Ex Vivo Análisis de una sola molécula del ensamblaje del receptor 2 de rianodina en tejido cardíaco y neuronal

Resumen

Este estudio presenta un método de imagen de una sola molécula basado en vesículas que preserva la organización del receptor nativo, lo que permite una cuantificación precisa de la estequiometría y amplias aplicaciones en el ensamblaje de receptores, la función y la investigación de enfermedades.

Resumen

Comprender el ensamblaje de los receptores es fundamental para dilucidar los mecanismos que subyacen a su función y regulación en los procesos fisiológicos. Si bien los estudios tradicionales in vitro de una sola molécula se basan en el aislamiento de proteínas de sistemas de expresión heterólogos, a menudo no logran capturar la complejidad fisiológica in vivo involucrada en la organización y el ensamblaje de las proteínas de la superficie celular. Este protocolo emplea la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) para estudiar las moléculas del receptor de rianodina 2 (RyR2) marcadas con GFP encapsuladas dentro de vesículas a nanoescala. Estas vesículas, generadas a partir de órganos extraídos rápidamente del animal, proporcionan efectivamente una instantánea del estado de ensamblaje del receptor en el momento de la extracción, lo que permite un análisis detallado de la estequiometría de las subunidades y la organización del receptor en respuesta a los cambios en el entorno fisiológico del animal. Este enfoque utiliza TIRFM y análisis de fotoblanqueo escalonado para proporcionar una lectura de la estequiometría del receptor. La obtención de imágenes de receptores a nivel de una sola molécula facilita la detección de la heterogeneidad dentro de las poblaciones de receptores reunidas en un animal vivo y permite el seguimiento de los cambios de ensamblaje asociados con los estados de enfermedad. Como resultado, este método ofrece una poderosa herramienta para determinar la distribución de los ensamblajes de receptores y su correlación con los cambios en su entorno fisiológico.

Introducción

Los receptores de membrana desempeñan un papel crucial en los procesos fisiológicos de todo el cuerpo humano¹. Una función principal es mediar la comunicación entre células a través de la transferencia de estímulos extracelulares para iniciar eventos de señalización intracelular. Debido a su papel fundamental en la señalización, casi el 70% de las terapias existentes se dirigen a los receptores de membrana². A menudo son estructuras oligoméricas compuestas por múltiples subunidades ensambladas en formas heteroméricas con múltiples estequiometrías ^3,4

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Perfusión transcardíaca y extracción de órganos
   1. Anestesiar al ratón con CO₂ hasta que cese la respiración.
   2. Coloque el ratón en posición supina y asegure las extremidades.
   3. Haga una incisión en la línea media a lo largo del abdomen y extiéndala lateralmente hacia la caja torácica para exponer la cavidad torácica.
   4. Inserte con cuidado una aguja en el ventrículo izquierdo y seccione la aurícula derecha para permitir el drenaje de la perfusión.
   5. Para la preparación de vesículas, perfundir con PBS frío 1x hasta que el sistema circulatorio se limpie de....

Resultados

Para confirmar la aplicabilidad de este método, primero verificamos la expresión y localización de GFP-RyR2 mediante imágenes confocales de criosecciones de tejido cardíaco y neuronal (Figura 1). La señal de fluorescencia en el tejido cardíaco mostró un patrón estriado transversal consistente con la localización esperada de RyR2 en los cardiomiocitos, pero exhibió una alta intensidad en ciertas regiones del cerebro, a saber, la corteza, el hipocampo y el cere.......

Discusión

Este estudio establece un protocolo detallado y reproducible para la encapsulación ex vivo y la obtención de imágenes de una sola molécula de receptores de membrana utilizando RyR2 marcado con GFP como sistema modelo. El protocolo avanza significativamente en los métodos actuales al permitir el análisis estequiométrico de los complejos receptores directamente del tejido nativo, preservando el contexto fisiológico de las proteínas de membrana. En comparación con los sistemas trad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plato de 35 mm | No. 1.5 Cubreobjetos | Diámetro de vidrio de 14 mm	Mattek	P35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Moldes/adaptadores Tissue-Tek Cryomold	Fisher Scientific	NC9542860
APTES	Millipore Sigma	440140-100ML	(3-Aminopropil)trietoxisilano
Bio-Gen PRO200 Homogeneizador de laboratorio	Pro Scientific	1204B59
cellSENS	Olympus Scientific Solutions	n/a
Cámara EMCCD	Andor	n/a	iXon Ultra 897
Absoluto de etanol ≥ 100% (v/v) USP para biología molecular (200 pruebas)	VWR	71006-012
Leica CM1860	Leica	n/a	criostato
MetaMorph Advanced	Molecular Devices	n/a
Nanosight NS300 (con software Nanosight NTA)	Malvern Panalytical	n/a
Nikon AXR Microscopio confocal invertido	Nikon	n/a
Microscopio de fluorescencia invertida con enfoque automático motorizado Olympus IX83	Olympus	n/a	TIRFM
Paraformaldehído 4% en PBS listo para usar reactivo fijador VWR		76221-378
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 20x, grado ultrapuro	VWR	97062-950
Hidróxido de sodio, perlas, grado reactivo	VWR	97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +	NOF America Corporation	n/a	Oleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	M71484
VectaMount AQ Medio de montaje acuoso	Vector Laboratories	H-5501-60