Artículo de método

Ex Vivo Análisis de una sola molécula del ensamblaje del receptor 2 de rianodina en tejido cardíaco y neuronal

DOI:

10.3791/68408

⸱

15 de julio de 2025

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un método de imagen de una sola molécula basado en vesículas que preserva la organización del receptor nativo, lo que permite una cuantificación precisa de la estequiometría y amplias aplicaciones en el ensamblaje de receptores, la función y la investigación de enfermedades.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprender el ensamblaje de los receptores es fundamental para dilucidar los mecanismos que subyacen a su función y regulación en los procesos fisiológicos. Si bien los estudios tradicionales in vitro de una sola molécula se basan en el aislamiento de proteínas de sistemas de expresión heterólogos, a menudo no logran capturar la complejidad fisiológica in vivo involucrada en la organización y el ensamblaje de las proteínas de la superficie celular. Este protocolo emplea la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) para estudiar las moléculas del receptor de rianodina 2 (RyR2) marcadas con GFP encapsuladas dentro de vesículas a nanoescala. Estas vesículas, generadas a partir de órganos extraídos rápidamente del animal, proporcionan efectivamente una instantánea del estado de ensamblaje del receptor en el momento de la extracción, lo que permite un análisis detallado de la estequiometría de las subunidades y la organización del receptor en respuesta a los cambios en el entorno fisiológico del animal. Este enfoque utiliza TIRFM y análisis de fotoblanqueo escalonado para proporcionar una lectura de la estequiometría del receptor. La obtención de imágenes de receptores a nivel de una sola molécula facilita la detección de la heterogeneidad dentro de las poblaciones de receptores reunidas en un animal vivo y permite el seguimiento de los cambios de ensamblaje asociados con los estados de enfermedad. Como resultado, este método ofrece una poderosa herramienta para determinar la distribución de los ensamblajes de receptores y su correlación con los cambios en su entorno fisiológico.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los receptores de membrana desempeñan un papel crucial en los procesos fisiológicos de todo el cuerpo humano1. Una función principal es mediar la comunicación entre células a través de la transferencia de estímulos extracelulares para iniciar eventos de señalización intracelular. Debido a su papel fundamental en la señalización, casi el 70% de las terapias existentes se dirigen a los receptores de membrana2. A menudo son estructuras oligoméricas compuestas por múltiples subunidades ensambladas en formas heteroméricas con múltiples estequiometrías 3,4. Comprender cómo los receptores se organizan en complejos funcionales es fundamental para dilucidar su papel en la salud y la enfermedad 5,6. Los métodos bioquímicos tradicionales, como la inmunoprecipitación y el western blot, proporcionan mediciones de conjunto promediadas, que oscurecen la heterogeneidad en las subpoblaciones de receptores7. Por el contrario, las técnicas de una sola molécula permiten la observación directa de receptores individuales, lo que permite cuantificar la heterogeneidad dentro de las poblaciones de receptores 8,9,10. Las técnicas de molécula única se han convertido en el estándar para cuantificar el ensamblaje de receptores de membrana, la estequiometría y la oligomerización11,12. Este enfoque se ha aplicado ampliamente a muchos receptores de membrana fisiológicamente relevantes utilizando proteínas aisladas o condiciones de cultivo celular. Los estudios de una sola molécula se basan principalmente en sistemas de expresión in vitro, donde las proteínas se pueden aislar de un entorno celular. Sin embargo, la complejidad dentro de un sistema vivo no se refleja completamente en este tipo de sistemas de expresión heterólogos.

Para superar estas limitaciones, desarrollamos un enfoque que aísla e imagenifica los receptores de membrana en un estado fisiológicamente relevante capturándolos dentro de nanovesículas derivadas directamente de tejidos cardíacos y neuronales. Este método preserva eficazmente el estado de ensamblaje del receptor en el momento de la formación de la vesícula, lo que permite la visualización directa de la estequiometría de la subunidad del receptor, que es un indicador fundamental de la respuesta del receptor en diferentes entornos fisiológicos. Este enfoque nos permite examinar el ensamblaje estequiométrico de los receptores de membrana que ocurren con el entorno biológico complejo dentro de animales vivos sin requerir expresión o reconstitución heteróloga. Mediante el empleo de la Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRFM), logramos imágenes de resolución de una sola molécula de receptores encapsulados en vesículas y extraemos trazas de fotoblanqueo para determinar la composición de las subunidades.

TIRFM es muy adecuado para la obtención de imágenes de proteínas de membrana de una sola molécula porque excita selectivamente los fluoróforos dentro de ~ 150 nm de la superficie del vidrio, reduciendo la fluorescencia de fondo de las moléculas en la solución 3,10. Este confinamiento mejora significativamente la relación señal-ruido, lo que permite una detección precisa de complejos de receptores de membrana individuales. Mediante el análisis del fotoblanqueo escalonado de receptores marcados con fluorescencia, podemos determinar directamente la estequiometría de subunidades y evaluar la heterogeneidad potencial dentro de las poblaciones de receptores12. Esto es particularmente relevante para el receptor 2 de Ryanodina 2 (RyR2), un gran canal de liberación intracelular de Ca²⁺ que desempeña un papel crucial en el acoplamiento excitación-contracción en el corazón, donde solo se ensambla como un homotetrámero, y en la función sináptica en el cerebro, donde no se ha establecido su ensamblaje 1,13,14. Dada la presencia de múltiples isoformas de RyR en los tejidos neuronales, no está claro si RyR2 forma complejos de tetrámeros puramente homoméricos en el cerebro, que constan de cuatro subunidades idénticas a las del corazón, o si los ensamblajes heterómeros con RyR1 o RyR3 ocurren in vivo 15,16,17,18.

Al aislar vesículas de regiones específicas del corazón y el cerebro, este método permite la investigación de posibles diferencias específicas de tejido en la organización de RyR2. Aprovechamos las propiedades de RyR2 en el tejido cardíaco donde solo puede formar homotetrámeros para proporcionar una base estadísticamente sólida para la estequiometría de subunidades de una sola molécula ex vivo, y el ensamblaje de tetrámeros conocido sirve como control para investigar ensamblajes desconocidos en otros órganos. La capacidad de obtener imágenes de los receptores en su estado nativo mientras se preservan sus interacciones fisiológicas proporciona un marco sólido para estudiar el ensamblaje de receptores en diferentes órganos y bajo diferentes condiciones fisiológicas. Este protocolo describe el flujo de trabajo para el aislamiento de vesículas, la inmovilización y la obtención de imágenes de una sola molécula de RyR2 marcado con GFP, lo que permite una caracterización precisa de la estequiometría del receptor. Esta técnica no solo avanza en nuestra comprensión de la organización de RyR2 en los tejidos cardíacos y neuronales, sino que también ofrece aplicaciones más amplias para estudiar el ensamblaje y la regulación de receptores en diversos contextos fisiológicos y patológicos 19,20,21.

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Protocolo

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1. Preparación de la muestra

  1. Perfusión transcardíaca y extracción de órganos
    1. Anestesiar al ratón con CO₂ hasta que cese la respiración.
    2. Coloque el ratón en posición supina y asegure las extremidades.
    3. Haga una incisión en la línea media a lo largo del abdomen y extiéndala lateralmente hacia la caja torácica para exponer la cavidad torácica.
    4. Inserte con cuidado una aguja en el ventrículo izquierdo y seccione la aurícula derecha para permitir el drenaje de la perfusión.
    5. Para la preparación de vesículas, perfundir con PBS frío 1x hasta que el sistema circulatorio se limpie de sangre.
    6. Para la criosección, después de la perfusión de PBS, continúe perfundiendo con paraformaldehído (PFA) al 4% para fijar los tejidos.
    7. Extraiga con cuidado el corazón y colóquelo inmediatamente sobre hielo.
    8. Con unas tijeras finas, corte con cuidado a lo largo de la línea media del cuero cabelludo y retire la piel para exponer el cráneo.
    9. Haz una incisión en la base del cráneo cerca del foramen magnum.
    10. Con pinzas finas, abra cuidadosamente el cráneo a lo largo de la fisura longitudinal, eliminando los fragmentos de hueso para exponer el cerebro.
    11. Levanta suavemente el cerebro con pinzas curvas, cortando los nervios craneales para extraerlo completamente intacto.
    12. Si se utiliza para la criosección, fije el cerebro en PFA al 4% a 4 °C durante 24 h.
    13. Si se utiliza para la preparación de vesículas, coloque inmediatamente el cerebro en hielo sin fijación para su posterior procesamiento.
  2. Crioseccionamiento
    1. Retire el cerebro o el corazón del 4% de PFA y séquelo.
    2. Incruste todo el órgano en el compuesto OCT dentro de un criomolde.
    3. Congele el tejido incrustado colocando el molde en un congelador a -80 °C hasta que esté completamente solidificado.
    4. Antes de cortar, equilibre la cámara de criostato y la cabeza de la muestra a -20 °C.
    5. Transfiera el bloque OCT congelado del congelador a -80 °C a la cámara de criostato y deje que se equilibre durante 10 minutos.
    6. Limpie el mandril de la muestra con etanol al 70%, séquelo y aplique una capa delgada de OCT como adhesivo.
    7. Fije el bloque OCT congelado en el mandril, asegurando la orientación correcta.
    8. Inserte el mandril en el portamuestras de criostato y ajuste la posición de la cuchilla.
    9. Recorte el exceso de OCT hasta que la superficie del tejido quede expuesta.
    10. Secciona el tejido a 10 μm de grosor, recogiendo las secciones en portaobjetos de vidrio.
    11. Después de secar las secciones al aire ambiente durante 1 h, aplique medios de montaje sobre las secciones y coloque un cubreobjetos para sellar la muestra.
    12. Deje que el soporte de montaje se asiente antes de almacenar los portaobjetos a 4 °C para la obtención de imágenes.
  3. Preparación de vesículas
    1. Preparación de vesículas cardíacas
      1. Extraiga el corazón después de la perfusión transcárdica con 1x PBS y colóquelo en hielo.
      2. Con un bisturí estéril, diseccione aproximadamente 30 mg de músculo ventricular de la parte inferior del corazón.
      3. Transfiera el tejido a un tubo de centrífuga que contenga 4-5 mL de 10 mM de NaHCO₃ con 5 mM de NaN₃ para mantener la integridad de la vesícula.
      4. Homogeneizar el tejido con un homogeneizador hasta que esté completamente lisado.
      5. Centrifugar el homogeneizado a 10.000 × g durante 20 min para eliminar los residuos grandes y recoger el sobrenadante.
      6. Realice la ultracentrifugación a 37.000 × g durante 65 min, luego deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3-4 mL de tampón Tris-maleato de 20 mM (pH 6,8) con 0,6 M de KCl.
      7. Repita la ultracentrifugación a 37.000 × g durante otros 65 minutos para eliminar la actomiosina solubilizada.
      8. Vuelva a suspender el pellet final en 0,5 mL de tampón Tris-maleato de 20 mM (pH 6,8) con 50 mM de KCl para obtener la solución de vesícula cardíaca y almacenarla a -80 °C.
    2. Preparación de la vesícula encefálica
      1. Extraiga el cerebro después de la perfusión transcárdica con 1x PBS y colóquelo en hielo.
      2. Corta el cerebro en secciones de 1 mm usando una matriz coronal de cerebro de ratón de 1 mm.
      3. Identifique la tercera y cuarta secciones del bulbo olfatorio y diseccione cuidadosamente: 1) la capa cortical más externa de ambos hemisferios; 2) el hipocampo, situado en la región central de la sección.
      4. Desde el extremo posterior, aísla el cerebelo haciendo un corte transversal en su base.
      5. Agrupe las mismas regiones cerebrales de cinco ratones para garantizar un rendimiento adecuado de vesículas.
      6. Homogeneizar el tejido inmediatamente utilizando un homogeneizador Dounce en 2 mL de tampón de homogeneización en frío (0,32 M de sacarosa, 10 mM de HEPES, 2 mM de EDTA, inhibidor de la proteasa, pH 7,4).
      7. Añadir 3 mL de tampón de homogeneización adicional y centrifugar a 200 × g durante 15 min para eliminar los fragmentos de tejido grandes.
      8. Recoger el sobrenadante y centrifugar a 1.000 × g durante 15 min a 4 °C para eliminar la fracción nuclear.
      9. Centrifugar el sobrenadante a 10.000 × g durante 20 min a 4 °C para eliminar las mitocondrias.
      10. Ultracentrífuga el sobrenadante resultante a 100.000 × g durante 2 h a 4 °C para peletizar las vesículas.
      11. Vuelva a suspender el pellet de vesícula final en 1x PBS para obtener la solución de vesícula cerebral y almacene a -80 °C.
  4. Caracterización de nanovesículas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
    1. Ensamble la celda de detección siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Encienda el instrumento e inicie el software compatible.
    3. Cargue una jeringa de 1 ml con agua desionizada (DI) y enjuague manualmente el tubo del sistema hasta que el fondo esté libre de contaminantes.
    4. Prepare la muestra de nanovesículas diluyéndola en 1x PBS.
    5. Cargue ~ 1 mL de la muestra de nanovesícula diluida en una jeringa limpia de 1 mL, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
    6. Inyecte manualmente la muestra en la celda de detección y ajuste el enfoque hasta que las vesículas sean claramente visibles.
    7. Fije la jeringa a la bomba de jeringa y ajuste el caudal a 200 μL/s en el panel de herrajes.
    8. En el panel SOP , establezca la duración de la medición en 60 s, el número de ciclos en 5 y confirme que el control de temperatura esté habilitado y ajustado a 25 °C. Guarde la configuración como un nuevo SOP haciendo clic en Guardar SOP y asignándole al archivo el nombre adecuado (por ejemplo, "nanovesicle_standard.sop").
    9. En el panel Captura, configure los ajustes del instrumento seleccionando un nivel de cámara de 13 y un umbral de detección inicial de 3.
    10. Haga clic en Ejecutar y seleccione el SOP guardado anteriormente. El software llevará a cabo automáticamente la medición de acuerdo con la configuración.
    11. Una vez completado, haga clic en Analizar para procesar cada video. Ajuste el umbral de detección para asegurarse de que todas las partículas sean claramente visibles y haga clic en Finalizar una vez finalizado el análisis por lotes. Exporte el resultado haciendo clic en Exportar datos | Todas las mediciones, y guárdelas como un archivo CSV para su uso posterior.
    12. Después de completar el experimento, enjuague el sistema con ~ 2 mL de agua desionizada hasta que no queden vesículas residuales.
    13. Inyecte aire a través del tubo para eliminar cualquier líquido restante, asegurándose de que el sistema esté seco para el próximo uso.

2. Imágenes

  1. Imágenes confocales de criosecciones de tejidos
    1. Encienda el microscopio confocal de barrido láser y abra el software vinculado.
    2. Seleccione el objetivo apropiado (20 veces aire o 60 veces aceite) y cargue el portaobjetos de criosección preparado en la platina del microscopio.
    3. Configure los ajustes del láser para la excitación GFP utilizando una línea láser de 488 nm con un filtro de emisión de 535/70 nm.
    4. Optimice los parámetros de imagen, incluido el tamaño del orificio (28,9 μm), la intensidad del láser (17%) y la ganancia del detector (15,3), para mejorar la relación señal-ruido y minimizar el fotoblanqueo.
    5. Si es necesario, adquiera una pila Z ajustando los planos focales superior e inferior y definiendo el tamaño de paso adecuado (0,275 μm).
    6. Habilite la unión automatizada de imágenes con una superposición de imágenes del 15 % al adquirir imágenes de área grande.
    7. Ajuste la resolución de la imagen y aplique el promedio de fotogramas si es necesario para reducir el ruido de fondo.
    8. Capture imágenes y guárdelas en formato '.nd2' para su posterior análisis.
  2. Imágenes de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)
    1. Inmovilización de vesículas mediante método de anclaje biocompatible para membrana (BAM)22
      1. Limpie platos con fondo de vidrio de 35 mm sonicándolos en NaOH 5 M durante 1 h a 45 °C, seguido de tres enjuagues minuciosos con agua desionizada.
      2. Sonicar los platos en HCl 0,1 M durante 1 h más a 45 °C, seguido de tres enjuagues adicionales con agua desionizada.
      3. Tratar la superficie del vidrio limpia con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) al 2% en etanol durante 30 min a temperatura ambiente para introducir grupos funcionales de aminas.
      4. Enjuague el plato 3 veces con agua desionizada y etanol para eliminar el exceso de APTES y deje que se seque.
      5. Incubar la placa con 100 μM de Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) en 1x PBS durante 10 min.
      6. Lave el plato con PBS para eliminar el reactivo sin reaccionar.
      7. Introduzca las vesículas a la concentración deseada e incube durante 15 minutos para permitir la unión de las vesículas.
      8. Enjuague el plato suavemente con PBS para eliminar las vesículas sueltas y asegurarse de que las vesículas inmovilizadas permanezcan adheridas.
    2. Configuración y adquisición de imágenes TIRF
      1. Encienda el microscopio de fluorescencia invertida, la fuente láser de 488 nm y la cámara EMCCD.
      2. Inicie el software Metamorph y CellSens para inicializar el control de imágenes.
      3. Limpie el objetivo de inmersión en aceite 60x (1,49 NA APO) con metanol para eliminar el polvo y el aceite residual.
      4. Aplique una pequeña gota de aceite de inmersión correspondiente al índice de refracción (IR) en la lente del objetivo.
      5. Coloque la placa de vesícula preparada en la platina del microscopio, asegurándose de que esté centrada para una alineación óptima.
      6. Ajuste el enfoque del rayo láser centrando el haz de excitación en el centro de la apertura trasera del objetivo en el modo de epifluorescencia.
      7. Utilice el motor paso a paso para ajustar el ángulo de incidencia del láser hasta alcanzar el ángulo crítico, lo que garantiza una reflexión interna total en la superficie del vidrio.
      8. Identifique el plano focal escaneando a través del eje Z, distinguiendo: 1) el primer plano de enfoque, correspondiente a la superficie del fondo de vidrio; 2) el segundo plano de foco, correspondiente a la superficie inmovilizada por vesículas.
      9. Una vez que las vesículas estén enfocadas, aplique el enfoque automático en CellSens para bloquear la posición del objetivo en este plano, evitando la deriva durante la obtención de imágenes.
      10. Apague temporalmente el láser y mueva la platina del microscopio a un campo de visión nuevo que aún no haya sido expuesto a la luz de excitación.
      11. Comience a grabar mientras enciende el láser al mismo tiempo, asegurando la captura del proceso completo de fotoblanqueo sin exposición previa.
      12. Adquiera imágenes con los siguientes parámetros: Tiempo de exposición: 100 ms por fotograma, Modo de adquisición: 900 fotogramas continuos por campo de visión, Ajuste de ganancia: 1.400.
      13. Repita el proceso para varios campos de visión para garantizar una recopilación de datos suficiente.
      14. Guarde las pilas de imágenes en formato TIFF para su posterior procesamiento.

3. Procesamiento de imágenes y análisis de datos

  1. Procesamiento de imágenes confocales
    1. Abra las imágenes confocales adquiridas en el software vinculado.
    2. Ajusta la configuración de la tabla de búsqueda (LUT) para optimizar el brillo y el contraste.
    3. Aplica los mismos ajustes de LUT de manera uniforme en todas las imágenes para mantener la consistencia visual.
  2. Procesamiento de vídeo TIRF y análisis de intensidad de fluorescencia
    1. Procesamiento de vídeo para visualización
      1. Abra las pilas de imágenes TIRF adquiridas (formato TIFF) en ImageJ para su visualización.
      2. Ajuste el brillo y el contraste para mejorar la claridad de la señal, asegurando que las vesículas fluorescentes se distingan fácilmente del fondo.
      3. Exporte imágenes ajustadas para su presentación o análisis cualitativo posterior.
    2. Análisis de las etapas del fotoblanqueo
      1. Extracción de trazas de tiempo
        1. Abra el script de MATLAB (consulte el archivo complementario 1) denominado "getTimeTraces.m" y ejecútelo. En la interfaz gráfica de usuario (GUI), haga clic en Cargar película y seleccione el archivo de .tiff de imágenes TIRF para importar la pila de películas de vesículas.
        2. Haga clic en Buscar picos para identificar automáticamente las señales de fluorescencia de una sola molécula. Las regiones de la señal se marcarán con círculos en la ventana de vista previa.
        3. Haga clic en Rellenar datos. Esto exportará el seguimiento de intensidad de tiempo para cada punto a un archivo de .xlsx para el análisis posterior.
      2. Conteo manual de pasos
        1. Ejecute el script "simpleGraph.m" (consulte el archivo complementario 1) para iniciar la GUI, haga clic en Cargar archivos de datos y seleccione el archivo .xlsx generado en el paso 3.2.2.1.3.
        2. Inspeccione los pasos de blanqueo de cada trazo de tiempo que se muestra en el panel izquierdo. Asegúrese de que solo se acepten para el análisis las trazas que cumplan con los siguientes criterios: 1) la traza de tiempo contiene al menos un paso de blanqueo distinto. 2) La duración de un paso es de al menos 1 s. 3) La diferencia de intensidad entre los niveles de paso es al menos 3 veces la desviación estándar de la intensidad posterior al blanqueo.
        3. A la derecha, ubique el campo Paso # y use los botones + o - para ingresar el número de pasos de fotoblanqueo para cada trazo.
        4. Después de completar cada entrada, haga clic en Siguiente para pasar al siguiente seguimiento. Una vez que se procesan todos los seguimientos, el software generará y guardará automáticamente un archivo de .txt que registra el recuento de pasos de cada seguimiento.
      3. Resumen del recuento de pasos
        1. Ejecute el script "CombinedFiles.m" (consulte el archivo complementario 1) para abrir la GUI.
        2. Escriba el nombre deseado para la salida de resumen en el cuadro de texto.
        3. Haga clic en Combinar varios resultados de simpleGraph en un archivo. En el explorador de archivos, seleccione uno o más archivos .txt deseados generados a partir del paso 3.2.2.2.3. El script compilará automáticamente todos los datos de recuento de pasos y generará un archivo de .xlsx combinado que resume la frecuencia de 1 paso y 2 pasos,... Rastros.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para confirmar la aplicabilidad de este método, primero verificamos la expresión y localización de GFP-RyR2 mediante imágenes confocales de criosecciones de tejido cardíaco y neuronal (Figura 1). La señal de fluorescencia en el tejido cardíaco mostró un patrón estriado transversal consistente con la localización esperada de RyR2 en los cardiomiocitos, pero exhibió una alta intensidad en ciertas regiones del cerebro, a saber, la corteza, el hipocampo y el cere...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio establece un protocolo detallado y reproducible para la encapsulación ex vivo y la obtención de imágenes de una sola molécula de receptores de membrana utilizando RyR2 marcado con GFP como sistema modelo. El protocolo avanza significativamente en los métodos actuales al permitir el análisis estequiométrico de los complejos receptores directamente del tejido nativo, preservando el contexto fisiológico de las proteínas de membrana. En comparación con los sistemas trad...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer al núcleo de microscopía óptica UKY y al Centro de Bioelectrónica y Nanomedicina por el uso de sus instalaciones. Los NIH (GM138837 y GM138882 proporcionaron apoyo para este trabajo). La Figura 2 (https://BioRender.com/s69w811) y la Figura 3 (https://BioRender.com/y54b47) se crearon en BioRender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Plato de 35 mm | No. 1.5 Cubreobjetos | Diámetro de vidrio de 14 mmMattekP35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Moldes/adaptadores Tissue-Tek CryomoldFisher ScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-Aminopropil)trietoxisilano
Bio-Gen PRO200 Homogeneizador de laboratorioPro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsn/a
Cámara EMCCDAndorn/aiXon Ultra 897
Absoluto de etanol ≥ 100% (v/v) USP para biología molecular (200 pruebas)VWR71006-012
Leica CM1860Leican/acriostato
MetaMorph AdvancedMolecular Devicesn/a
Nanosight NS300 (con software Nanosight NTA)Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR Microscopio confocal invertidoNikonn/a
Microscopio de fluorescencia invertida con enfoque automático motorizado Olympus IX83Olympusn/aTIRFM
Paraformaldehído 4% en PBS listo para usar reactivo fijador VWR76221-378
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 20x, grado ultrapuroVWR97062-950
Hidróxido de sodio, perlas, grado reactivoVWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOF America Corporationn/aOleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakuraM71484
VectaMount AQ Medio de montaje acuosoVector LaboratoriesH-5501-60

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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