Artículo de método

Una guía paso a paso para el aislamiento y análisis de la superficie foliar y el ARN apoplásico utilizando rosetas de Arabidopsis

DOI:

10.3791/68406

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8 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos un método simple pero altamente reproducible para aislar el ARN extracelular de la superficie de la hoja y el apoplasto de las plantas de Arabidopsis.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La superficie de las hojas de las plantas y el espacio intercelular dentro de las hojas (el apoplasto) sirven como interfaces clave para el intercambio molecular entre las plantas y sus microbios que interactúan. En trabajos anteriores, demostramos la presencia de una amplia gama de especies de ARN en el apoplasto de las rosetas de Arabidopsis. Más recientemente, nuestros hallazgos revelaron que las plantas de Arabidopsis también secretan ARN activamente en la superficie de sus hojas. Para investigar esto, desarrollamos un método altamente reproducible para recolectar tanto el lavado de la superficie de la hoja (LSW) como el líquido de lavado apoplástico (AWF) del mismo conjunto de plantas de Arabidopsis. Además, exploramos una técnica no invasiva que involucra hisopos en la superficie de la hoja (LSS), que nos permitió recolectar ARN frotando suavemente la superficie de la hoja con palitos estériles con punta de algodón. Para minimizar el riesgo de contaminación microbiana, filtramos las fracciones LSW, AWF y LSS antes de aislar el ARN extracelular (exARN). Al analizar el exARN purificado mediante electroforesis en gel de ARN desnaturalizante, observamos una amplia gama de especies de ARN largas y pequeñas en muestras de ARN LSW, LSS y AWF. Se realizó una cuantificación adicional y un análisis comparativo entre las muestras de exARN y las condiciones experimentales utilizando el software de libre acceso ImageJ. Este protocolo proporciona un enfoque eficiente y rentable para aislar y analizar pequeñas cantidades de exARN de las hojas de las plantas. Estas preparaciones de ARN se pueden caracterizar aún más mediante secuenciación y otros análisis moleculares, lo que ofrece información sobre las funciones dinámicas del exARN en las interacciones planta-microbio.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las hojas están colonizadas por una variedad de microbios, incluidas bacterias, hongos, oomicetos y protistas, que pueden ayudar a proteger las plantas de factores estresantes bióticos y abióticos, lo que en última instancia promueve el crecimiento y desarrollo de las plantas 1,2,3,4. La hoja de la planta tiene dos compartimentos principales para albergar sus microbios que interactúan: epífita (superficie de la hoja) y endófita (apoplasto)2. La superficie de la hoja está protegida por una capa de cutícula hidrofóbica, que evita la pérdida de agua e incluye componentes como cera y cutina. La superficie superior de la hoja (adaxial) a menudo incluye células epidérmicas especializadas parecidas a pelos llamadas tricomas, que protegen contra la luz ultravioleta, regulan la temperatura y sirven como elementos disuasorios para la herbivoría. Por el contrario, el apoplasto facilita el intercambio de gases y agua para la fotosíntesis y proporciona un ambiente húmedo propicio para la colonización microbiana5. A pesar de estas diferencias, ambos compartimentos foliares favorecen a ciertos microbios, siendo las redes microbianas epífitas más complejas en términos de diversidad en comparación con las redes microbianas endófitas5. La forma en que se regula la composición de estas comunidades microbianas en cada compartimento extracelular sigue siendo poco conocida. Especulamos que la estructura de la comunidad microbiana puede estar determinada, en parte, por el ARN extracelular (exARN) secretado por la planta huésped.

En nuestro estudio reciente, informamos la presencia de diversas especies de ARN en la superficie de la hoja que difieren del ARN en el apoplasto o lisados celulares6. Si bien la mayoría de las investigaciones sobre exARN en plantas se han centrado en pequeños ARN no codificantes, como microARN (miARN) y pequeños ARN de interferencia (ARNip), se ha prestado menos atención a otras especies de ARN, como los fragmentos derivados de ARNr y ARNt, que potencialmente pueden regular los procesos celulares independientemente de la complementariedad de la secuencia, particularmente en especies que carecen de mecanismos de interferencia de ARN 7,8, 9.

El método que describimos aquí permite el aislamiento secuencial de ARN tanto del lavado de la superficie de la hoja (LSW) como del líquido de lavado apoplástico (AWF) utilizando el mismo conjunto de plantas de Arabidopsis. Además, describimos una técnica ortogonal no invasiva que involucra un hisopo de la superficie de la hoja (LSS), que permite la recolección de ARN frotando suavemente la superficie de la hoja rociada con palitos estériles con punta de algodón6. Para minimizar el riesgo de contaminación microbiana, filtramos las fracciones LSW y AWF antes de aislar el ARN extracelular. Para evaluar la distribución de cantidad y tamaño de las muestras de exARN, describimos un protocolo que emplea electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante combinada con análisis de imágenes utilizando el software de libre acceso ImageJ. Este protocolo proporciona un enfoque eficiente y rentable para aislar y analizar pequeñas cantidades de exARN. Estas preparaciones de ARN se pueden caracterizar aún más a través de la secuenciación y los análisis moleculares, lo que ofrece información sobre las funciones dinámicas del ARN extracelular en las interacciones planta-microbio.

El protocolo descrito a continuación difiere de nuestro protocolo descrito anteriormente para aislar ARN de vesículas extracelulares de plantas10. El protocolo actual no requiere ningún paso de ultracentrifugación y permite el aislamiento de ARN del líquido de lavado extracelular total, no solo de las vesículas extracelulares. Lo más significativo es que proporciona dos métodos ortogonales para aislar el ARN de la superficie de la hoja. Hasta donde sabemos, el aislamiento de ARN de las superficies de las hojas no se ha descrito antes de nuestra reciente publicación6.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación y esterilización del tampón

  1. Prepare un tampón de aislamiento de vesículas (VIB) que comprenda 20 mM de ácido etanosulfónico (MES) 2-(N-morfolino), pH 6,0, 2 mM de CaCl2 y 0,01 M de NaCl en 1 L de agua destilada.
    NOTA: Se han realizado ajustes menores a la concentración de NaCl en VIB de 0.1 M a 0.01 M para imitar la concentración iónica del apoplasto de la hoja.
  2. Autoclave el VIB durante 20 min a 121 °C, ciclo líquido. Alternativamente, esterilice el VIB con un filtro de vacío de 0,45 μm.
    NOTA: Este paso es para garantizar que el tampón sea estéril, ya que cualquier contaminación microbiana podría provocar la obtención de plantas y, a su vez, variabilidad en los resultados. Este tampón se puede almacenar a temperatura ambiente (sin abrir la tapa después de la esterilización) para almacenamiento a corto plazo o a 4 °C para almacenamiento a largo plazo.

2. Material vegetal y condición de crecimiento

  1. Siembre semillas de Arabidopsis thaliana Col-0 de tipo silvestre (WT) en macetas de plástico redondas de 4 pulgadas que contengan una mezcla para macetas estándar. Después de la siembra, remojar las semillas con un fungicida biológico (600 mg/L), cubrirlas con una cúpula de plástico transparente y mantenerlas a 4 °C en la oscuridad durante 3 días para inducir una germinación sincrónica.
  2. Transfiera las macetas con semillas a una cámara de crecimiento de día corto con temperatura controlada a 24 ° C bajo un fotoperíodo de luz de 9 h / 15 h de oscuridad con una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 150 μmol · m − 2 · s − 1 a nivel de planta (mezcla 50:50 de bombillas fluorescentes de 32 vatios de espectro de 3,500 y 5,000 K).
  3. Después de unos 10 días, transfiera las plántulas individuales a insertos de bandejas de 36 celdas que contengan mezcla para macetas y cúbralas con una cúpula de plástico transparente durante 1-2 semanas.
    NOTA: Un experimento típico requiere ~ 12-24 plantas sanas para cada genotipo / tratamiento. Se ha observado que las plantas de 6-7 semanas producen la cantidad óptima de ARN LSW y AWF con el menor riesgo de contaminación celular.
  4. Dependiendo de la mezcla para macetas utilizada, riegue las plantas cada 10-15 días para evitar la sequía o el estrés por inundaciones.

3. Recolección de ARN de la superficie de la hoja

  1. Método basado en centrifugación (lavado de superficie foliar; LSW)
    1. Para cada réplica, use plantas de Arabidopsis de 6 a 7 semanas.
    2. Agregue Silwet-L77 (en adelante denominado agente humectante) al VIB estéril a una concentración final de 0,001% (1 μL en 100 mL de VIB) antes de comenzar el aislamiento de LSW.
      NOTA: Silwet-L77 es un agente humectante que reduce la tensión superficial y permite que el tampón cubra las superficies de las hojas.
    3. Transfiera 100 ml de VIB a una botella rociadora de 500 ml.
    4. Separe con cuidado las rosetas de Arabidopsis de sus raíces con unas tijeras finas.
    5. Retire el exceso de tierra del pecíolo con un cepillo suave.
    6. Coloque las rosetas en una bandeja plana con la superficie abaxial hacia arriba.
    7. Rocíe la superficie abaxial con VIB + agente humectante con cinco bombas de la botella rociadora.
    8. Voltee las rosetas con cuidado y rocíe la superficie adaxial con VIB + agente humectante cinco veces.
    9. Para recuperar LSW, coloque cuidadosamente las rosetas rociadas dentro de jeringas sin aguja de 60 ml con orificios en la parte inferior (caben un máximo de dos rosetas de 6 semanas por jeringa) colocadas dentro de frascos de centrífuga de 250 ml. Envuelva la jeringa con parafilm alrededor del cuello para suspender la punta de la jeringa por encima del fondo del frasco (consulte la Figura 1 como referencia).
      NOTA: Para obtener detalles sobre la preparación de las jeringas de 60 ml con orificios, consulte el protocolo11 publicado anteriormente.
    10. Centrifugar las botellas cargadas a 100 g durante 10 min a 4 °C (rotor JA-14).
    11. Filtre el LSW a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y recoja el filtrado en un tubo de centrifugación de 50 ml colocado sobre hielo.
      NOTA: Por lo general, 12 plantas producirían alrededor de 30 ml de LSW al final con este protocolo. Sin embargo, esto es solo una estimación basada en la cantidad de pulverizaciones realizadas en cada paso. Este volumen es normalmente menor que el volumen pulverizado, ya que parte del tampón pulverizado se pierde durante la manipulación.
  2. Método de hisopo de superficie foliar (LSS)
    1. Rocíe las rosetas separadas con VIB + agente humectante como se describe en la sección anterior (pasos 3.1.1-3.1.7).
    2. Para recuperar LSS, frote las superficies adaxial y abaxial con palitos estériles con punta de algodón y presione las puntas empapadas contra la pared interna de un tubo de centrifugación de 15 ml para exprimir el líquido.
      NOTA: Las muestras de LSS adaxial y abaxial se pueden recolectar en tubos separados según la configuración experimental y el resultado esperado.
    3. Filtre las muestras de LSS a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm en un tubo de centrifugación de 15 ml colocado sobre hielo.
      NOTA: Dependiendo del número de plantas hisopadas, se podrían recolectar volúmenes variables de LSS por experimento.

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Figura 1: Herramientas utilizadas para el lavado de la superficie de la hoja y el aislamiento del líquido de lavado apoplástico. (A) Para recolectar LSW y AWF, se colocan dos rosetas enteras de Arabidopsis thaliana en una jeringa de 60 ml con ocho orificios adicionales que se funden en el extremo de la jeringa con pinzas calentadas para crear canales por los que fluya el lavado. (B) Esta jeringa sin aguja se envuelve con parafilm en la región del cuello como se muestra. (C) Este paso permite que la jeringa quepa en un frasco de centrífuga de 250 ml sin tocar el fondo del frasco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Recogida de líquido de lavado apoplástico (AWF)

  1. Coloque el mismo conjunto de plantas utilizadas para el aislamiento LSW o LSS en un vaso de precipitados y enjuáguelas suavemente dos veces con agua destilada.
  2. Infiltrar al vacío las rosetas con VIB durante 20 s de la siguiente manera:
    NOTA: Aunque el proceso de infiltración al vacío está bien descrito en un protocolo publicado anteriormente11, se ha reproducido aquí para aclarar el presente protocolo.
    1. Coloque cuidadosamente las rosetas en una cafetera de prensa francesa con 300-500 ml de VIB. Coloque la tapa en la prensa francesa y baje suavemente el émbolo hasta que las plantas estén completamente sumergidas.
    2. Coloque la prensa francesa con las plantas y el tampón en una cámara de vacío. Aplique un vacío durante 20 s con una bomba de vacío. El tampón debería comenzar a hervir.
    3. Libere el vacío y retire la prensa francesa de la cámara de vacío, retire la tapa y vierta el VIB en un vaso de precipitados de plástico de 500 ml separado. Retire las rosetas de la prensa francesa.
      NOTA: El VIB se puede reutilizar varias veces en el mismo día para un genotipo, pero una vez utilizado para la infiltración al vacío, el VIB no debe almacenarse para su uso en otro día.
    4. Elimine el exceso de VIB de las plantas agitando suavemente y luego cepillando las hojas sobre una toalla de papel.
  3. Elimine el exceso de amortiguador de las superficies de las hojas secando suavemente con papel secante.
  4. Para recoger el líquido de lavado apoplástico (AWF), coloque las rosetas dentro de jeringas sin aguja de 60 ml colocadas dentro de frascos de centrífuga de 250 ml como se describe para la recogida de LSW y centrifugue a 4 °C durante 30 min a 600 × g con aceleración lenta.
  5. Filtre el AWF agrupado a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y recoja el filtrado en un tubo de centrífuga de 15 ml colocado sobre hielo.
    NOTA: Por lo general, 12 plantas producirían alrededor de 6 ml de AWF al final utilizando este protocolo. Los LSW, AWF y LSS filtrados se pueden usar inmediatamente o almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior.
  6. Registre el peso fresco (FW) de las plantas utilizadas para cada réplica después del aislamiento de AWF. Posteriormente, use esta lectura para normalizar la cantidad de ARN en cada muestra (Figura 2).

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Figura 2: Ilustraciones esquemáticas del protocolo y el método de hisopado de la superficie de la hoja. (A) Ilustración esquemática del protocolo escalonado para el aislamiento del lavado de la superficie de la hoja y el líquido de lavado apoplástico utilizando rosetas de Arabidopsis. (B) Ilustración esquemática del método de hisopo de la superficie de la hoja (LSS) para aislar el ARN de la superficie de la hoja. Figuras adaptadas de la Figura S1 y la Figura S4 de Borniego et al., 20256. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Precipitación de ARN

  1. Precipite el ARN mezclando el volumen requerido de AWF, LSW o LSS con 0,1 volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 1,0 volumen de isopropanol frío en un tubo de centrifugación de 15 ml.
  2. Agregue glucógeno (caldo de 20 mg / ml) a una concentración final de 20 μg / ml.
    NOTA: Asegúrese de que los tubos de centrífuga utilizados para precipitar el ARN se puedan centrifugar a una alta velocidad de 13.000 × g. La rotura de los tubos en este paso puede provocar la pérdida de muestras de ARN.
  3. Incubar la mezcla a -20 °C durante un mínimo de 1 h o toda la noche.
  4. Centrifugar los tubos a 13.000 × g durante 30 min a 4 °C (rotor JA-25.50).
  5. Lave el gránulo dos veces con EtOH al 70% helado y déjelo secar al aire durante no más de 10 minutos.
  6. Vuelva a suspender los gránulos en 100 μL de agua ultrapura libre de DNasa/RNasa o VIB, y transfiera el ARN a tubos de centrífuga de 1,5 ml.
    NOTA: Después de este paso, el ARN precipitado se puede almacenar a -80 °C durante un máximo de 2 semanas.

6. Aislamiento de ARN basado en TRIzol

  1. Agregue 1 ml de reactivo TRIzol a cada tubo y mezcle agitando en un rotador.
    PRECAUCIÓN: Para manipular TRIzol, úselo en una campana extractora, use guantes y protección para los ojos.
  2. Coloque los tubos en un rotador de mesa durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
  3. Agregue 200 μL de cloroformo a cada tubo, seguido de un breve pero vigoroso paso de vórtice.
    PRECAUCIÓN: Para manipular el cloroformo, úselo en una campana extractora, use guantes y protección para los ojos.
  4. Deje reposar los tubos a temperatura temperatura durante unos 3 minutos y luego centrifugue a 13.000 × g durante 15 minutos a 4 °C.
  5. Transfiera la fase acuosa a tubos de centrífuga marcados de 1,5 ml y agregue 10 μg de glucógeno libre de ARNasa y un volumen de isopropanol frío.
    PRECAUCIÓN: Para los desechos biopeligrosos generados (como los desechos fenólicos), recolecte solventes orgánicos en contenedores de desechos designados según las pautas institucionales.
  6. Incube los tubos durante no más de 1 h a -20 °C.
    NOTA: Precipitar el ARN durante más de 1 h en este paso reduce la eficiencia del aislamiento de ARN y conduce a una concentración muy baja de ARN.
  7. Para granular el ARN, centrifugar los tubos a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C.
  8. Lave los gránulos de ARN dos veces con EtOH helado al 70% y déjelos secar al aire antes de volver a suspenderlos en 10-20 μL de agua ultrapura libre de ADNasa/ARNasa.
  9. Almacene el ARN resuspendido a -20 °C o -80 °C para su almacenamiento a corto o largo plazo, respectivamente.

7. Eliminación de la contaminación por fenol o guanidina

  1. Para eliminar la contaminación por fenol o guanidina de las muestras de ARN, realice una o dos precipitaciones seriadas con EtOH al 96% y acetato de amonio.
  2. Agregue 1 μg de glucógeno a 10 μL de muestras de ARN y mezcle con 0,5 volúmenes de acetato de amonio 7,5 M antes de agregar 2,5 volúmenes de 96-100% de EtOH.
    NOTA: La concentración final de EtOH debe ser del 70-75% en todo el volumen en este paso.
  3. Incubar la mezcla a -80 °C durante 30 min y centrifugar a 13.000 × g durante 20 min a 4 °C.
  4. Lave el gránulo de ARN dos veces con EtOH al 70% y vuelva a suspender en 10 μL de agua ultrapura libre de ADNasa/ARNasa.

8. Electroforesis en gel de ARN para cuantificación y comparación

  1. Prepare un mini gel (7,2 cm x 8,6 cm x 0,75 mm) que contenga 10% o 15% de poliacrilamida y 7 M de urea en 1x EDTA de ácido trisbórico (TBE, pH 8,4) utilizando una solución de acrilamida/Bis al 40%, 37,5:1. Alternativamente, se puede usar un mini gel desnaturalizante comercial (15% de gel de urea TBE) para analizar las muestras de ARN.
  2. Mezcle muestras de ARN (1:1) con tampón de carga desnaturalizante 2x (95% de formamida, 10 mM de EDTA, 0,02% de SDS, 0,02% de azul de bromofenol y 0,01% de xileno cianol), desnaturalice a 65 °C durante 5 min y colóquelo inmediatamente en hielo.
  3. Resuelva las muestras de ARN en un tampón de ejecución TBE 0,5x a RT a 220 V durante aproximadamente 1 h y 15 min.
  4. Para los estándares de tamaño, use una mezcla 1:1 de ssRNA de bajo rango y marcadores de escalera de ssRNA de 14-30 nt.
  5. Tiña el gel con 1x tinción de gel de ácido nucleico de oro SYBR en 0,5x TBE durante 10 min, lava dos veces con agua destilada y toma una imagen con un sistema de imágenes (Figura 3).
  6. Para cuantificar el ARN resuelto en cada carril, utilice el método de análisis de gel descrito en la documentación de ImageJ bajo el subtítulo "Análisis de gel": https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
  7. Dado que cada vez se cargan 100 ng/μL de ARN CL para comparar el patrón de bandas entre las muestras de CL y exARN, estime la concentración de muestras de exARN en relación con el ARN CL (Figura 4).

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Figura 3: Las hojas de las plantas están recubiertas con ARN diverso. Se separaron 100 ng de ARN del lisado de células foliares (CL) y 2 μL de ARN aislado de AWF y LSW en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15% y se tiñeron con tinción de ácido nucleico SYBR Gold para visualizar y comparar los patrones de bandas de ARN. Los estándares de tamaño de ARN se muestran en el carril más a la izquierda. Las mediciones de densitometría obtenidas mediante el análisis de gel ImageJ se indican en la parte inferior de cada carril e indican la cantidad de ARN en relación con el ARN en el carril de lisado de células foliares totales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Extracción repetida de ARN LSW. LSW se aisló por primera vez usando VIB sin Silwet L-77 o concentraciones variables de Silwet L-77 (0.001% o 0.01%). El aislamiento repetido de LSW utilizando el mismo conjunto de plantas de Arabidopsis se puede emplear para enriquecer el ARN de LSW usando VIB + Silwet L-77 (0,001%). L1, L2 y L3 denotan muestras de ARN aisladas con LSW recolectadas a través de tres rondas sucesivas de centrifugación después de la fumigación del mismo conjunto de plantas. El aumento de la concentración del agente humectante del 0,001% al 0,01% no mejoró el aislamiento del ARN LSW. Las mediciones de densitometría obtenidas mediante el análisis de gel ImageJ se indican en la parte inferior de cada carril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9. Método alternativo para cuantificar el ARN utilizando un método basado en placa de microtitulación

  1. Prepare soluciones de ARN estándar utilizando ARN CL en agua ultrapura libre de ARNasa/ADNasa. Determine el rango de concentración apropiado para los estándares en función de la concentración anticipada de las muestras. Utilice las siguientes concentraciones de ARN: 0, 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/μL y prepare un volumen suficiente de cada estándar para permitir dos réplicas técnicas.
  2. Prepare 1,5x tinción de gel de ácido nucleico SYBR Gold en 500 mM Tris HCl pH = 8.
    NOTA: SYBR Gold depende del pH y tiene una sensibilidad de tinción óptima entre pH = 7,0 y 8,0.
  3. Configuración de microplaca:
    1. Agregue 99 μL de dH2O a cada pocillo.
    2. Agregue 1 μL de ARN a cada pocillo. Utilice 1 μL tanto para muestras de ARN como para patrones de ARN.
    3. Agregue 50 μL de 1.5x SYBR Gold a cada pocillo.
  4. Establezca los parámetros en el lector de microplacas de la siguiente manera:
    Agitación -Lineal u orbital: 0:03 (MM:SS)
    Lectura - Punto final de fluorescencia con longitud de onda de excitación establecida en 496 nm y longitud de onda de emisión establecida en 540 nm.
  5. Construya una línea de calibración utilizando los valores de los estándares. Usando la ecuación de la línea de calibración, calcule las concentraciones de ARN en las muestras.
    NOTA: Se pueden usar colorantes alternativos para cuantificar el ARN en muestras aisladas de TRIzol. Se obtuvieron resultados similares con el reactivo de cuantificación de ARN Ribo488. La empresa proporciona un manual detallado para este tinte. Brevemente, diluya el tinte 1000x (1 a 1000) usando 200 mM Tris pH = 8. Luego, para realizar las mediciones, agregue 99 μL de dH2O esterilizado en autoclave a cada pocillo + 1 μL de ARN (muestra o estándar) + 100 μL de la dilución Ribo488, incube 5 min y cuantifique la fluorescencia usando un lector de placas usando excitación de 480 nm y emisión de 520 nm. Las curvas estándar obtenidas utilizando los dos colorantes de ARN se muestran en la Figura 5.

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Figura 5: Curvas estándar obtenidas mediante un método de cuantificación de ARN basado en placa de microtitulación. Dos colorantes de ARN diferentes, SYBR Gold (izquierda) y Ribo488 (derecha) producen resultados consistentes con dos réplicas técnicas por muestra. Cualquiera de los métodos se puede utilizar para realizar la cuantificación del ARN. Sin embargo, se debe obtener una curva estándar cada vez que sea necesario cuantificar el ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la Figura 2A se muestra una descripción general esquemática del protocolo escalonado descrito anteriormente para aislar el lavado de la superficie de la hoja (LSW) y las fracciones de lavado apoplástico (AWF) de las plantas de Arabidopsis. Este método permite la extracción de LSW y AWF de tan solo tres a seis plantas por réplica, al tiempo que produce cantidades equivalentes de ARN de ambas fracciones. Para medir la concentración de ARN en lisados celulares, utilizamos espectrofotometría NanoDrop. Sin embargo, para las muestras de ARN derivadas de LSW, LSS y AWF, nos basamos en la cuantificación densitométrica de geles de poliacrilamida teñidos con SYBR Gold. Este paso de cuantificación es necesario porque las fracciones extracelulares contienen un contaminante desconocido, probablemente polisacáridos, que a veces pueden copurificarse e interferir con los métodos de cuantificación de ARN basados en absorbancia, lo que lleva a una sobreestimación de la concentración de ARN. Para superar esta limitación, planeamos utilizar métodos de purificación de ARN no basados en fenol en nuestro trabajo futuro.

El análisis de gel de ARN desnaturalizante reveló la presencia de una amplia gama de especies de ARN en LSW y AWF, incluidos ARN largos y pequeños (Figura 3). En particular, se aislaron con éxito cantidades equivalentes de ARN tanto de la superficie de la hoja como de fracciones apoplásicas, y las cantidades de ARN se normalizaron por peso fresco (FW) de la planta. Sorprendentemente, los perfiles de tamaño de ARN de las fracciones LSW y AWF diferían significativamente entre sí y del perfil del ARN de lisado celular total (CL). Estas diferencias sugieren que las fracciones de exARN no están contaminadas con ARN celular. Entre las tres fracciones, el ARN apoplásico (AWF) exhibió la mayor diversidad en la distribución de tamaños, lo que sugiere que el ARN apoplásico está más degradado que el ARN de la superficie de la hoja.

Para examinar más a fondo la presencia de ARN en la superficie de las hojas de Arabidopsis, empleamos hisopos de algodón. Este método nos permitió recolectar ARN por separado y secuencialmente de las superficies de las hojas adaxiales (superiores) y abaxiales (inferiores)6. Estos análisis revelaron que ambas superficies de las hojas contenían cantidades similares de ARN. Además, la capacidad de recolectar ARN simplemente absorbiendo el tampón de la superficie de la hoja sin necesidad de centrifugación respalda aún más la conclusión de que el ARN se encuentra en la superficie de la hoja, en lugar de extraerse a través de los estomas durante la centrifugación.

Un ajuste primario que nos permitió extraer una cantidad abundante de ARN de la superficie de la hoja fue la adición del agente humectante. Recuperamos casi dos veces más ARN al agregar agente humectante (a una concentración muy baja de 0,001%) al VIB. Esta diferencia en la concentración de ARN obtenida con y sin Silwet L-77 indica que el uso de un agente humectante mejora la disolución del ARN en la superficie de la hoja. Sin embargo, el aumento de la concentración del agente humectante del 0,001% al 0,01% no mejoró el aislamiento del ARN LSW (Figura 4). En particular, la repetición del aislamiento del ARN LSW de las mismas hojas produjo ARN adicional (aproximadamente el 63% de la recuperación obtenida del primer lavado), lo que sugiere que las hojas secretan ARN continuamente en la superficie, y casi dos tercios de él se reemplazan dentro de los aproximadamente 30 minutos necesarios para procesar las hojas. Para aumentar los rendimientos totales de ARN de LSW cuando el material vegetal es limitante, es posible lavar las mismas hojas varias veces seguidas. Sin embargo, no recomendamos más de tres lavados, ya que el manejo involucrado puede provocar daños acumulativos en el material de la hoja, según lo evaluado por la coloración verde del líquido de lavado. Para estos experimentos, la concentración de ARN se estimó mediante análisis de densitometría basado en gel de ARN. Sin embargo, el método de cuantificación de ARN basado en placa de microtitulación descrito anteriormente se puede utilizar para una cuantificación precisa del ARN al evaluar varias muestras a la vez (Figura 5).

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla cómo aislar el lavado de la superficie de la hoja (LSW), el hisopo de la superficie de la hoja (LSS) y el líquido de lavado apoplástico (AWF) de rosetas de Arabidopsis sanas, seguido de la extracción de ARN. Los pasos críticos incluyen la preparación y esterilización de VIB antes de realizar el experimento, el cultivo de las plantas en condiciones controladas y el uso de Silwet-L77 para garantizar un recubrimiento adecuado de la superficie de la hoja por parte del VIB. Estos procedimientos deberían producir cantidades iguales de ARN tanto de LSW como de AWF normalizados por el peso fresco de la hoja. La recuperación de ARN de estas fracciones extracelulares requiere un manejo cuidadoso, especialmente con respecto a los gránulos de ARN después de los pasos de precipitación.

Aunque el protocolo anterior se ha optimizado para las hojas de Arabidopsis, también lo hemos utilizado con éxito en otras especies de plantas con solo modificaciones menores. La extracción de ARN de la superficie de la hoja se puede optimizar implementando dos ajustes principales: en primer lugar, realizando múltiples rondas de aislamiento de LSW y, en segundo lugar, aumentando la concentración del agente humectante. Las especies de plantas que tienen superficies foliares muy hidrófobas, como el arroz12,13, pueden requerir concentraciones más altas del agente humectante.

Además, describimos un método no invasivo para recolectar ARN de la superficie de la hoja utilizando hisopos con punta de algodón. Con este método de aislamiento de ARN de la superficie de la hoja, nos aseguramos de que el tubo de recolección se coloque en un cubo de hielo. Teniendo en cuenta que el ARN en la superficie de la hoja se secreta y se acumula a temperatura ambiente, asumimos que permanecería estable incluso durante el proceso de recolección. También hemos comparado los patrones de bandas del LSW y el ARN LSS, y no muestran mucha diferencia en términos de degradación.

El protocolo anterior utiliza el reactivo TRIzol para purificar el ARN de LSW, LSS o AWF. Este reactivo emplea fenol para eliminar proteínas. Sin embargo, hemos encontrado que la purificación basada en TRIzol no elimina polisacáridos como la pectina, que son abundantes en LSW y AWF6. Estas moléculas de copurificación pueden causar problemas con la cuantificación del ARN mediante espectrofotometría o fluorometría. Por lo tanto, confiamos en el análisis de densitometría basado en gel de ARN para evaluar las concentraciones de exARN. Actualmente estamos investigando métodos de purificación basados en columnas que deberían proporcionar una mejor separación del ARN de los polisacáridos. Sin embargo, estos métodos a menudo limitan la recuperación de ARN pequeños, ya que la membrana de sílice está optimizada para unirse a moléculas de ARN de más de ~ 200 nucleótidos. Los ARN pequeños pueden pasar a través de la membrana durante la unión o perderse en los pasos de lavado. Por lo tanto, hasta ahora, confiamos solo en el método basado en TRIzol para una recuperación más completa de todos los tamaños de ARN, incluidos los ARN pequeños, aunque requiere un manejo cuidadoso y una separación de fases.

Además, al realizar análisis de ARN en gel, no vemos fragmentos menores de 80 nt para las muestras de ARN celular total en comparación con los ARN AWF y LSW, principalmente debido a la baja abundancia en relación con las grandes cantidades de ARNr y ARNt. La presencia de bandas más pequeñas en el AWF y LSW se debe a la degradación de los abundantes ARNr y ARNt, que ocurre naturalmente después de la secreción de ARN en el compartimento extracelular de las plantas, y no es un artefacto introducido durante la recolección y manipulación de las plantas como lo confirma la secuenciación y el análisis de Northern blot6.

Nuestro método de aislamiento de lavado de la superficie de la hoja es una herramienta versátil con un potencial significativo para una amplia gama de aplicaciones de investigación. Debería permitir el aislamiento de biomoléculas de la superficie de la hoja, como ARN, proteínas y otros metabolitos que pueden ser fundamentales para comprender las interacciones entre plantas y microbios. Si se desea identificar los microbios que están presentes en AWF y LSW, esto se puede lograr eliminando la filtración a través del filtro de 0,22 μm.

Las plantas interactúan con una amplia gama de microbios, incluidas bacterias, hongos y virus, que forman comunidades complejas ensus superficies. Estas comunidades microbianas pueden tener efectos profundos en el crecimiento de las plantas, la resistencia a las enfermedades y la adquisición de nutrientes 2,3,4. Al aislar y analizar el lavado de la superficie de la hoja utilizando este método, los investigadores pueden aislar exRNA, metabolitos microbianos, identificar comunidades microbianas presentes en la superficie de la hoja e investigar cómo se regulan estas comunidades a nivel molecular.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por dos subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos,

IOS-2243531 e IOS-2141969 a R.W.I.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Marcador de escalera de ssRNA de 14-30 ntTakara3416
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mlVWR20170-038
Jeringa sin aguja de 10 mlBD303347
Tubos de halcón de 15 mlVWR89039-668
Gel de urea TBE-PROTEAN al 15%, 10 pocillos/12 pocillos, 30 µ L/20 µ LBio-Rad4566053 / 4566055
Insertos de bandeja de 36 celdasMercado de la hoja verdadera
Solución de acrilamida y bis-acrilamida al 40%, 37.5:1Bio-Rad1610148
Macetas redondas de 4 pulgadasMercado de la hoja verdadera
Tubos de halcón de 50 mlVWR89039-656
Jeringa sin aguja de 50 mlBD309653
Placa de 96 pocillos fondo negroGrenier655090
Acrodisc 0.22 μ Filtro de jeringa MPall4192
Acrodisc 0.45 μ Filtro de jeringa MPall4454
Persulfato de amonio (APS) Sigma-AldrichReferencia A3678
Cloruro de calcioSigma-AldrichC1016
Cloroformo (sin ARNasa)Macron Fine ChemicalsMK444110
Domos de plástico transparenteHummert Internacional11 3348Se puede utilizar cualquier cúpula de plástico para cubrir las plantas y mantener la humedad
Bastón con punta de algodón grado médicoUlineS-21102
Etanol (sin ARNasa)Laboratorios Decon, Inc.2716GEA
Cafetera French Press, 24 fl ozPico de nieveCS-111
Bandeja de cultivo sin agujeros 10 x 20Mercado de la hoja verdadera
Cubo de hielo Schuett-Biotech, Spongex3-680 052
IsopropanolThermo Scientific149320050
Rotor de ángulo fijo JA-14Beckman Coulter; modelo: JA-14339247
Toallitas KimwipesKCWW, Kimberly-Clark34120
Cargador de ssRNA de rango bajoNEBN0364S
MES hidrataSigma-AldrichM8250
Lector de microplacasBioTek  Sinergia H1
Miracle-GroMiracle-Gro24-8-16Es un alimento vegetal para todo uso. Dependiendo de la fuente de suelo utilizada para cultivar las plantas, se puede ajustar la aplicación.
Frasco centífugo Nalgene 250 ml (sin tapón)Nalgene3120
Toallas de papel
ParaFilm  Película de laboratorio MParafilmS-25929
Vaso de precipitados de plástico (500 ml)UlineS-21658
Glucógeno libre de ARNasa (20 mg/ml)Thermo ScientificR0561
Fungicida biológico RootShield Plus WPBioWorks68539-9
Tijeras
Silwet L-77Laboratorios de fitotecnologíaS7777Se puede utilizar cualquier marca de Silwet L-77. Sin embargo, Silwet pierde su eficacia con el paso del tiempo. Es ideal reemplazarlo una vez al año.
Cloruro de sodioSigma-AldrichS7653
Brocha de nylon suave para el peloNOS. Suministro de arteNo. 6
Botella de sprayUlineS-7272Se puede usar cualquier botella de spray, pero la configuración del spray debe estar en la ducha.
Sungro Mezcla de Cultivo ProfesionalSungro
Mezcla de propagación SungroSungro
Tinción en gel de ácido nucleico SYBR Gold (concentrado 10,000x en DMSO)Thermo ScientificS11494
TEMEDThermo Scientific17919
Reactivo TRIzolInvitrogen15596026
Agua ultrapura sin DNASA/ARNASAInvitrogen10977015
UreaSigma-AldrichU5378
Cámara de vacío, 0.20 pies cúbicosSP Scienceware - Productos Bel-Art - H-B InstrumentReferencia F42031-0000
Bomba de vacío, 3.5 CFMProductos de vacío idealesP101532
BalanzaEscaliWBB480535Esto es solo un ejemplo. Se puede utilizar cualquier báscula.

Referencias

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