Method Article

Microscopía electrónica de transmisión como técnica de visualización para el análisis de la plasticidad sináptica circadiana en la corteza del barril del ratón

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo presentado describe el uso de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para cuantificar los cambios circadianos en la corteza del barril del ratón, centrándose principalmente en el número de sinapsis y la morfología de la columna dendrítica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Examinar la plasticidad sináptica circadiana requiere alojar ratones en diferentes condiciones de iluminación (ciclo de luz / oscuridad, LD 12: 12 y oscuridad constante, DD), proporcionar acceso a las ruedas en funcionamiento y sacrificarlas en cuatro puntos de tiempo definidos dentro de las 24 h: al comienzo y a la mitad del día / día subjetivo y al comienzo y a la mitad de la noche / noche subjetiva. Luego, los cerebros se fijan adecuadamente para la microscopía electrónica de transmisión (TEM). La corteza del barril, con su organización somatotópica precisa, proporciona un modelo ideal para dicho análisis. Para obtener el área cerebral requerida, los cerebros se cortan tangencialmente con un vibratomo y, a continuación, se seleccionan secciones que contienen la corteza del barril y se incrustan en resina Polybed. De los bloques preparados que contienen los barriles seleccionados, se cortan secciones ultrafinas consecutivas. La densidad sináptica, excitadora e inhibitoria, se analiza a partir de micrografías electrónicas utilizando el método de disector estereológico. Además, las imágenes TEM se utilizan para reconstrucciones 3D de espinas dendríticas. Los cambios en la forma de las espinas dendríticas indican la remodelación de las neuronas durante el día. El número de sinapsis excitadoras alcanza su punto máximo durante el sueño (día) en ratones, mientras que las sinapsis inhibitorias alcanzan su punto máximo durante su fase de actividad (en medio de la noche).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los ritmos circadianos son generados por los relojes circadianos en casi todos los procesos de un organismo. En animales y humanos, se han detectado a nivel molecular, celular y de todo el organismo, así como en su comportamiento. El sistema circadiano de un organismo consta del reloj circadiano principal (marcapasos) y los relojes periféricos. Todos los relojes circadianos generan oscilaciones circadianas a través de la expresión cíclica de los genes del reloj, que están controlados por sus proteínas. El mecanismo molecular del reloj genera ritmos circadianos con un período de ~ 1 día (más o menos de 24 h), pero en condiciones de día / noche, el período de ritmos endógenos se sincroniza con 24 h. Se han detectado muchos ritmos circadianos en la fisiología del sistema nervioso de invertebrados y vertebrados; Sin embargo, algunos estudios han demostrado que también están presentes en la plasticidad sináptica y neuronal, es decir, cambios en el número y estructura de sinapsis y dendritas 1,2,3,4.

La corteza somatosensorial del ratón proporciona un sitio excelente para estudiar la plasticidad sináptica a lo largo del día debido a su organización bien definida y su vínculo directo con la actividad locomotora animal 5,6,7,8,9. En la capa IV de la corteza somatosensorial, hay distintas estructuras neuronales (barriles) que son muy notables incluso en un cerebro no teñido 10,11. Su disposición refleja la morfología y organización de los bigotes en el hocico del animal, lo que permite el mapeo preciso de los estímulos sensoriales. Los barriles grandes están organizados en cinco filas regulares, cada una de las cuales contiene entre cuatro y siete barriles. Las filas de barriles que corresponden a grandes bigotes están marcadas con letras mayúsculas de la A a la E y representan los bigotes dispuestos desde el área de los ojos hacia abajo a lo largo del hocico. Cada barril consta de dos áreas principales: el hueco, la parte central llena de neuropilo, y la pared llamada lateral, que está dominada por los cuerpos de las células estrelladas. Los barriles están separados entre sí por áreas de menor densidad celular, llamadas septos. Cada barril recibe impulsos de un bigote específico ubicado en el lado contralateral del hocico del animal10,12.

La división en barricas específicas, dispuestas en filas regulares, permite una identificación rápida y fácil del área seleccionada10,13. La selección de barriles de la fila B para el análisis de los cambios circadianos se basa en estudios de plasticidad dependiente de la actividad 14,15,16,17. La fila B se caracteriza por límites somatotópicos bien definidos y contiene solo cuatro barriles grandes distintos, lo que simplifica su ubicación en las muestras. Debido a su posición central, la actividad neuronal de la fila B se correlaciona con comportamientos naturales del ratón, como la exploración ambiental y la actividad locomotora. Para contar sinapsis en espinas y ejes dendríticos, es importante seleccionar las partes centrales de los barriles, donde los cuerpos celulares son escasos 12,15,18.

La inmunohistoquímica combinada con imágenes de microscopía confocal es una técnica que ha desempeñado un papel crucial en la aclaración de los mecanismos clave de la plasticidad sináptica en ratones. Si bien el uso de microscopía confocal proporciona imágenes de alta resolución con una fluorescencia de fondo reducida y una claridad mejorada de la estructura celular, sufre de fotoblanqueo y requiere una preparación de muestra compleja, lo que puede cambiar el estado de los tejidos biológicos. Su dependencia de marcadores fluorescentes puede limitar los tipos de proteínas que se pueden estudiar simultáneamente debido a su superposición. La microscopía de inmunofluorescencia confocal proporciona un medio para etiquetar proteínas específicas, sus niveles de expresión y localización asociada con la actividad sináptica mediante el uso de anticuerpos para detectar antígenos diana en secciones de tejido fijas. Aunque este método ofrece especificidad y flexibilidad para estudiar varias proteínas involucradas en la neurotransmisión, está limitado por su incapacidad para proporcionar datos en tiempo real sobre procesos dinámicos debido al paso de fijación involucrado. La inconsistencia en la unión de anticuerpos también podría resultar en resultados poco confiables 19,20,21.

El uso de microscopía electrónica en lugar de métodos de inmunofluorescencia con microscopía óptica permite una resolución significativamente mayor y una mayor precisión tanto en la selección de localización como en la distinción de estructuras neuronales. Las secciones de microscopía electrónica de transmisión en serie (TEM) ayudan a visualizar la estructura sináptica a nivel ultraestructural y tienen la ventaja de ser utilizadas para estudiar la formación o eliminación de sinapsis. TEM permite a los investigadores analizar las propiedades físicas de las sinapsis y los cambios en la densidad y estructura que se denominan plasticidad de las sinapsis. Aunque la preparación de muestras y las imágenes requieren mucha mano de obra, TEM proporciona una comprensión más detallada de los cambios que ocurren durante el aprendizaje, la formación de la memoria y el procesamiento de la información sensorial, y durante el día, el año y la edad del animal.

Nuestro método tiene como objetivo investigar la dinámica circadiana de la densidad y morfología sináptica mediante el uso de un enfoque mínimo basado en cuatro puntos de tiempo combinado con el método de disector estereológico basado en imágenes TEM en serie. El método de disector estereológico permite una estimación confiable de los números de sinapsis incluso cuando se usan solo unas pocas secciones seriadas ultradelgadas 22,23,24,25,26. La organización somatotópica bien definida de la corteza del barril garantiza una selección anatómica precisa de las ubicaciones de estudio, mientras que la TEM en serie permite la diferenciación de los tipos de sinapsis (excitatorias e inhibidoras) y sus ubicaciones (en espinas y ejes dendríticos). Este método proporciona una herramienta valiosa para los investigadores que investigan la neuroplasticidad diurna y circadiana, lo que permite explorar cómo los factores ambientales e internos influyen en la dinámica sináptica. Los componentes individuales de nuestro método permiten su aplicación para el análisis de los cambios de neuroplasticidad en una gama mucho más amplia de estudios, no necesariamente limitados a los cambios relacionados con el circadiano.

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Protocol

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Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de ética institucional correspondiente y se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos, así como con la normativa nacional. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados.

1. Preparación de tejidos cerebrales

  1. Sacrifique ratones en cuatro puntos de tiempo diferentes cada 6 h durante un ciclo de 24 h, tanto en condiciones de luz / oscuridad (LD 12: 12) como de oscuridad constante (DD) (Figura 1). En condiciones LD 12:12, consulte Zeitgeber Time (ZT), donde ZT0 corresponde al comienzo de la fase de luz y ZT12 al comienzo de la fase oscura. En la oscuridad constante, consulte el tiempo circadiano (CT), donde CT0 representa el comienzo del día subjetivo y CT12 denota el comienzo de la noche subjetiva.
    NOTA: Los puntos de tiempo son ZT0/CT0 (inicio del día, día subjetivo), ZT6/CT6 (medio día, día subjetivo), ZT12/CT12 (comienzo de la noche, noche subjetiva) y ZT18/CT18 (mitad de la noche, noche subjetiva).
  2. Perfundir y fijar cerebros de ratón con glutaraldehído al 2,5% y paraformaldehído al 2% en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4).
  3. Retire cada cerebro del cráneo y déjelo en una solución fijadora (glutaraldehído al 2,5% y paraformaldehído al 2% en tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,4) durante 24 h a 4 °C.
  4. Para preparar el cerebro para la sección, corte el cerebelo y divida el cerebro en dos hemisferios (Figura 2A, B).
  5. Elija un hemisferio (derecho o izquierdo) y oriéntelo de modo que las secciones se corten tangencialmente a la corteza del barril. Monte el hemisferio seleccionado en el mandril de vibratomo y péguelo firmemente (Figura 2C).
  6. Corte secciones con un espesor de 60 μm (velocidad de la sección de vibratomo: 7,10 y frecuencia: 5,00) (Figura 2D) y luego transfiera las secciones a la mezcla de tampón de fosfato 0,1 M y solución fijadora (proporción 1:5).
  7. Examine las secciones bajo un microscopio óptico con un aumento de 4x y recolecte solo aquellas con la corteza del campo de barril visible para el siguiente paso (Figura 2E). Utilice el portaobjetos cóncavo para asegurarse de que la sección permanezca constantemente en líquido.

2. Fijación y seccionamiento cerebral

  1. Use un pincel y transfiera suavemente los pañuelos a una pequeña placa de Petri de vidrio. A continuación, enjuague las secciones cerebrales en el tampón de cacodilato 0,1 M (BC, pH 7,4) durante 3 x 5 min.
  2. Fijar secciones en tetróxido de osmio al 1% (OsO4) en 0,1 M BC con ferricianuro de potasio al 1,5% y dejar a +4 °C durante 1 h.
    NOTA: Prepare la solución de OsO4 inmediatamente antes de usarla, ya que OsO4 es inestable y su actividad disminuye con el tiempo.
  3. Secciones posteriores a la fijación en OsO4 al 1% en solución 0,1 M BC durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Realice todos estos pasos con guantes protectores y debajo de la campana extractora con ventilación que funcione bien, ya que el OsO4 es muy tóxico.
    Los desechos deben guardarse en una botella separada con una tapa hermética. No permita que el producto entre en los desagües.
  4. Después de la fijación, enjuague las secciones en agua destilada durante 2 x 5 min.
  5. En el siguiente paso, incube secciones cerebrales durante 40 min en la solución de etanol al 70% que contiene acetato de uranilo al 1%. Después de mezclar, use una jeringa con filtro (25 mm) y vierta lentamente 2 ml de la solución en cada placa de Petri con los pañuelos.
  6. Deshidratar los tejidos en concentraciones ascendentes de alcohol: etanol al 70%, 80% y 90% durante 5 min cada uno y etanol al 100%, 3 x 5 min cada uno.
    NOTA: Es posible dejar los tejidos en etanol al 70% durante la noche a +4 °C.
  7. Lave los pañuelos en óxido de propileno 2 x 10 min.
    NOTA: El óxido de propileno es un químico altamente corrosivo; Úselo con precaución mientras usa guantes protectores y trabaja debajo de la campana extractora. Usar un recipiente de vidrio (placa de Petri de vidrio) es crucial para este paso.
    El óxido de propileno es un líquido y vapor extremadamente inflamable. Los residuos deben guardarse en un recipiente de vidrio separado y herméticamente cerrado. No permita que el producto entre en los desagües; existe riesgo de explosión.
  8. Reemplace el óxido de propileno con una mezcla de resina Polybed y óxido de propileno (proporción 1: 1). Vierta al menos 2 ml de la solución en cada placa de Petri con las secciones, cubra con una tapa e incube durante 40 min.
  9. Finalmente, incruste secciones cerebrales en la mezcla de resina Polybed y óxido de propileno (proporción 3: 1). Utilizar al menos 2 ml de la mezcla por placa de Petri, tapar y dejar actuar durante 1,5 h.
    NOTA: Asegúrese de que los pañuelos estén completamente sumergidos y asegúrese de que no floten sobre el líquido.
  10. Corta la película Aclar en trozos del tamaño de un portaobjetos de vidrio. Con una pipeta de plástico, aplique un pequeño volumen de resina sobre la película Aclar y transfiera las secciones cerebrales de la placa de Petri a la resina con un pincel. Incrustar cada sección entre dos películas Aclar e incubar durante 48 h en un horno a 65 °C para polimerizar.

3. Imágenes y secciones de la corteza del barril

  1. Fotografíe secciones cerebrales con un aumento objetivo de 2x con un microscopio óptico (Figura 2F).
  2. Recopile todas las imágenes e impórtelas a un software de gráficos.
    1. Para abrir imágenes, haga clic en Archivo |Abra y seleccione las imágenes con Mayús |Abierto. Las imágenes se abrirán en ventanas separadas.
    2. Comience a apilar imágenes desde la corteza (la pieza más pequeña) y continúe hasta que todas las secciones estén correctamente alineadas.
    3. Haga clic con el botón derecho en la capa 1 |Duplicar capa en cada imagen. En el cuadro de diálogo, introduzca el número de imagen como nombre, elija una imagen como archivo de destino y haga clic en Aceptar. Repita estos pasos para todas las imágenes, duplicándolas en el mismo archivo de destino.
    4. Alinee las imágenes para reconstruir el campo del barril, asegurando el orden anatómico adecuado. Utilice la herramienta Mover para colocar cada capa manualmente y, a continuación, haga clic en Editar |Transformar |Rotar o Voltear para ajustar la orientación si es necesario. Para ajustar la alineación, utilice Edición | Transformar | Distorsione y mueva las esquinas de la imagen para que coincidan con las estructuras anatómicas de forma independiente. Para facilitar la alineación, establezca el modo de fusión de la capa superior en Superposición en el panel Capas .
    5. Compare puntos de referencia anatómicos, como los contornos de los barriles y los vasos sanguíneos, para garantizar un posicionamiento correcto. Para guardar la pila, haga clic en Archivo |Guardar como, asigne un nombre al archivo y elija su formato (PSD o TIFF); luego, haga clic en Aceptar.
  3. Revise las múltiples secciones que contienen el campo de barriles secuencialmente, identificando los barriles visibles en cada sección.
  4. Delinee manualmente cada barril visible en una capa común adicional, asegurando la reconstrucción de todo el campo de barriles. Para crear una capa adicional, haga clic en Capa |Nuevo |Capa, asigne un nombre a la capa y haga clic en Aceptar. Selecciona la herramienta Pincel de la barra de herramientas y en la nueva capa, dibuja manualmente cada barril visible.
    1. Para una mayor precisión, use el zoom y ajuste el tamaño del pincel según sea necesario. Para acercar y alejar la imagen, use la herramienta Zoom o presione Ctrl + "+" / Ctrl + "-". Para cambiar el tamaño del pincel, haz clic derecho en el lienzo mientras la herramienta Pincel está activa y mueve el control deslizante Tamaño .
  5. Identifique el barril seleccionado en función de esta reconstrucción.
  6. Encuentre el barril seleccionado bajo el microscopio óptico según el patrón del campo de barril (cinco filas, cada una con cuatro a siete barriles) y la disposición de los vasos sanguíneos que indican su ubicación dentro del campo de barril.
  7. En cada sección con una corteza de barril visible, identifique el barril seleccionado bajo un microscopio estereoscópico y córtelo junto con el adyacente con una cuchilla de afeitar.
  8. Retire la pieza pequeña de la sección, péguela en un bloque de resina y déjela secar. Más tarde, recorta el exceso de resina que rodea el tejido.
    NOTA: Asegúrese de colocar el trozo de tejido plano sobre la superficie de la resina.
  9. Use un ultramicrotomo y un cuchillo de diamante para cortar secciones consecutivas ultrafinas (3-6 secciones, 65 nm de espesor) (Figura 3A) y recoja en rejillas de níquel de una sola ranura recubiertas de forma (2 x 0,75 mm).
  10. Una vez seco, contrastar las muestras con acetato de uranilo al 2% durante 3 min y citrato de plomo al 0,03% durante 1,5 min.
    NOTA: Por el contrario, es importante lavar las rejillas varias veces y dejarlas secar por completo después de cada paso. Use jeringas con filtros para acetato de uranilo y citrato de plomo.
  11. Tome imágenes consecutivas desde el hueco del barril seleccionado (por ejemplo, B2) bajo un TEM (voltaje de aceleración de 80 kV con aumentos de 4K u 8K, según el área y el volumen necesarios para el análisis.
    NOTA: Por lo general, se analiza al menos un volumen total de 100 μm3 por animal.

4. Análisis de imágenes

NOTA: La creación y alineación de pilas de imágenes TEM se puede hacer de la misma manera utilizando software libre (como GIMP) y comercial (por ejemplo, Photoshop). Las reconstrucciones también se pueden realizar de la misma manera utilizando software comercial (por ejemplo, 3D Studio Max) y programas completamente gratuitos, como Blender.

  1. Para estimar la densidad de las sinapsis, apile un mínimo de tres imágenes TEM en el software gráfico (Figura 6). Cuanto mayor sea el número de imágenes en serie, mayor será la precisión de los cálculos.
    1. Para abrir imágenes, haga clic en Archivo |Abra y seleccione las imágenes con Mayús |Abierto; Las imágenes se abrirán en ventanas separadas.
    2. Para cada imagen, haga clic con el botón derecho en Capa 1 |Duplicar capa. En el cuadro de diálogo, introduzca el número de imagen como nombre, elija una imagen como destino y haga clic en Aceptar. Repita los mismos pasos para todas las imágenes y duplíquelas en el mismo destino.
    3. Para guardar la pila, haga clic en Archivo |Guardar como, asigne un nombre al archivo, elija su formato (PSD o TIFF) y haga clic en Aceptar.
  2. Para alinear imágenes TEM, seleccione la capa de imagen superior y establezca el modo de fusión en Superposición en el panel Capas . Usar Editar |Transformar |Gire o la herramienta Voltear para ajustar la orientación de la imagen. Utilice la herramienta Mover para alinear estructuras.
    1. Para realizar ajustes más precisos, utilice Edición |Transformar | Distorsionar para mover las esquinas de la imagen de forma independiente. Para aumentar la precisión, mantenga presionada la tecla Ctrl y arrastre puntos de esquina individuales. Utilice cambios en el tamaño y la forma de las mitocondrias y las vainas de mielina axonal entre imágenes TEM sucesivas para verificar la secuencia correcta de las imágenes.
  3. Utilice un método de disector para contar las sinapsis.
    1. Agregue una capa a la pila de imágenes EM haciendo clic en Capa |Nuevo |Capa |De acuerdo. Asegúrese de que la nueva capa sea transparente (sin relleno de fondo).
    2. Para definir el área de análisis, haga clic en Capa |Nuevo |Capa |De acuerdo; luego selecciona la herramienta Rectángulo , ve a Capa |Estilo de capa |Trazo, defina el color, el grosor (Tamaño) y la posición del trazo (Se recomienda Dentro), haga clic en Aceptar y dibuje un rectángulo. Seleccione Relleno: 0%. Marque todas las sinapsis presentes en las imágenes TEM que no crucen dos bordes seleccionados adyacentes del rectángulo (por ejemplo, la derecha y la parte inferior o la parte superior e izquierda).
    3. Agregue una nueva capa para anotaciones haciendo clic en Capa |Nuevo |Capa |De acuerdo. Usa la herramienta Pincel para marcar sinapsis en la nueva capa. Utilice la herramienta Zoom y la herramienta Mano para marcar con precisión.
    4. Elija un color para marcar las sinapsis excitatorias y otro diferente para las sinapsis inhibitorias. Para cambiar el color, haga clic en el cuadro de color de primer plano en la barra de herramientas, seleccione un color en la ventana Selector de color y haga clic en Aceptar.
  4. Si las imágenes TEM contienen estructuras grandes (p. ej., fibras nerviosas mielinizadas, dendritas grandes o partes del cuerpo celular), use una cuadrícula con varios cuadrados. Esto permite excluir cualquier plaza que esté completamente ocupada por grandes estructuras.
    1. Agregue una nueva capa transparente haciendo clic en Capa |Nuevo |Capa |De acuerdo. Habilite la vista de cuadrícula haciendo clic en Ver |Mostrar |Cuadrícula y habilite el ajuste a la cuadrícula haciendo clic en Ver |Ajustar a |Cuadrícula.
    2. Establezca el espaciado de la cuadrícula haciendo clic en Editar |Preferencias |Guías, cuadrícula y cortes. Selecciona la herramienta Línea , establece el modo en Forma o Píxeles, establece el grosor de la línea (por ejemplo, 1 px) y dibuja líneas verticales y horizontales a lo largo de la cuadrícula visible para cubrir toda el área de la imagen.
  5. Defina las secciones "superior" e "inferior" para cada pila de imágenes. Cuente solo las sinapsis que están ausentes en la última imagen pero presentes en las imágenes anteriores. Esto permite una identificación precisa de las sinapsis sin sobreestimar su número.
  6. Utilice la escala de la imagen y calcule el volumen de la muestra (pila de imágenes TEM). Mida el área donde se cuentan las sinapsis y multiplíquela por el número de imágenes TEM en la pila y el grosor de las secciones ultradelgadas.
  7. Divida el número de sinapsis por volumen para determinar la densidad de sinapsis por unidad de volumen.
  8. Utilice todas las imágenes TEM que contengan una columna dendrítica (generalmente 10-12 micrografías electrónicas consecutivas) para reconstruir una columna dendrítica y las sinapsis que forma.
    1. Abra la pila de imágenes en el software de gráficos. Selecciona la herramienta Recortar , marca el área que contiene la espina dorsal dendrítica en la pila y presiona Enter. El área seleccionada se recortará en todas las capas visibles. Haz visible solo una a la vez, oculta otras capas usando el icono del ojo en el Panel Capas .
    2. Guarde cada imagen recortada por separado haciendo clic en Archivo |Guardar como, asigne un nombre al archivo, elija un formato (se recomienda JPG) y haga clic en Aceptar. Repita para cada capa de la pila.
      NOTA: Antes de transferir las imágenes a un software de reconstrucción 3D, lo mejor es marcar primero con colores los elementos que se están reconstruyendo.
    3. Agregue una nueva capa para la anotación haciendo clic en Capa | Nuevo |Capa | De acuerdo.
    4. Establece la opacidad de la capa en 30-50% en el Panel de capas .
    5. Selecciona la herramienta Pincel , elige un color diferente para cada estructura (por ejemplo, columna dendrítica, sinapsis) y marca los elementos. Trabaje solo en la nueva capa para conservar la imagen original. Cuando termine, combine la capa de anotación con la imagen, haga clic con el botón derecho en la capa superior y combine hacia abajo. Repita estos pasos para cada imagen TEM que contenga una sección transversal de la columna dendrítica.
  9. Transfiera las imágenes TEM con secciones transversales visibles de la columna dendrítica al software de reconstrucción 3D. Para eliminar el objeto Cube predeterminado, haga clic con el botón derecho en el objeto y elimínelo. Para alinear la perspectiva de la ventana gráfica antes de cargar imágenes, haga clic en Z en el gizmo de navegación o presione el teclado numérico 7. Para subir imágenes, haz clic en Añadir |Imagen |Referencia, seleccione la primera imagen y haga doble clic en ella para confirmar. Repita para cada imagen, asegurándose de que la perspectiva de la ventana gráfica permanezca consistente en todo momento.1
    NOTA: Para rotar la vista, mantenga presionado el botón central del mouse y mueva el mouse o use el gizmo de navegación. Para desplazarse por la vista, mantenga presionada la tecla Mayús + botón central del mouse, mueva el mouse o use Mover la vista.
  10. Organice las imágenes TEM a la distancia adecuada, teniendo en cuenta el grosor de las secciones ultrafinas (Figura 4A). Para colocar la última imagen TEM a lo largo del eje Z, haga clic en la imagen, haga clic en Propiedades del objeto (barra lateral derecha) e introduzca el valor en Ubicación Z. Las imágenes ahora se pueden distribuir entre la primera y la última imagen. Para distribuirlas, seleccione todas las imágenes, presione N para abrir el panel N y haga clic en la pestaña Editar (en el panel N) | Dist Z.
    NOTA: Antes de realizar cualquier ajuste, alinee la perspectiva de la ventana gráfica y haga clic en Z en el gizmo de navegación o presione el teclado numérico 7.
    La herramienta Distribuir debe estar habilitada para distribuir las imágenes. Para activarlo, ve a Editar | Preferencias | Obtenga extensiones, busque "Distribuir" y haga clic en Instalar. Una vez habilitada, la herramienta Distribuir permanece activa en todas las sesiones y no es necesario reactivarla, siempre que se utilice la misma versión del programa.
  11. Delinee manualmente la forma de la columna dendrítica en cada imagen usando una sola curva por imagen TEM (Figura 4B, C).
    1. Asegúrese de que solo la primera imagen TEM sea visible. En la colección de escenas, oculte todos los demás objetos con el icono del ojo . Para crear una curva base para el contorno, haga clic en Agregar |Curva |Círculo. Mueva el objeto BézierCircle, mantenga presionado G, mueva el mouse y haga clic para aceptar los cambios.
    2. Para que coincida con el tamaño del perfil de la columna dendrítica, escale el objeto, mantenga presionada la tecla S, mueva el mouse y haga clic. Ingrese a la pestaña Modelado con el objeto BézierCircle seleccionado. Alinee la perspectiva de la ventana gráfica nuevamente y haga clic en Z en el Gizmo de navegación o presione el teclado numérico 7.
    3. Para ajustar la forma de la curva, seleccione un punto de control, mantenga pulsado G, mueva el ratón y haga clic.
    4. Para ajustar la dirección y la fuerza de los controladores, seleccione un punto de control, presione G para mover o S para escalar y haga clic para confirmar. Repita para cada punto.
    5. Para agregar un nuevo punto de control, seleccione dos puntos de control existentes, mantenga presionada la tecla Mayús y haga clic en cada punto, haga clic con el botón derecho y seleccione Subdividir. Cuando la curva se corresponda suficientemente con el límite del perfil de la columna dendrítica, ingrese a la pestaña Diseño , haga clic con el botón derecho en el objeto BézierCircle y en el objeto Duplicate, y haga clic sin mover el mouse. Cree el mismo número de copias de BézierCircle que las imágenes TEM utilizadas para la reconstrucción. Alinéelos con las imágenes TEM organizadas usando la herramienta Distribuir como en el paso 4.10.
    6. Ajuste cada curva de BézierCircle en la pestaña Modelado para que coincida con el perfil de la columna dendrítica en cada imagen. Asegúrese de que solo el objeto BézierCircle editado actualmente y la imagen TEM correspondiente estén visibles a la vez.
      NOTA: Todas las acciones de clic con el botón derecho necesarias para ciertos pasos deben realizarse dentro de los límites de la escena. Las curvas sucesivas deben corresponder a los límites de las secciones consecutivas de la columna dendrítica y contener el mismo número de puntos de control.
  12. Conecte líneas adyacentes usando la función de reconstrucción 3D para formar una superficie continua y crear la forma 3D final (Figura 4D).
    1. Asegúrese de que solo los objetos BézierCircle estén visibles. En la colección de escenas, oculta todos los demás objetos con el icono del ojo en la barra lateral.
    2. Para crear el objeto de columna dendrítica, vaya a la pestaña Diseño , seleccione todos los objetos BézierCircle, haga clic con el botón derecho y haga clic en Unir. Convierta el objeto unido en una malla haciendo clic con el botón derecho y seleccionando Convertir en |Malla.
    3. Para conectar las aristas del objeto unido, introduzca la ficha Modelado , pulse 2 para entrar en el modo de selección de aristas |Seleccionar |Todo | clic derecho |Bucles de borde de puente.
    4. Para rellenar el espacio en la parte superior del objeto, anule la selección haciendo clic en junto al objeto, mantenga presionada la tecla Alt y haga clic en una sección de borde de la repisa superior, haga clic con el botón derecho, seleccione Extruir bordes, arrastre hacia arriba en el eje Z, presione S y mueva el mouse para reducir el nuevo bucle de borde, haga clic para aceptar el cambio. Mientras el nuevo bucle de aristas sigue seleccionado, haga clic con el botón derecho y seleccione Nueva cara en Aristas. Rellene el espacio inferior con el mismo método.
    5. Para suavizar el objeto, ingrese a la pestaña Diseño , haga clic con el botón derecho y seleccione Suavizar sombreado. Para suavizar aún más la forma, ve a Modificadores (barra lateral derecha) |Agregar modificador |Generar |Superficie de subdivisión. Establezca los niveles de Ventana gráfica y Renderizado en el mismo valor (recomendado 1).
  13. Repita los pasos 4.11-4.12 para la reconstrucción de sinapsis (Figura 4E, F).
  14. Asigne un color a cada estructura y use la función de renderizado para preparar la imagen final (Figura 4G, H). Vaya al menú Sombreado de la ventana gráfica y seleccione Renderizado para obtener una vista previa de los cambios de material. Seleccione el objeto que desea colorear y haga clic en Material (barra lateral derecha) |Nuevo |ajustar el color base.
    1. Para refinar la apariencia del material, ajuste los controles deslizantes Rugosidad o Metálico según sea necesario. Utilice este método para asignar un color distinto a cada estructura.
    2. Para ajustar la iluminación de la escena, haga clic en el objeto Luz, mantenga presionado G y mueva el mouse para reposicionarlo. Para cambiar la intensidad de la luz, ve a Datos (barra lateral derecha) y ajusta el valor de Potencia .
    3. Para colocar la cámara, oriente la ventana gráfica para que mire hacia el lomo reconstruido como debería aparecer en la imagen final, presione Ctrl + Alt + Teclado numérico 0. Seleccione el marco de la cámara visible, mantenga presionado G y mueva el mouse para reposicionarlo si es necesario.
    4. Para prepararse para el renderizado, vaya a Salida (barra lateral derecha), cambie los valores de Resolución X e Y para que coincidan con la imagen deseada. Para mejorar la calidad de la imagen, vaya a Renderizar (barra lateral derecha) |Renderizar, ajuste el valor de Samples entre 120 y 250. Para un fondo transparente, vaya a Renderizar |Película |marque Transparente. Para renderizar la imagen, pulse F12 o vaya a Renderizar (menú superior) |Renderizar imagen.

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Results

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Para aplicar correctamente nuestro método al análisis de los cambios sinápticos circadianos, es necesario comenzar seleccionando al menos cuatro puntos de tiempo a intervalos iguales, con dos puntos para cada fase de la actividad de los animales (cada 6 h). En estos puntos de tiempo designados, los animales son sacrificados y sus cerebros son recolectados. Este enfoque permite identificar patrones diarios o circadianos de plasticidad sináptica y los vincula a cambios en la actividad locomotora de los animales (

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Discussion

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Aquí, presentamos la metodología utilizada para estudiar la plasticidad circadiana de las sinapsis y la reconstrucción de espinas dendríticas en la corteza del barril de ratones. Para garantizar resultados confiables, el estudio de plasticidad circadiana debe incluir al menos cuatro puntos de tiempo. Nuestra investigación mostró que los datos de dos puntos de tiempo, uno durante la fase de descanso (día) y otro durante la fase de actividad (noche), proporcionaron información sobre las di...

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Disclosures

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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgements

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Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones del Centro Nacional de Ciencias de Polonia, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 a EP y la Facultad de Medicina de la Universidad Jagellónica, nr N41/DBS/001129 a MJ.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Película AclarAgar científicoAGL4458
Software Blender Versión: v. 2.91.2
Ácido cacodílico, sal sódica trihidratoPoliciencias01131-100
Deslizamiento cóncavoMenzel9.161 151
Cuchillo de diamante Diatome15-Estados UnidosÁngulo de la cuchilla: Ultra 45°  
Cámara digital Nikon DXM 1200 F
Hidrogenofosfato de Sodio DodecahidratoPOCH799280115
Incrustación de resinaPoliciencias08792-1Formulación Luft 
EtanolPol-AuraPA-11-0004
Software GIMPVersión: v 3.0.4
Citrato de plomoTAABL018
Microscopía óptica Nikon Optiphot
Tetróxido de osmioPolicienciasModelo 0223C-10Cristalino (99,95%)
Pincel
Software de Photoshopversión: CS5
Ferricianuro de potasioSigmaaldrichP8131
Óxido de propileno Sigmaaldrich82320puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
Rejillas de una sola ranuraAgar científicoAGG25252 x 0,75 mm o 2 x 1 mm
Cloruro de sodioChempur117941206
Dihidrogenofosfato de sodio dihidratadoChempur117991808
Microscopio estereoscópicoPZO
Filtro de jeringa BiosensBS25PES045
TEM JoelJEM-2100
UltramicrotomoLeicaUC7
Acetato de uraniloLachema
VibrátomoLeicaVT1000 S

References

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