Producción de un sistema de partículas similar al virus SARS-CoV-2 para investigar los ciclos de vida virales in vitro

Resumen

Presentamos un protocolo in vitro optimizado para producir partículas similares al virus SARS-CoV-2 que imitan de cerca al virus auténtico. Este enfoque permite la investigación de los mecanismos de infección, ensamblaje y salida virales sin las limitaciones de requerir un laboratorio de nivel de bioseguridad 3.

Resumen

El método de partículas similares al virus del síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (SC2-VLP) ofrece una herramienta potente y accesible para estudiar el ciclo de vida del SARS-CoV-2 sin necesidad de laboratorios de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3). Este sistema imita eficazmente las etapas críticas del ciclo de vida viral, incluido el ensamblaje, el empaquetamiento del genoma y la salida, utilizando un reportero de luciferasa fusionado con la señal T20 para una detección sensible y precisa de la producción de partículas virales. Las SC2-VLP se generan mediante la coexpresión de proteínas estructurales del SARS-CoV-2, incluidas la membrana (M), la nucleocápside (N), la envoltura (E) y la espícula (S), junto con la señal de empaquetamiento de ARN en las células HEK-293T. A diferencia de los sistemas tradicionales de partículas similares a virus, el método SC2-VLP garantiza una cuantificación precisa y una mayor fidelidad al ciclo de vida viral natural. Además, en comparación con los métodos de pseudotipado lentiviral, que se limitan a estudiar la entrada viral a través de la incorporación de la proteína S en partículas lentivirales basadas en el VIH, el sistema SC2-VLP proporciona una plataforma más completa para explorar múltiples etapas de la biología del SARS-CoV-2. Mientras tanto, este método evita los riesgos de manejar virus en vivo y amplía la accesibilidad. El método SC2-VLP representa un avance significativo en la investigación antiviral y el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el SARS-CoV-2.

Introducción

La pandemia de COVID-19 se ha convertido en una de las crisis sanitarias mundiales más devastadoras de la historia moderna, que ha provocado millones de muertes en todo el mundo¹. El virus responsable, el SARS-CoV-2, sigue un ciclo de vida complejo que incluye etapas clave como la infección, la replicación del genoma, el ensamblaje y la salida. El proceso de infección comienza cuando la proteína de la espícula viral (S) se une al receptor de la célula huésped, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), lo que facilita la liberación del genoma viral en la célula huésped ^2,3

Protocolo

1. Generación de SC2-VLPs

1. Siembra ~3.0 × 10⁶ células HEK-293T en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro con medio completo DMEM, suplementada con 10% v/v FBS y 1% penicilina-estreptomicina.
   NOTA: Para garantizar una alta eficiencia de transfección y una producción óptima de SC2-VLP, las células HEK-293T deben mantenerse en números de paso bajos ~ 10.
2. Cultive la célula HEK-293T a 37 °C, 5% de CO₂ durante unas 24 h y compruebe la confluencia celular bajo el microscopio. Proceda si ~70% confluente.
3. Diluir 60 μL de PEI de 1 mg/mL de caldo a 200 μL con ....

Resultados

Las etapas de salida y ensamblaje del ciclo de vida del SARS-CoV-2 han sido menos estudiadas que las etapas de infección y replicación^17,18. Antes de que se desarrollara el método SC2-VLP, estos procesos solo podían investigarse utilizando SARS-CoV-2 vivo, limitando la investigación a los laboratorios BSL-3¹³. El flujo de trabajo SC2-VLP, que se muestra en la Figura 1, describe el protocolo experimental e ilus.......

Discusión

Un método sencillo y eficaz para modelar el ciclo de vida del SARS-CoV-2 en sistemas de cultivo celular, sin las limitaciones de los laboratorios BSL-3, representa un avance fundamental para la investigación contra el SARS-CoV-2. El método SC2-VLP satisface esta necesidad, ofreciendo una plataforma robusta y accesible. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para el método SC2-VLP, describiendo los pasos experimentales críticos para la producción de SC2-VLP. Además, destac.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina de suero bovino (BSA)	Tecnología de señalización celular	9998S
Microscopio de barrido láser confocal	Olympus	FV3000
DMEM	Corning	10-013-CV
Suero fetal bovino (FBS)	Thermofisher	A5670402
cabra Anti-ratón IgG H& Relación de dilución del anticuerpo L (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	A11001	: IF 1:1000
IgG de cabra anti-conejo H& L (Alexa Fluor 594) anticuerpo	Abcam	ab150080	relación de dilución: IF 1:1000
línea celular HEK-293T	Infraestructura Nacional de Recursos de Línea Celular (NICR)	NICR-293T-001	Para garantizar una alta eficiencia de transfección y una producción óptima de SC2-VLP, las células HEK-293T deben mantenerse en números de paso bajos (≤ P10).
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Concentración de trabajo: 2.5 μ g/mL
Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1500
Luc-T20	Addgene	177941
monoclonal de ratón anti-GAPDH	Proteintech	60004-1-Ig	: WB 1:20.000
monoclonal de ratón anti-S RBD	Abclonal	A23771	: IF 1:200
OptiMEM	Thermofisher	31985070	medio sin suero para transfección
PEG3350	Sigma-Aldrich	P3635
PEG8000	Sigma-Aldrich	P2139
Penicilina-Estreptomicina	Thermofisher	15140122
Polietileneimina (PEI)	Thermofisher	43896.01
Promega tampón de lisis pasiva	Promega	E1941
Relación de dilución policlonal de conejo anti-ACE2	Proteintech	21115-1-AP	: WB 1:1000
policlonal de conejo anti-ERGIC53	Proteintech	13364-1-AP	: IF 1:200
policlonal de conejo anti-GM130	Proteintech	11308-1-AP	: IF 1:200
policlonal de conejo anti-S	Abcam	ab272504	: WB 1:1000
Conejo policlonal anti-Sec61β	Proteintech	15087-1-AP	: IF 1:200
anti-TMPRSS2 policlonal de conejo	Abcam	ab109131	: WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E plásmido	Addgene	177938
SARS-CoV-2 N plásmido	Addgene	177959
SARS-CoV-2 Nucleoproteína Rabbit mAb	Abclonal	A21042	relación de dilución: WB 1:4000
SARS-CoV-2 S plásmido	Addgene	177960
Anticuerpo secundario, HRP, IgG de cabra anti-ratón (H + L)Relación de	Invitrogen	31460	: WB 1: 5000
Anticuerpo secundario, HRP, IgG de cabra anti-conejo (H + L)Relación de	Invitrogen	31430	: WB 1: 5000
Lector de placas SpectraMax i3x	Dispositivos moleculares	SpectraMax i3x

Relación de diluciónRelación de diluciónRelación de diluciónRelación de diluciónRelación de diluciónRelación de dilución Relación de dilución dilución de dilución de