alícuota del fluoróforo en 1-10 μL de DMSO (o H₂O ultrapuro para Alexa Fluor 405).
   NOTA: La cantidad exacta de DMSO se determina a través de pruebas de conjugación de control anteriores. Estas pruebas se realizan cuando se va a utilizar un nuevo lote de un fluoróforo (o cuando se está acabando un lote de fluoróforo anterior), o cuando se utiliza un nuevo fluoróforo por primera vez en la conjugación. La prueba de conjugación de control consiste en llevar a cabo reacciones de marcaje con cantidades variables de fluoróforo para determinar la relación óptima entre fluoróforo y anticuerpo en el conjugado. En nuestro caso, la proporción óptima suele estar entre 3 μL y 5 μL.
3. Incubar 50 μL de IgG secundaria (o primaria), 6 μL de NaHCO₃ 1 M y 1-5 μL de fluoróforo durante 40 min a temperatura ambiente (RT) en una plataforma oscilante, protegida de la luz.
4. Mientras avanza la reacción, prepare las columnas de exclusión del tamaño de purificación quitando sus tapas y dejando pasar el tampón. Equilibre la columna (una para cada reacción de etiquetado) pasando 3 x 2-3 mL de PBS a través de la columna. En caso de que el último paso de equilibrio termine antes de que termine la incubación, vuelva a colocar las tapas para evitar que se sequen y espere hasta que finalice la reacción de etiquetado.
   NOTA: Las columnas de exclusión de tamaño de purificación funcionan por gravedad. Asegúrese de que la columna no se seque en ningún momento, o la reacción de purificación no funcionará correctamente.
5. Cuando finalice la reacción (paso 1.3), agregue 140 μL de PBS a la reacción de etiquetado para hacer que el volumen sea de aproximadamente 200 μL y vértice. Agregue esta solución al centro de la columna, permita que la muestra ingrese a la columna y, después de que la última gota haya eluido, empuje agregando 550 μL de PBS. Cuando el líquido deje de caer, eluir añadiendo 300 μL de PBS y recogerlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
6. Calcule la concentración de anticuerpos y las proporciones de marcaje midiendo la absorbancia de la muestra a 280 nm y la absorbancia de los fluoróforos utilizados. Aplique la Ley de Beer-Lambert para determinar la concentración (en molaridad) de la siguiente manera:
   
   Donde A representa la absorbancia, ε para el coeficiente de extinción molar, y CF₂₈₀ es una medida de la absorbancia que tiene el fluoróforo específico a 280 nm que sirve como factor de corrección. Entonces, la concentración del anticuerpo es:
   
   Y la proporción de etiquetado es:
   
7. Almacene los anticuerpos marcados a 4 ºC, protegidos de la luz, hasta 6 meses.

2. Marcaje de inmunofluorescencia

1. Fijar los organoides con un 4% de paraformaldehído (PFA) a RT durante 45 min.
   NOTA: OPCIONAL: Incubar los organoides con una solución de recuperación de antígenos (pasos 2.2 y 2.3) para mejorar la inmunorreactividad de los antígenos.
2. Preparar 40 mL de solución de recuperación de antígenos mezclando 0,117 mg de citrato sódico tribásico dihidratado en H₂O ultrapuro y ajustar a pH 9.
3. Incubar los organoides con la solución de recuperación de antígenos con una agitación suave (30 rpm) a 60 °C durante 1 h.
4. Permeabilizar los organoides con PBST (PBS con 1% Triton X-100) con agitación leve a RT durante 4 h.
5. Bloquee los organoides con una solución bloqueante (2% de albúmina sérica bovina (BSA) con 0,1% de Triton X-100) en RT durante la noche (o durante 1 día).
   NOTA: Las concentraciones de anticuerpos primarios y secundarios dependen del anticuerpo en particular. Para la inmunofluorescencia de muestras de montaje completo, utilizamos una concentración más alta en comparación con las muestras seccionadas. Incubamos el anticuerpo primario a 10 μg/mL que, en la mayoría de los casos, corresponde a 1:100 de la cepa (Tabla 1). Incubamos nuestros anticuerpos secundarios hechos a medida a 20-50 μg/mL.
6. Incubar los organoides con los anticuerpos primarios diluidos en solución de lavado (0,1% BSA con 0,1% Triton X-100) a 4 °C durante 2 días con una leve agitación.
7. Lave los organoides durante 3 x 15 min en solución de lavado agitando ligeramente a RT.
8. Incubar los organoides con los anticuerpos secundarios diluidos en solución de lavado a 4 °C durante 2 días con una leve agitación.
9. Lave los organoides durante 3 x 15 min en solución de lavado agitando ligeramente a RT.
   NOTA: Después del inmunomarcaje, se pueden incubar los tintes fluorescentes de elección. Normalmente utilizamos marcadores de núcleos fluorescentes, como DAPI (1:1.000) y DRAQ5 (1:500), o faloidina (1:100) para visualizar la red de filamentos de actina.
10. Incubar los organoides con los colorantes fluorescentes diluidos en solución de lavado a RT durante 1 h con una leve agitación.
11. Lave los organoides durante 3 x 15 min en solución de lavado agitando ligeramente a RT.

3. Aclarado óptico con FluoClear BABB

NOTA: El 1-Propanol podría comprometer los envases de plástico, especialmente para la exposición a largo plazo. Para estar seguro, use recipientes de vidrio.

1. Paso de deshidratación
   1. Prepare soluciones de 1-propanol en H₂O ultrapuro en los porcentajes indicados (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) y luego ajuste a pH 9.5 con trimetilamina.
      PRECAUCIÓN: La trietilamina es tóxica si se inhala. Trabaje debajo de una campana extractora. Las soluciones se pueden reutilizar si se almacenan correctamente (recipiente bien sellado). Ajuste el pH antes de usar.
   2. Incubar las muestras con el gradiente creciente de soluciones de 1-propanol (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) durante 2 h cada una a 30 °C con una agitación suave.
   3. Incubar las muestras con 100% de 1-propanol durante la noche a 30 °C con una leve agitación.
2. Paso de compensación
   PRECAUCIÓN: BABB es una potente mezcla de solventes que es conocida por su capacidad para disolver o dañar significativamente muchos plásticos. Para estar seguro, use recipientes de vidrio con tapas compatibles y trabaje dentro de una campana extractora.
   1. Prepare el BABB mezclando alcohol bencílico (BA) y benzoato de bencilo (BB) en una proporción de 1:2.
   2. Sumerja las muestras en BABB en RT durante la noche.
   3. Antes de tomar imágenes, actualice el BABB.
      NOTA: Para organoides de ~ 1 mm de diámetro, BABB induce un efecto de limpieza que es evidente en decenas de minutos. Dependiendo del tamaño y la naturaleza de la muestra, el grado de aclaramiento puede ser diferente y/o requerir un tiempo de exposición más prolongado a la solución de aclarado. Recomendamos adquirir imágenes antes y después de la inmersión en BABB para mejorar el protocolo de limpieza.
   4. Almacene las muestras aclaradas de BABB con la solución de BABB a largo plazo a 4 °C. Proteger de la luz para preservar la fluorescencia.

4. Adquisición de imágenes de montaje completo

1. Con una pipeta de vidrio, coloque el organoide en una placa de Petri con fondo de vidrio con una gota de BABB. Asegúrese de que la muestra entre en contacto con la superficie del cubreobjetos.
   PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de que la gota de BABB que contiene la muestra no entre en contacto con los bordes de plástico del plato, o derretirá el plástico, comprometiendo la muestra y la calidad de las imágenes.
2. Utilizando un microscopio de escaneo láser confocal invertido equipado con objetivos de aumento bajo y alto, adquiera imágenes de pila Z para obtener la visión 3D completa de la muestra con detalles celulares.
   NOTA: Para este estudio, se utilizó un objetivo de aire de 0,4 con apertura numérica (NA) de 10x y un objetivo de NA 1,4 de 63x, con un tamaño de paso de 3,5 μm y 1 μm, respectivamente.

5. Procesamiento de imágenes

1. Recalibre el tamaño del paso de la adquisición de la pila Z teniendo en cuenta la falta de coincidencia del índice de refracción (RI) entre la solución de limpieza y el medio de inmersión.
   1. Calcule el tamaño del paso recalibrado de la siguiente manera:
      
      Para una muestra incrustada en BABB, fotografiada con un objetivo de aire con un tamaño de paso de 3,5 μm, será el siguiente:
      
   2. Usando ImageJ, cambie la profundidad del vóxel (haga clic en Imagen | Propiedades...) para el tamaño de paso recalculado.
2. Cree proyecciones de imágenes de la pila Z.
   1. Usando ImageJ, inspeccione la pila Z en profundidad (haga clic en Imagen | Pilas | Vistas ortogonales). Aparecerán las vistas XY, XZ e YZ del organoide de la retina.
   2. Guarde las regiones de interés deseadas (haga clic en Archivo | Guardar como...).
3. Cree una animación del renderizado 3D de la pila Z utilizando un software de procesamiento (consulte la Tabla de materiales).
   1. Seleccione los canales que se visualizarán activando sus casillas de verificación.
   2. Ajuste los planos Z para visualizar el interior de la muestra (active Recorte en la casilla de verificación).
   3. Grabe la animación usando el editor de películas (habilite el editor de películas en la casilla de verificación). Arrastre y suelte, y acerque y aleje directamente con el mouse. Haga clic en Agregar para incluir un clip diferente para la animación. Si ajusta los planos Z, habilite la opción Recortar planos (haga clic en Configuración... | marque la casilla Recortar planos ).

Resultados

Figura 1: Comparación de tres métodos de compensación. Izquierda: Imágenes de campo claro de (A) muestras sin aclarar y (B-D) aclaradas. Derecha: Pila Z con vistas ortogonales xz e yz de 90 organoides de retina DIV teñidos con el marcador nuclear DRAQ5 (amarillo) adquiridos con un microscopio de barrido láser confocal equipado con un objetivo de aire 10x (RI = 1,00). (A) Organoide retiniano no aclarado (N = 3). Los organoides de la retina fijados con PFA no son lo suficientemente transparentes para la visualización en 3D. (B) Organoide aclarado con fructosa/glicerol (n = 3). (C) Organoide autorizado por ECi (N = 3). (D) Organoide FluoClear eliminado por BABB (N = 3). Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: BF = campo claro; CLSM = microscopio de barrido láser confocal; IR = índice de refracción; PFA = paraformaldehído; ECi = cinamato de etilo; BABB = alcohol bencílico/benzoato de bencilo; DIV = días in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Comparación de métodos de aclaramiento óptico para estudios de inmunofluorescencia en organoides neurorretinianos

Aquí, presentamos los resultados de tres métodos de aclaramiento para demostrar la eficacia de FluoClear BABB para hacer que los organoides de la retina sean transparentes. En la Figura 1, observamos organoides de la retina aclarados con Fructosa/Glicerol (Figura 1B), ECi (Figura 1C) y FluoClear BABB (Figura 1D). Se eligieron los métodos de aclaramiento ensayados porque se ha demostrado que todos ellos^10,11 son compatibles con la tinción por inmunofluorescencia y preservan la fluorescencia de las proteínas endógenas (p. ej., GFP presente en los GCaMPs).

Fructosa/Glicerol¹² es un protocolo de limpieza por inmersión simple y no tóxico que no requiere deshidratación, lo que reduce significativamente el tiempo de procesamiento en comparación con otros métodos. Se ha reportado que es eficiente para transparentar organoides derivados de diversos tejidos: vías respiratorias, riñón, hígado y cáncer de mama humano¹².

ECi (cinamato de etilo)¹¹ es un saborizante alimentario aprobado por la FDA y aditivo para cosméticos^13,14, se considera inofensivo y ha demostrado ser un excelente reactivo de limpieza para los tejidos de mamíferos. Es conocido por su rápida capacidad de limpieza y mínima distorsión tisular. Se clasifica como un método de limpieza hidrofóbico, pero en comparación con los disolventes a base de BABB, no es tóxico y conserva la fluorescencia de las proteínas fluorescentes durante más tiempo (hasta 14 días). Como es común en la mayoría de los protocolos de limpieza, ECi requiere un paso previo de deshidratación. Para obtener resultados óptimos, este paso se logra sumergiendo la muestra en soluciones con concentraciones de alcohol que aumentan progresivamente. Debido a que la ECi no es dañina, una vez que se elimina la muestra, se puede manipular de manera segura y almacenar en recipientes de plástico. Sin embargo, los pasos de deshidratación se realizan utilizando 1-propanol, un solvente orgánico que debe manipularse debajo de una campana extractora y almacenarse en recipientes de vidrio.

FluoClear BABB¹⁰ es una forma variante de un protocolo hidrofóbico basado en alcohol bencílico/benzoato de bencilo (BABB) como solución de coincidencia de índice de refracción. Se sabe que es muy tóxico y corrosivo, por lo que debe manipularse con cuidado. Se ha descrito que FluoClear BABB es una versión mejorada que conserva la GFP y la RFP mejor que las versiones anteriores y permite el uso de 1-propanol o terc-butanol como agentes de deshidratación.

Para evaluar el rendimiento de los tres métodos de aclarado, tomamos imágenes de los planos Z con un microscopio confocal equipado con un objetivo aéreo NA0,4 de 10x, que proporciona un gran campo de visión (FoV) de 2,5 x 2,5 x 2,56 mm para capturar todo el volumen del organoide de la retina. Utilizamos organoides retinianos en un estado intermedio de maduración (90 días in vitro (DIV)) que contienen todas las neuronas de la retina (células ganglionares, células bipolares y fotorreceptores), logrando la densidad y compactación celular y, por lo tanto, siendo opacos. Como se explicó en la introducción, el aclaramiento óptico se logra cuando RI coincide en todo el objeto que se va a fotografiar. Por lo tanto, los medios de inmersión utilizados para la obtención de imágenes tendrán un impacto drástico en la transparencia lograda. En la Tabla 2 se detalla la IR de los medios de inmersión y las soluciones de limpieza probadas.

	Solución	Índice de refracción
Medios de inmersión	Aire	1
	Agua	1.33
	Glicerol	1.45
	Aceite	1.51
Soluciones de compensación	Fructosa/Glicerol	1.468
	ECI	1.558
	FluoClear BABB	1.56

Tabla 2: Índice de refracción (IR) de los medios de inmersión más utilizados para la microscopía óptica y las metodologías de aclaramiento óptico probadas para el aclaramiento de organoides de retina. Abreviatura: RI = índice de refracción.

Al comparar las imágenes confocales resultantes (Figura 1, panel derecho), el tratamiento con fructosa/glicerol resultó en la menor mejora en la transparencia, lo que limitó la visualización de las capas de la retina e impidió la visualización del núcleo del organoide. ECi logró una mejor transparencia, lo que permitió la visualización de las capas de la retina, pero aún así una visualización limitada del núcleo del organoide de la retina debido a la dispersión de la luz que dificultó la detección de fluorescencia de las partes internas de la muestra. FluoClear BABB proporcionó la mayor mejora en la transparencia, permitiendo una visualización clara tanto del núcleo como de la corteza del organoide de la retina a una resolución más alta con una intensidad de fluorescencia similar.

Vale la pena mencionar que tanto los protocolos ECi como FluoClear BABB indujeron una contracción notable de la muestra, como lo ilustran las imágenes de campo claro correspondientes de cada organoide de retina aclarado (Figura 1, panel izquierdo). La contracción de la muestra se debe a los pasos de deshidratación anteriores que eliminan el agua, y esa es la razón por la que el protocolo de fructosa/glicerol no encoge la muestra. Esta contracción, sin embargo, presenta una oportunidad única para una exploración más profunda. Aunque comprime el tamaño total del organoide y potencialmente subestima las distancias internas, también aumenta la compacidad. Esta compacidad isotrópica, relativamente uniforme en todas las direcciones, nos permite aprovechar objetivos de gran aumento con un poder de resolución superior (debido a su mayor NA) que, de otro modo, solo obtendrían imágenes de la capa celular más externa debido a sus distancias de trabajo más cortas (WD). Por ejemplo, un objetivo de aire NA 0.4 10x ofrece un WD de 2.53 mm, mientras que un objetivo de aceite NA 1.4 de 63x con una resolución significativamente mejor tiene un WD de solo 0.14 mm. Al utilizar organoides más compactos y aclarados por BABB, podemos superar eficazmente esta limitación y lograr imágenes de alta resolución de estructuras más profundas, como la capa de células ganglionares ubicada dentro del interior del organoide (Figura 2).

Figura 2: Reconstrucciones en 3D de un organoide de la retina (200 DIV) aclarado con FluoClear BABB imageizado con un microscopio confocal de barrido láser. El microscopio estaba equipado con un (A) objetivo de aire 10x NA 0.4 y (B) un objetivo de aceite NA 1.5 de 63x. El claro y la obtención de imágenes permiten la visualización de todo el organoide y, al mismo tiempo, la imagen con detalle fino de algunas regiones de interés. DRAQ5 (núcleos), opsina B+GR (conos) y TUJ1 (neuronas). Abreviaturas: DIV = días in vitro; BABB = alcohol bencílico/benzoato de bencilo; NA = apertura numérica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En conclusión, nuestra elección para el aclarado fue FluoClear BABB, ya que ofrecía una visualización superior de todo el organoide de la retina con alta resolución y relación señal-ruido. Es importante destacar la contracción inducida por BABB, compactando el organoide isotrópicamente. Esta compacidad nos permitió aprovechar los objetivos de gran aumento para la exploración detallada de estructuras más profundas. Por último, la compatibilidad de BABB con los objetivos de inmersión en aceite garantizó una dispersión mínima de la luz y una imagen de alta calidad en todos los aumentos.

Identificación y distribución espacio-temporal de las células de la retina dentro de los organoides a lo largo de la maduración

Siguiendo la metodología aquí detallada, y empleando imágenes de montaje completo en organoides inmunomarcados con los anticuerpos específicos detallados en la Tabla 1, estudiamos cómo se conforma la neurorretina a partir de organoides en diferentes puntos de maduración, desde etapas tempranas de desarrollo (40 DIV) hasta etapas más maduras (hasta 250 DIV), exhibiendo una estructura 3D bien definida. Este enfoque nos permitió visualizar la formación y organización de varios componentes de la retina descritos en esta sección.

Anticuerpo	Especificidad	Objetivos	Ubicación en Retina	[ ]final (dilución)	Anfitrión	#RRDI
Anti-GFP	GFP	GFP	Células GCaMP6s positivas	10 μg/ml (1:1.000)	Ch	AB_300798
Chx10	Hipotálamo ventromedial, homeobox 2 (Vsx2)	Factor de transcripción	Neuroblastos y células bipolares	10 μg/mL (1:2)	Sra.	AB_10842442
Opsina B	Azul opsina	Segmento exterior de los conos azules	Conos azules	10 μg/mL (1:100)	Rb	AB_177457
Opsin RG	Opsina verde y rojo	Segmento exterior de conos verdes y rojos	Conos verdes y rojos	10 μg/mL (1:100)	Ch	AB_11213279
RECOV	Recoverina	Proteína de unión al calcio	Fotorreceptores	10 μg/mL (1:100)	Rb	AB_2253622
RHO (RET-P1)	Rodopsina	Segmento exterior de las varillas	Barras	63 μg/ml (1:100)	Sra.	AB_260838
TUJ1	Beta-tubulina de clase III específica de neuronas	Isoforma de tubulina beta-III	Neuronas	50 μg/ml (1:200)	Sra.	AB_2315514

Tabla 1: Anticuerpos primarios probados en organoides de la retina de diferentes etapas de maduración. Abreviaturas: Pollo = Ch; ratón = ms; Conejo = Rb.

El inmunomarcaje con diferentes marcadores permitió la identificación de las células conformes a esta estructura estratificada. TUJ1 es una beta-tubulina de clase III específica de una neurona (Tabla 1), típicamente utilizada en muestras seccionadas para etiquetar células ganglionares de la retina (RGCs)¹⁵ debido a su abundancia. TUJ1 está presente en todas las neuronas de la retina¹⁶ y desde etapas tempranas de diferenciación neuronal¹⁷. La expresión de TUJ1 se encontró en todas las etapas de maduración en la corteza del organoide, lo que permite el seguimiento de la organización de las células de la retina en capas. En la Figura 3, podemos observar que en etapas tempranas de desarrollo (40 DIV), TUJ1 se distribuye uniformemente en una sola capa, delgada y uniforme. A partir de los 90 DIV, la región apical del organoide se vuelve más densa y compacta, ya que se pobló con muchas más células que se acumulan en la región apical. A 170 DIV, el organoide retiniano adquirió una estructura retiniana estratificada en 3D con una capa apical discreta. A 200 DIV, podemos ver que hay otros cuerpos celulares que extienden proyecciones largas, que son mucho menos numerosas, que se encuentran más profundamente dentro del organoide. Finalmente, a 250 DIV, la estructura en tres capas nucleares es evidente, correspondiendo a: (1) la capa nuclear externa (ONL) conformada por fotorreceptores maduros, (2) la capa nuclear interna (INL) poblada principalmente por células bipolares y (3) la capa de células ganglionares (GCL) formada por RGCs, como se indica en la Figura 3 (abajo a la derecha).

Figura 3: Organización de las neuronas tras la maduración de los organoides de la retina en una estructura estratificada por capas. Proyecciones Z-stack de imágenes confocales de organoides retinianos aclarados con FluoClear BABB teñidos con TUJ1. A 40 DIV, no se forman estructuras estratificadas. A partir de 170 DIV, la neurorretina se estratifica en capas. Se indican las capas nucleares de la retina: ONL, INL y GCL (puntas de flecha amarillas). Barras de escala = 25 μm (izquierda) y 10 μm (derecha). Abreviaturas: BABB = alcohol bencílico/benzoato de bencilo; DIV = días in vitro; ONL = capa nuclear externa, INL = capa nuclear interna; GCL = capa de células ganglionares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Con esta metodología, también podríamos reportar el ensamblaje de haces de axones. Como se observa en las regiones ampliadas (Figura 4), observamos haces de fibras que se extienden desde el núcleo interno del organoide hacia la periferia, proyectándose hacia regiones muy separadas (hasta 1 mm). Curiosamente, la formación de estas fibras se produjo en diferentes etapas de maduración. A medida que el organoide crece, las fibras se engrosan, se vuelven más complejas y acumulan más proyecciones celulares (Figura 4 [250 DIV] y Video Suplementario S1). Las RGC son las primeras células en diferenciarse durante el desarrollo de la retina y, por lo tanto, pueden organizar sus proyecciones desde etapas muy tempranas del desarrollo. Las RGC pueden iniciar la extensión de las neuritas incluso antes de establecer su posición final dentro del organoide. Nuestros hallazgos se alinean con informes previos¹⁸ que demuestran la formación de una estructura similar al nervio óptico en cocultivos de organoides de retina y cerebro.

Figura 4: Montaje de proyecciones neuronales en diversas etapas de maduración. Las fibras se extienden desde los planos internos del organoide de la retina hacia la periferia. La formación de estas fibras ocurrió a lo largo de diferentes etapas de maduración, desde 40 DIV hasta el punto de maduración más antiguo estudiado (250 DIV). Barras de escala = 25 μm (fila superior) y 100 μm (fila inferior). Abreviaturas: DIV = días in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el sitio apical de los organoides de la retina, algunos fotorreceptores maduran en bastones, que contienen rodopsina en los segmentos externos para detectar la visión monocromática en condiciones de poca luz, mientras que otros maduran en conos, que expresan opsinas azules, verdes y rojas y son responsables de la visión en color y de alta agudeza en condiciones de luz brillante. La Figura 5 (arriba) ilustra la población de fotorreceptores de cono dentro del organoide de la retina que expresaron opsinas azules y/o verdes/rojas (OPSINA B y GR, Tabla 1). Estas células exhiben una morfología alargada con las diferentes opsinas distribuidas por todo el cuerpo celular, excluyendo el núcleo. En particular, la punta exterior de estas células parece más brillante, potencialmente parecida al segmento exterior del fotorreceptor que contiene los discos. Para visualizar los conos azul y verde/rojo utilizando un solo canal para la detección de fluorescencia, los anticuerpos secundarios contra la opsina azul (OPSINA B, conejo) y la opsina verde/roja (OPSINA GR, pollo) se marcaron con el mismo fluoróforo, optimizando el uso del canal y agilizando el proceso de obtención de imágenes, al tiempo que se evitaba la superposición espectral. Un subconjunto de células fotorreceptoras en la Figura 5 (abajo) expresaron rodopsina (RHO, Tabla 1 y Video Suplementario S2), lo que indica inequívocamente su identidad como bastones. Estos bastones comparten la morfología alargada descrita anteriormente, con el núcleo situado en el centro y el cuerpo celular rico en opsina orientado hacia la periferia del organoide.

Figura 5: Organoides de la retina de etapas posteriores del desarrollo. Arriba: conos maduros, abajo: bastones. Proyección Z de imágenes confocales de organoides retinianos aclarados con FluoClear BABB teñidos con TUJ1 (neuronas), DRAQ5 (núcleos), opsina-B+GR (conos) y RHO (bastones). Los dibujos esquemáticos se muestran como referencia. Barras de escala = 100 μm (izquierda) y 10 μm (derecha). Abreviaturas: DIV = días in vitro; BABB = alcohol bencílico/benzoato de bencilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las células bipolares y su distribución espacio-temporal se identificaron mediante el seguimiento de la expresión de Chx10 (también conocida como Vsx2) a lo largo de 250 DIV de maduración (Figura 6). Chx10 (Tabla 1) es un factor de transcripción crítico para la proliferación de células progenitoras y la determinación de células bipolares en la retina en desarrollo^19,20. Como gen homeobox, se expresa en etapas tempranas de desarrollo en los neuroblastos, y en la retina madura, se encuentra exclusivamente en las células bipolares. La Figura 6 muestra la distribución de las células Chx10 positivas dentro del organoide en desarrollo. Inicialmente, se observan numerosas células Chx10 positivas que se extienden desde la periferia neurorretiniana hacia el centro. A medida que el organoide madura, estas células se vuelven menos abundantes y se trasladan al INL, donde residen las células bipolares.

Figura 6: Expresión de Chx10 sobre 250 DIV de maduración. Imágenes confocales de proyección Z de un organoide retiniano aclarado por FluoClear BABB teñido con DRAQ5 (núcleos) y Chx10 (neuroblastos y células bipolares maduras). Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: DIV = días in vitro; BABB = alcohol bencílico/benzoato de bencilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Finalmente, demostramos que la GFP endógena de los marcadores de calcio GCaMP se conserva después del aclaramiento con esta metodología. En la Figura 7, podemos observar la neurorretina de 70 organoides retinianos DIV infectados con Ad5-CMV-GCaMP6s e inmunomarcados con anti-GFP (Tabla 1) para mejorar la fluorescencia después de la fijación a largo plazo.

Figura 7: GCaMP endógeno conservado en el método de aclarado FluoClear BABB. Organoide retiniano de 70 DIV infectado con Ad5-CMV-GCaMP6s inmunomarcado con anti-GFP (células que expresan GCaMP), Chx10 (neuroblastos y células bipolares en estadio temprano) y DRAQ5 (núcleos). Barras de escala = 100 μm (izquierda) y 25 μm (derecha). Abreviaturas: BABB = alcohol bencílico/benzoato de bencilo; DIV = días in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video Suplementario S1: Reconstrucción 3D de un organoide de retina que presenta un ensamblaje de proyecciones neuronales. Proyección Z de imágenes confocales de organoides retinianos aclarados con FluoClear BABB a 250 DIV teñidos con TUJ1 (neuronas) representadas en púrpura y DRAQ5 (núcleos) en amarillo. Abreviaturas: BABB = alcohol bencílico/benzoato de bencilo; DIV = días in vitro. Haga clic aquí para descargar este video.

Video Suplementario S2: Reconstrucción 3D de los bastones alineados en la superficie de un organoide de la retina en etapas tardías de desarrollo (200 DIV). Proyección Z de imágenes confocales de organoides retinianos aclarados con FluoClear BABB a 200 DIV teñidos con RECOV (fotorreceptores) representados en verde y RHO (bastones) en púrpura. Abreviaturas: DIV = días in vitro; BABB = alcohol bencílico/benzoato de bencilo. Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

El protocolo aquí descrito facilita el estudio de la distribución espacio-temporal de las células que forman el organoide de la retina en diferentes etapas de maduración, preservando su arquitectura natural en 3D, un aspecto crítico para la comprensión de estos modelos en el contexto de la futura medicina personalizada. Proporciona una vista detallada de la arquitectura de la retina a nivel de distintas capas y tipos de células individuales, lo que permite la visualización de las estructuras subcelulares al tiempo que preserva el contexto 3D global.

La alternativa a la obtención de imágenes de montaje completo es el posprocesamiento de la muestra para realizar la obtención de imágenes en secciones convencionales (parafinadas o criopreservadas). Si bien el seccionamiento proporciona información valiosa sobre la localización de proteínas y estructuras, estos datos están restringidos a un solo plano, lo que limita la comprensión de las conexiones celulares espaciales. Como resultado, características como la proporción de conos y bastones o la formación de haces axonales en regiones específicas pueden no estar representadas con precisión, lo que complica la interpretación en tres dimensiones. Los organoides de la retina son muy heterogéneos, con diferentes regiones que pueden contener diferentes tipos de células y/o que presentan diversos grados de complejidad y diferenciación. Las imágenes de montaje completo resuelven este problema, ya que permiten analizar gradientes de heterogeneidad globalmente sin depender de la selección de un subconjunto de secciones que podrían no representar la totalidad de la muestra.

La microscopía de fluorescencia de lámina ligera (LSFM)21,22,23 podría utilizarse como alternativa a la microscopía confocal de barrido láser. En LSFM, la muestra se ilumina con una fina lámina de luz de unas pocas micras de grosor, y toda la fluorescencia generada por la sección óptica iluminada se detecta mediante una cámara. LSFM es una técnica de detección basada en campo amplio que representa una estrategia altamente eficiente para la visualización rápida de grandes volúmenes (muestras a escala de hasta centímetros) con efectos mínimos de fotoblanqueo y fototoxicidad. Sin embargo, los organoides pueden exhibir una aberración esférica significativa porque la luz que pasa a través de las superficies curvas se refracta de manera diferente según el ángulo de incidencia. En estos experimentos, esta distorsión produjo una pérdida de enfoque, lo que llevó a la borrosidad y comprometió la resolución de las estructuras más profundas. Para obtener imágenes de nuestros organoides retinianos (de aproximadamente 1 mm de diámetro), la microscopía confocal de barrido láser demostró ser el enfoque más efectivo.

Este protocolo se adapta a nuestros requisitos experimentales. Se puede utilizar como una guía inicial para los investigadores que se aventuran en la obtención de imágenes de montaje completo de organoides de retina ópticamente aclarados y debe adaptarse si difieren. En esta sección, se describen en detalle los pasos críticos, las modificaciones y las limitaciones de la metodología.

Un paso crítico es la decisión sobre el protocolo de compensación. Hay que tener en cuenta muchos criterios. En primer lugar, hay que tener en cuenta la tipología de la muestra. La limpieza de los huesos no es lo mismo que la limpieza del tejido cerebral, al igual que la limpieza de los organoides de la retina difiere de la limpieza de los organoides gástricos, ya que cada uno requiere un enfoque distinto. Para visualizar organoides aclarados de un tipo diferente, es fundamental revisar la literatura para identificar los protocolos que se han optimizado específicamente para la muestra de interés. La fructosa/glicerol es un método de limpieza rápido y no tóxico que ha demostrado ser útil para eliminar organoides derivados de diferentes tejidos (organoides de las vías respiratorias humanas, colon, riñón, hígado y tumores de mama, y organoides de la glándula mamaria de ratón)¹² pero no era adecuado para hacer transparentes los organoides de la retina humana. Hasta donde sabemos, ningún estudio informa de la aplicación de fructosa/glicerol al tejido neural/organoide. Por lo tanto, concluimos que este método de aclaración no es apropiado para aclarar los tejidos neurales. Se justifica una investigación más profunda para dilucidar las razones subyacentes de esta incompatibilidad.

Otro factor crítico a tener en cuenta es el campo de visión requerido, ya que afecta directamente a la estrategia de imagen y a la elección de los componentes ópticos. Los grandes campos de visión generalmente se logran con objetivos de bajo aumento, que a menudo están diseñados para su uso sin medios de inmersión (por ejemplo, aire, RI = 1.00). Estos objetivos experimentan un mayor desajuste de RI cuando se obtienen imágenes de muestras aclaradas por BABB (RI = 1,56), lo que provoca cambios en el enfoque de profundidad que deben corregirse durante el posprocesamiento. Por el contrario, los objetivos de inmersión en aceite (RI = 1,51) presentan menos desajuste de RI con soluciones de limpieza como BABB (RI = 1,56) y, por lo tanto, no requieren recalibración.

Los métodos de inmersión simples generalmente no logran una alta transparencia y no son adecuados para adquirir imágenes de alta calidad de muestras de montaje completo. Los protocolos de limpieza de tejidos influyen en la resolución efectiva a través de la hinchazón o la contracción de las muestras. Dependiendo del objetivo del experimento, la hinchazón o la contracción pueden ser beneficiosas. Los protocolos que amplían la muestra pueden mejorar la resolución de detalles finos en el mismo sistema óptico incapaz de mostrar los mismos detalles antes. La contracción puede ser deseable para visualizar muestras grandes que de otro modo no cabrían en la cámara de muestras o se ajustarían a las distancias de trabajo objetivo. Sin embargo, debido a que la contracción comprime la muestra y puede distorsionar las distancias internas, esta técnica no es adecuada para la evaluación dimensional o la medición precisa de distancias intercelulares.

Otro factor importante a tener en cuenta es la compatibilidad con las proteínas fluorescentes. La mayoría de los protocolos basados en solventes orgánicos apagan las proteínas fluorescentes, ya que requieren altas temperaturas, o degradan las proteínas fluorescentes mientras se incorporan con soluciones compatibles con RI. Afortunadamente, la mayoría de los métodos son compatibles con las técnicas de inmunomarcaje. Sin embargo, la compatibilidad de cada epítopo debe confirmarse experimentalmente.

Además, se puede obstruir la penetración de moléculas grandes de IgG a través del tejido, lo que disminuye la eficiencia de la tinción y limita la visualización de la estructura objetivo en la superficie de la muestra. La tinción de muestras enteras con anticuerpos puede llevar varios días (o incluso semanas), dependiendo del tamaño y la naturaleza de la muestra, lo que aumenta sustancialmente la duración del protocolo.

Por último, la compatibilidad con el instrumento óptico es obligatoria. La mayoría de los métodos basados en disolventes orgánicos (excepto ECi) son muy corrosivos y no son químicamente compatibles con las cámaras de muestras comerciales y los objetivos de inmersión. Además, algunas soluciones de limpieza tienen un IR que no coincide con el alcance requerido por los objetivos disponibles (generalmente agua).

Hay algunos pasos en el protocolo que necesitan atención especial. FluoClear BABB, como método de limpieza hidrofóbico, requiere un paso previo de deshidratación. El pH desempeña un papel importante en la preservación de la fluorescencia de proteínas endógenas como la GFP. Luego, es crucial asegurarse de que las soluciones de alcohol tengan el pH correctamente ajustado. La deshidratación es clave para una limpieza completa. Los resultados óptimos se logran incubando las muestras con un gradiente creciente de soluciones alcohólicas.

El tamaño de la muestra juega un papel importante para permitir que los anticuerpos alcancen sus objetivos específicos. Es posible que los anticuerpos no penetren de manera homogénea y queden retenidos en el exterior de la muestra. Si esto ocurre, considere cambiar a otro tipo de detergente (Tween-20 o Saponin), aumentando la concentración y el tiempo de incubación del detergente y los anticuerpos. Si estos ajustes son insuficientes, estrategias alternativas pueden mejorar la permeabilización de los anticuerpos. Para el inmunomarcaje de montaje completo de muestras grandes (escala centimétrica), los investigadores han descubierto que el SDS puede facilitar una penetración más profunda de los anticuerpos²⁴. El SDS induce una pérdida parcial de la estructura terciaria de los anticuerpos, linealizando eficazmente la proteína y permitiéndole penetrar más profundamente en el tejido. Luego, el lavado de la SDS restaura las propiedades de unión al antígeno de los anticuerpos, lo que permite una tinción más uniforme de los tejidos más gruesos y reduce el gradiente comúnmente observado de etiquetado más fuerte en la superficie de la muestra.

La preparación de sus propios anticuerpos secundarios fluorescentes ofrece varias ventajas, ya que proporciona una mayor flexibilidad en el diseño del inmunomarcaje, lo que permite la selección de la combinación específica de fluoróforo-anticuerpo secundario, aumentando el número de colores que se pueden utilizar en la misma muestra. Además, se puede ajustar la relación entre fluoróforos y anticuerpos, por lo que generalmente son más brillantes. Sin embargo, hay que tener en cuenta algunos aspectos. Los anticuerpos secundarios hechos a medida son generalmente menos estables que los disponibles comercialmente y deben usarse frescos. La mayoría conserva su afinidad con el ligando durante 3-6 meses a 4 °C, pero la estabilidad debe determinarse experimentalmente, ya que algunas combinaciones podrían degradarse más rápidamente. Además, algunos emparejamientos anticuerpo-fluoróforo pueden alterar la afinidad del anticuerpo por su epítopo, lo que da lugar a un marcaje inespecífico parcial o completo. Para garantizar la fiabilidad, es aconsejable probar primero los anticuerpos secundarios hechos a medida utilizando controles, como células en cultivo, antes de aplicarlos a las muestras experimentales.

Este protocolo optimizado integra el aclaramiento óptico con el inmunomarcaje para facilitar la obtención de imágenes confocales de organoides de retina de montaje completo. Preserva la integridad estructural y permite la identificación de tipos clave de células de la retina dentro del organoide. Por lo tanto, el protocolo proporciona a los investigadores una poderosa herramienta para investigar la maduración de los organoides de la retina y la organización espacial.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 objetivos NA0.40 DRY	Leica	HC PL APO CS2	-
63x Objetivo NA1.40 OIL	Leica	HC PL APO CS2	-
anticuerpo anti-GFP	Abcam	AB13970	-
Alcohol bencílico (BA)	Sigma Aldrich	13162	-
Benzoato de bencilo (BB)	Sigma Aldrich	W213802	-
placa de Petri de vidrio inferior	MatTek	P35G-1.5-14-C	-
Albúmina de suero bovino (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	-
Anticuerpo Chx10	Sta Cruz Biotech	SC-365519	-
Columnas de filtración en gel Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25	Sigma Aldrich	17-0853-02	-
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	-
DMSO	Sigma Aldrich	D8418	-
DRAQ5	Termopescador	62251	-
Colorante (ácido carboxílico, éster de succinimida)	Invitrogen o Abberior	-	-
ImagenJ/Fiji	NIH	v1.50i	-
Microscopio de barrido láser confocal invertido	Microsistemas Leica	TCS SP8 STED 3X-FALCON	-
Software de procesamiento 3D LAS X	Microsistemas Leica	-	-
mQ H2O	-	-	Agua ultrapura del sistema de purificación de agua Synergy
NaHCO3	Acros Organics	424270010	-
IgG secundaria no marcada	Inmunoinvestigación de Jackson	-	-
Anticuerpo azul opsina	Millipore	AB5407	-
Anticuerpo Opsina RG	Millipore	AB5745	-
Paraformaldehído (PFA) 4%	Thermo scientific	J199943-K2	-
Solución PBS	Gibco	18912-014	-
Sondas de marcaje de faloidina	Termopescador	-	-
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010023	-
Anticuerpo RECOV	Millipore	AB5585-I	-
Anticuerpo RHO (RET-P1)	Sigma Aldrich	O4886	-
Citrato de sodio tribásico dihidrato	Sigma Aldrich	C8532	-
Tritón X-100	Sigma Aldrich	T8787	-
Anticuerpo TUJ1	Covance	MMS-435P	-