Presentamos un protocolo in vitro optimizado para producir partículas similares al virus SARS-CoV-2 que imitan de cerca al virus auténtico. Este enfoque permite la investigación de los mecanismos de infección, ensamblaje y salida virales sin las limitaciones de requerir un laboratorio de nivel de bioseguridad 3.
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Artículo de método
Producción de un sistema de partículas similar al virus SARS-CoV-2 para investigar los ciclos de vida virales in vitro
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Resumen
Resumen
El método de partículas similares al virus del síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) ofrece una herramienta potente y accesible para estudiar el ciclo de vida del SARS-CoV-2 sin necesidad de laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3). Este sistema imita eficazmente las etapas críticas del ciclo de vida viral, incluido el ensamblaje, el empaquetamiento del genoma y la salida, utilizando un reportero de luciferasa fusionado con la señal T20 para una detección sensible y precisa de la producción de partículas virales. Las SC2-VLP se generan mediante la coexpresión de proteínas estructurales del SARS-CoV-2, incluidas la membrana (M), la nucleocápside (N), la envoltura (E) y la espícula (S), junto con la señal de empaquetamiento de ARN en las células HEK-293T. A diferencia de los sistemas tradicionales de partículas similares a virus, el método SC2-VLP garantiza una cuantificación precisa y una mayor fidelidad al ciclo de vida viral natural. Además, en comparación con los métodos de pseudotipado lentiviral, que se limitan a estudiar la entrada viral a través de la incorporación de la proteína S en partículas lentivirales basadas en el VIH, el sistema SC2-VLP proporciona una plataforma más completa para explorar múltiples etapas de la biología del SARS-CoV-2. Mientras tanto, este método evita los riesgos de manejar virus en vivo y amplía la accesibilidad. El método SC2-VLP representa un avance significativo en la investigación antiviral y el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el SARS-CoV-2.
Introducción
La pandemia de COVID-19 se ha convertido en una de las crisis sanitarias mundiales más devastadoras de la historia moderna, que ha provocado millones de muertes en todo el mundo1. El virus responsable, el SARS-CoV-2, sigue un ciclo de vida complejo que incluye etapas clave como la infección, la replicación del genoma, el ensamblaje y la salida. El proceso de infección comienza cuando la proteína de la espícula viral (S) se une al receptor de la célula huésped, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), lo que facilita la liberación del genoma viral en la célula huésped 2,3. La ARN polimerasa dependiente de ARN viral (RdRp) cataliza entonces la replicación del ARN genómico. Este ARN, en complejo con la proteína nucleocápside (N), forma una estructura estable que es reconocida por la proteína de membrana (M). La proteína M desempeña un papel central en el ensamblaje viral mediante el reclutamiento del complejo ARN-N, S, y la proteína de envoltura (E)4,5. Después del ensamblaje, el virión completa su salida a través de una vía de tráfico no canónica mediada por lisosomas6.
En respuesta a la pandemia, se han movilizado importantes recursos mundiales para desarrollar vacunas, anticuerpos neutralizantes y medicamentos antivirales. La evaluación de estas intervenciones ha sido esencial para avanzar en la investigación sobre el SARS-CoV-27. Sin embargo, el estudio del virus vivo presenta importantes desafíos logísticos, ya que los experimentos con el virus deben realizarse en laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3). La disponibilidad limitada de instalaciones BSL-3 ha limitado el ritmo de la investigación destinada a comprender y combatir el SARS-CoV-2.
Para hacer frente a estos desafíos, dos sistemas principales, la partícula similar a un virus (VLP) y la pseudotipificación lentiviral, se han adoptado ampliamente en la investigación del SARS-CoV-2, los cuales no requieren la contención de BSL-38. El sistema VLP implica la co-transfección de células con genes que codifican proteínas estructurales virales, incluidas M, S, E y N, que juntas generan partículas similares a los virus. Estas partículas imitan las propiedades estructurales y funcionales del virus, lo que las convierte en una herramienta valiosa para estudiar procesos clave en el ciclo de vida del SARS-CoV-2, e incluso en un antígeno eficaz para el desarrollo de vacunas 9,10,11.
Por el contrario, el sistema de pseudotipado lentiviral consiste en reemplazar la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) en el lentivirus por la proteína S del SARS-CoV-2, lo que permite la producción de partículas lentivirales que pueden incorporar genes reporteros como la luciferasa o la GFP. Este sistema es particularmente útil para investigar anticuerpos neutralizantes que bloquean la interacción S-ACE212. Sin embargo, el pseudotipado lentiviral no refleja el ensamblaje o la salida viral del SARS-CoV-2 debido al uso de proteínas estructurales del VIH, que median la liberación de partículas en la membrana plasmática.
Para superar estas limitaciones, Syed et al. identificaron recientemente la señal de empaquetamiento del SARS-CoV-2 dentro de su genoma de ARN, lo que demuestra la especificidad de la proteína N hacia el reconocimiento del genoma viral13. Al fusionar esta señal de empaquetamiento con genes reporteros, es posible incorporar de manera eficiente estos genes en partículas similares al virus SARS-CoV-2 (SC2-VLP)13. Esta estrategia no solo replica los procesos de ensamblaje y salida del SARS-CoV-2, sino que también permite la medición sensible de los pasos de infección. En este estudio, presentamos la metodología experimental para el uso del sistema SC2-VLP y destacamos las consideraciones clave para llevar a cabo este enfoque.
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Protocolo
1. Generación de SC2-VLPs
- Siembra ~3.0 × 106 células HEK-293T en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro con medio completo DMEM, suplementada con 10% v/v FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
NOTA: Para garantizar una alta eficiencia de transfección y una producción óptima de SC2-VLP, las células HEK-293T deben mantenerse en números de paso bajos ~ 10. - Cultive la célula HEK-293T a 37 °C, 5% de CO2 durante unas 24 h y compruebe la confluencia celular bajo el microscopio. Proceda si ~70% confluente.
- Diluir 60 μL de PEI de 1 mg/mL de caldo a 200 μL con medio sin suero.
- Agregue 6,7 μg de plásmido N, 10 μg de plásmido Luc-T20, 0,016 μg de plásmido S y 3,3 μg de plásmido M-IRES-E en 200 μL de medio libre de suero (ver Archivo Suplementario 1).
- Agregue suavemente el PEI diluido del paso 1.3 en la solución que contiene plásmidos que codifican las proteínas de la estructura viral del paso 1.4 e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Esta es la solución de transfección.
- Deje caer con cuidado la solución de transfección del paso 1.5 sobre las células HEK-293T y agite suavemente la placa de cultivo de tejidos para mezclarla completamente.
- Intercambie el medio de cultivo celular 6 h después de la infección con el medio completo DMEM e incube las células HEK-293T transfectadas a 37 °C, 5% CO2 durante 48 h.
- Recoja el sobrenadante de las células HEK-293T infectadas, que contiene las SC2-VLP, y luego filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos celulares. Este es el medio SC2-VLP.
NOTA: Intentamos producir SC2-VLP en las líneas celulares HeLa, Vero E6 y Caco2, pero no se obtuvo ningún título viral medible, lo que indica la especificidad del protocolo para las células HEK-293T.
2. Examen de la eficacia de SC2-VLP
NOTA: La línea celular HEK-293T que expresa de manera estable ACE2 y TMPRSS2 se estableció utilizando un enfoque de transducción lentiviral14,15. La expresión proteica de ACE2 y TMPRSS2 se confirmó mediante análisis de Western blot, siguiendo un protocolo similar al descrito en el Paso 3 (análisis de composición SC2-VLP).
- Siembre 4.0 × 104 células HEK-293T con expresión estable de ACE2 y TMPRSS2 en una placa de 96 pocillos y agregue 50 μL de medio SC2-VLP desde el paso 1.8.
- Incubar la placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h.
- Retire el medio de la placa de 96 pocillos y lave una vez con 100 μL de tampón PBS a 37 °C, que contenga 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 y 1,8 mM de KH2PO4.
- Lisar las células HEK-293T ACE2/TMPRSS2 con 20 μL de tampón de lisis pasiva, meciendo suavemente la muestra durante 15 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente.
NOTA: El tampón de lisis contiene 25 mM de tris-fosfato (pH 7,8), 2 mM de DTT, 2 mM de ácido 1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacético, 1,25 mg/mL de lisozima, 2,5 mg/mL de BSA, 10% de glicerol y 1% de Triton X-100). - Haga girar la placa de 96 pocillos a 4.000 × g durante 15 minutos a 4 °C en una centrífuga de microplacas refrigerada y, a continuación, transfiera inmediatamente la placa a un baño de hielo.
- Tome 100 μL de tampón de ensayo de luciferasa reconstituido en una placa blanca opaca de 96 pocillos y agregue 20 μL de lisado del paso 2.5. Mézclalos brevemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.
- Mida la luminiscencia utilizando un lector de placas con los siguientes parámetros: Modo de detección: Luminiscencia; Rango de longitud de onda: espectro completo; Formato de placa: placa opaca estándar de 96 pocillos; Tiempo de integración: 200 ms.
3. Examen de la composición de SC2-VLP
- Añada 1,36 mL de solución de PEG 8000, que contiene 50% de PEG 8000 y 2,2% de NaCl, a 10 mL de medio SC2-VLP del paso 1.8.
- Mantenga la mezcla en un agitador orbital y mezcle lentamente la solución a 4 °C durante la noche.
- Centrifugar la solución a 4 °C, 2.000 × g durante 30 min, y recoger el pellet SC2-VLP para el análisis de Western blot16.
NOTA: Para el análisis de Western blot, toda la información relativa a los anticuerpos se proporciona en la Tabla de Materiales.
4. Análisis de localización subcelular de S y sus mutantes en células productoras de SC2-VLP
- Siembre ~ 3.0 × 106 células HEK-293T de manera uniforme en la placa de cultivo con fondo de vidrio con 15 mm de diámetro, y luego permita que las células se adhieran y crezcan hasta ~ 70% de confluencia antes de la transfección.
- Repita el procedimiento de transfección como se describe en los pasos 1.3 a 1.7 y modifique solo las cantidades de plásmido de la siguiente manera: plásmido N: 1,3 μg, plásmido Luc-T20: 2 μg, plásmido S: 0,0032 μg y plásmido M-IRES-E: 0,66 μg.
- Lave suavemente la placa de cultivo dos veces con 1 mL de PBS helado y luego agregue 1 mL de solución de fijación de paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente (RT) durante 15 min.
- Lave las células durante 2 x 5 min con 1 mL de PBS en RT, y luego permeabilice las células añadiendo 1 mL de Triton X-100 al 0,25% en RT durante 10 min.
- Lave las células durante 2 x 5 min con 1 mL de PBS en RT, y luego agregue 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en RT durante 1 h para bloquear las interacciones de anticuerpos inespecíficos.
- Agregue ~ 200 μL de solución de anticuerpo primario (suficiente para cubrir el fondo de vidrio) e incube a 4 °C durante la noche.
NOTA: Las soluciones de anticuerpos primarios se preparan diluyendo en BSA al 5% disuelto en PBS a las siguientes proporciones de dilución: el anticuerpo anti-S de ratón a 1:200, el anticuerpo anti-Sec61β de conejo a 1:200, el anticuerpo anti-GM130 de conejo a 1:200 y el anticuerpo anti-ERGIC53 conejo a 1:200. La solución de BSA/PBS al 5% sirvió como diluyente y tampón de bloqueo para minimizar la unión inespecífica durante los procedimientos posteriores de tinción con inmunofluorescencia. - Retire la solución de anticuerpos primarios y luego lave las células durante 3 x 5 minutos con 1 mL de PBS en RT.
- Agregue la solución de anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia en RT durante 1 h y luego lave las células durante 3 x 5 min con 1 mL de PBS en RT.
NOTA: Todos los pasos posteriores deben realizarse en la oscuridad o bajo una exposición mínima a la luz para evitar el fotoblanqueo de los conjugados fluorescentes y preservar la integridad de la señal. Se emplean dos tipos de anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia, que se derivan del ratón o del conejo, para teñir la proteína S o las proteínas marcadoras de orgánulos celulares. - Teñir los núcleos con 2,5 μg/mL de solución de Hoechst en RT durante 5 min, y luego lavar las células durante 3 x 5 min con 1 mL de PBS en RT.
- Observe la tinción de proteínas S u orgánulos y adquiera imágenes utilizando un microscopio confocal con los siguientes parámetros: Modo PMT configurado en VBF (sin promedio, escaneo secuencial en línea) con apertura autoconfocal. Para el canal 1 (FITC), utilice el láser de 488 nm al 25 % de potencia con una emisión de 500 a 548 nm, HV 525 V, ganancia 1x y compensación del 5 %. Para el canal 2 (Alexa Fluor 594), use el láser de 594 nm al 25% de potencia con emisión de 610 a 670 nm, HV 500 V, ganancia 1x y compensación del 5%. Para el canal 3 (DAPI), utilice el láser de 405 nm al 25% de potencia con emisión de 430 a 470 nm, HV 490 V, ganancia 1x y compensación del 5%.
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Resultados
Las etapas de salida y ensamblaje del ciclo de vida del SARS-CoV-2 han sido menos estudiadas que las etapas de infección y replicación17,18. Antes de que se desarrollara el método SC2-VLP, estos procesos solo podían investigarse utilizando SARS-CoV-2 vivo, limitando la investigación a los laboratorios BSL-313. El flujo de trabajo SC2-VLP, que se muestra en la Figura 1, describe el protocolo experimental e ilus...
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Discusión
Un método sencillo y eficaz para modelar el ciclo de vida del SARS-CoV-2 en sistemas de cultivo celular, sin las limitaciones de los laboratorios BSL-3, representa un avance fundamental para la investigación contra el SARS-CoV-2. El método SC2-VLP satisface esta necesidad, ofreciendo una plataforma robusta y accesible. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para el método SC2-VLP, describiendo los pasos experimentales críticos para la producción de SC2-VLP. Además, destac...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el programa de fondos para startups de la Universidad de Medicina China de Beijing (BUCM) (90011451310011). Extendemos nuestro agradecimiento a todos los miembros del laboratorio Dr. Ma en BUCM por la invaluable discusión y asistencia con los experimentos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albúmina de suero bovino (BSA) | Tecnología de señalización celular | 9998S | |
| Microscopio de barrido láser confocal | Olympus | FV3000 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermofisher | A5670402 | |
| cabra Anti-ratón IgG H& Relación de dilución del anticuerpo L (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A11001 | : IF 1:1000 |
| IgG de cabra anti-conejo H& L (Alexa Fluor 594) anticuerpo | Abcam | ab150080 | relación de dilución: IF 1:1000 |
| línea celular HEK-293T | Infraestructura Nacional de Recursos de Línea Celular (NICR) | NICR-293T-001 | Para garantizar una alta eficiencia de transfección y una producción óptima de SC2-VLP, las células HEK-293T deben mantenerse en números de paso bajos (≤ P10). |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Concentración de trabajo: 2.5 μ g/mL |
| Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1500 | |
| Luc-T20 | Addgene | 177941 | |
| monoclonal de ratón anti-GAPDH | Proteintech | 60004-1-Ig | : WB 1:20.000 |
| monoclonal de ratón anti-S RBD | Abclonal | A23771 | : IF 1:200 |
| OptiMEM | Thermofisher | 31985070 | medio sin suero para transfección |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | P3635 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermofisher | 15140122 | |
| Polietileneimina (PEI) | Thermofisher | 43896.01 | |
| Promega tampón de lisis pasiva | Promega | E1941 | |
| Relación de dilución policlonal de conejo anti-ACE2 | Proteintech | 21115-1-AP | : WB 1:1000 |
| policlonal de conejo anti-ERGIC53 | Proteintech | 13364-1-AP | : IF 1:200 |
| policlonal de conejo anti-GM130 | Proteintech | 11308-1-AP | : IF 1:200 |
| policlonal de conejo anti-S | Abcam | ab272504 | : WB 1:1000 |
| Conejo policlonal anti-Sec61β | Proteintech | 15087-1-AP | : IF 1:200 |
| anti-TMPRSS2 policlonal de conejo | Abcam | ab109131 | : WB 1:1000 |
| SARS-CoV-2 M-IRES-E plásmido | Addgene | 177938 | |
| SARS-CoV-2 N plásmido | Addgene | 177959 | |
| SARS-CoV-2 Nucleoproteína Rabbit mAb | Abclonal | A21042 | relación de dilución: WB 1:4000 |
| SARS-CoV-2 S plásmido | Addgene | 177960 | |
| Anticuerpo secundario, HRP, IgG de cabra anti-ratón (H + L)Relación de | Invitrogen | 31460 | : WB 1: 5000 |
| Anticuerpo secundario, HRP, IgG de cabra anti-conejo (H + L)Relación de | Invitrogen | 31430 | : WB 1: 5000 |
| Lector de placas SpectraMax i3x | Dispositivos moleculares | SpectraMax i3x |
Referencias
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