Este protocolo describe el método CTAB para extraer ADN de alta calidad de micobacterias, superando los desafíos que plantean sus duras paredes celulares ricas en ácido micólico. El proceso implica digestión enzimática, lisis celular con CTAB y purificación del ADN mediante extracción orgánica y precipitación de etanol. Este método produce ADN adecuado para estudios moleculares y es fiable para la investigación micobacteriana.
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Artículo de método
Extracción de ácido desoxirribonucleico de genoma completo de especies de Mycobacterium mediante la técnica de bromuro de cetiltrimetilatonio
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Resumen
Resumen
La extracción eficiente y fiable del ADN es un paso fundamental en la biología molecular, proporcionando material genético de alta calidad para aplicaciones posteriores como PCR, secuenciación y análisis genómicos. Sin embargo, la composición única de la pared celular de las micobacterias, ricas en lípidos y ácidos micólicos, plantea desafíos significativos para un aislamiento eficiente del ADN. El método del bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) se emplea ampliamente debido a su eficacia para extraer ADN de alta pureza de especies micobacterianas, incluyendo cepas de rápido y lento crecimiento. La técnica consiste en la alteración enzimática de las células bacterianas mediante lisozima y proteinasa K, seguida de la lisis de los componentes celulares mediante CTAB, que se une selectivamente y forma un complejo con polisacáridos y proteínas. La purificación y concentración de ADN se logran mediante extracción con disolventes orgánicos y precipitación de etanol. Según nuestros datos, el protocolo CTAB produce grandes cantidades de ADN (200 - 1000 ng/μL) con alta calidad y contaminación mínima, como lo demuestran la electroforesis en gel y el análisis NanoDrop. El ADN extraído de diferentes especies micobacterianas es de alta pureza y es adecuado para diversos estudios moleculares. Este estudio demuestra los pasos procedimentales del método CTAB, destacando su utilidad para superar los desafíos únicos asociados a la extracción de ADN micobacteriano.
Introducción
Extraer ADN de alta calidad es un paso fundamental en la biología molecular, esencial para aplicaciones posteriores como la PCR, la secuenciación del genoma completo y otros estudios genómicos. Para Mycobacterium, un género que incluye tanto especies patógenas, como Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), como especies ambientales no patógenas como Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), la extracción de ADN puede ser complicada debido a sus paredes celulares gruesas, ricas en lípidos ehidrofóbicas 1,2,3. Esta pared celular resistente requiere el uso de métodos especializados de lisis para alterar las células y liberar eficazmente el ADN genómico.
El método de bromuro de cetiltrimetilatonio (CTAB) ha demostrado ser fiable para aislar ADN de alta calidad de varias especiesmicobacterianas 4,5. El CTAB, un tensioactivo catiónico, se une a polisacáridos y otros componentes celulares, facilitando su eliminación durante el procesode extracción 6. Incluso con muestras difíciles, el protocolo basado en CTAB garantiza el aislamiento eficiente de ADN intacto y puro, especialmente cuando se combina con lisis enzimática, tratamiento térmico y extracciones con disolventesorgánicos 7,8. El método CTAB ha desempeñado un papel crucial en la extracción eficiente de ADN de especies micobacterianas, específicamente para investigaciones que involucran secuenciación de genomas completos, metagenómica y diagnóstico molecular, que requieren material de entrada de ADN puroy de alta calidad 9,10. En comparación con otras técnicas de extracción de ADN como el batido de cuentas o los kits comerciales, el protocolo CTAB presentado aquí ofrece una ventaja clara en la preservación de la integridad del ADN, un factor esencial para la secuenciación de lectura larga y aplicaciones epigenéticas. Aunque estudios anteriores han reportado menores rendimientos de ADN con CTAB en comparación con métodos de interrupción mecánica, también enfatizan su capacidad para minimizar el corte de ADN y mantener la integridaddel ADN 11,12. Para abordar las limitaciones en pureza y rendimiento, el protocolo actual ha sido optimizado con tiempos de incubación reducidos y una mayor consistencia entre diversos tipos de muestras. Este refinamiento fue respaldado por hallazgos de Opperman et al., quienes demostraron que el ADN extraído por CTAB de cultivos de Mycobacterium avium tenía suficiente concentración y calidad para aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARNr 16S y ensayos de sonda de línea, apoyando aún más la aplicación del protocolo CTAB como una herramienta versátil y escalable para la investigación micobacteriana, especialmente en estudios que requieren ADN genómico intacto para análisis molecularesavanzados 13. Además, la secuenciación de nueva generación (NGS) generalmente requiere entre 100 y 1000 ng de ADN genómicode alta calidad 14 y, en el caso de la secuenciación de lectura larga, como la secuenciación PacBio, requiere ≥5 μg de ADN15 de alta calidad, por lo que cuando se requieren grandes cantidades de ADN de alta calidad e intacto, el CTAB sigue siendo un métodoeficaz 16.
Es necesario establecer metodologías eficientes, consistentes y eficaces para extraer ADN de microbios difíciles de lisar para garantizar la reproducibilidad y fiabilidad en laboratorios, especialmente para la identificación de cepas y estudiosepidemiológicos 5,7. Este protocolo proporciona detalles para extraer ADN del genoma completo de micobacterias utilizando el método CTAB. El protocolo actual pretende permitir a los investigadores lograr resultados consistentes y fiables en sus flujos de trabajo de biología molecular, abordando los obstáculos y superando los desafíos que plantea la distintiva pared celularmicobacteriana 17.
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Protocolo
Los resultados representativos se generaron con la aprobación del comité de ética REC: BES de la Universidad de Stellenbosch (BES-2024-22504). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de la suspensión de cultivo micobacteriano
NOTA: Dependiendo de la especie examinada, este paso debe realizarse en un laboratorio de nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2) o de nivel 3 (BSL-3). El tiempo de incubación y las condiciones del cultivo también dependen de los requerimientos de crecimiento de la especie micobacteriana debido a sus tasas de crecimiento distintivas y características fisiológicas.
- Preparar 5 mL u 8 mL de cultivo bacteriano en medio líquido Middlebrook 7H9 o en medio MGIT, respectivamente, suplementados con OADC e incubar a 37 °C durante el periodo requerido para permitir el crecimiento bacteriano. Las micobacterias de crecimiento lento requieren entre 10 y 14 días, mientras que las micobacterias de crecimiento rápido requieren aproximadamente 2-5 días.
NOTA: Se puede preparar una suspensión de células micobacterianas raspando un lazo de colonias en agua estéril destilada doblemente si el cultivo inicial proviene de placas sólidas de agar (por ejemplo, Middlebrook 7H10 agar). - Vierte el cultivo líquido en tubos de 15 mL.
- Elimina el cultivo por calor a 80 °C durante 1 hora en una incubadora.
- En el caso de Mycobacterium tuberculosis u otras especies patógenas que requieren BSL-3, transfiere los cultivos que se eliminan por calor al laboratorio de BSL-2.
2. Digestión de la pared celular y extracción de ADN
NOTA: Una vez que el cultivo está inactivado por calor, los siguientes pasos pueden realizarse de forma segura en un laboratorio de nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2). Si el objetivo es la extracción para secuenciación de lectura larga o aplicaciones alternativas que requieran ADN de alto peso molecular, asegúrese de utilizar puntas de pipeta de gran diámetro y, en los pasos del vórtice, sustituya el vórtice por inversión o mezcla de micropipetas.
- Centrifuga el tubo de 15 mL a 3220 x g durante 15-30 minutos a temperatura ambiente (RT). Descarta el sobrenadante transparente (asegúrate de que se elimine todo el medio).
- Resuspende completamente el pellet de cultivo en 300 μL de tampón Tris-EDTA (TE).
- Transfiere el pellet resuspendido a un tubo de 2 mL.
- Añade 100 μL de lisozima (10 mg/mL) y mezcla pipeteando arriba y abajo 5 veces, luego golpea suavemente el tubo para asegurar una dispersión uniforme.
- Incubar la mezcla a 37 °C en una incubadora rotatoria durante la noche (~16 h; un tiempo de incubación más bajo puede reducir la eficiencia de la lisis y, por tanto, conducir a un bajo rendimiento de ADN).
- Al día siguiente, prepara una mezcla de 5 μL de proteinasa K (10 mg/mL) y 70 μL de SDS al 10%. Por ejemplo, si hay cinco muestras, prepare 350 μL de SDS al 10% y 25 μL de Proteinasa K. Mezcle invirtiendo el tubo para evitar la formación de espuma.
- Añade 75 μL de la mezcla a cada muestra.
- Mezcla con pico e incuba a 65 °C durante 10 minutos en una incubadora o bloque calefactor, mezclando de forma intermitente por inversión.
- Añade 100 μL de 5 M NaCl.
- Añade 100 μL de solución CTAB/NaCl precalentada a 65 °C.
NOTA: Calienta la solución CTAB/NaCl a 65 °C antes de asegurar la precisión del pipeteo, teniendo en cuenta la viscosidad de la sustancia en RT. - Mezcla golpeando hasta que la solución se vuelva lechosa.
- Incubar a 65 °C durante 10 minutos en una incubadora o bloque calefactor, con mezcla intermitente por inversión.
- Añade un volumen igual (~ 675 μL) de solución de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) a cada muestra y mezcla por golpecito.
NOTA: Realiza este paso en una campana extractora, ya que el cloroformo es tóxico si se inhala y requiere un manejo cuidadoso. - Centrifuga las muestras a 12000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Aspira cuidadosamente entre 550 y 600 μL de la fase acuosa (superior) en tubos estériles de 1,5 mL y etiquetalos adecuadamente.
NOTA: Ten cuidado de no mover las otras capas. Si alguna capa se rompe inadvertidamente, centrifuga el tubo de nuevo.
3. Precipitación y elución del ADN
- Añade un volumen igual (550-600 μL) de isopropanol bien frío y mezcla invirtiendo los tubos.
NOTA: Si la concentración de ADN es alta, puede formarse precipitación blanca durante la mezcla. - Incuba los tubos a -20 °C durante 30 minutos a 1 hora.
NOTA: Tiempos de incubación más largos pueden potenciar la precipitación deADN 18 , pero también pueden provocar la coprecipitación de sales. Por tanto, se puede realizar incubación nocturna si se espera una baja concentración de ADN. - Centrifugar a la máxima velocidad (~21130 x g) durante 30 minutos a temperatura ambiente para pelletar el ADN insoluble.
NOTA: Asegúrate de que la parte delantera de los tubos de 1,5 mm esté orientada hacia dentro en el rotor de la centrífuga. En este paso, el ADN precipita en la parte inferior y a lo largo de la parte trasera de los tubos. Esto es importante para evitar molestar la boluleta posiblemente invisible en el siguiente paso. Puede verse un precipitado o pellet blanco si la concentración de ADN es alta. La ausencia de un pellet no indica una extracción fallida; Procede con los pasos restantes. - Aspira el sobrenadante por la parte frontal del tubo sin alterar la pelota de ADN ni decantarla rápidamente, asegurando que la pelota permanezca intacta.
NOTA: Es mejor aspirar el sobrenadante si el cultivo inicial es pequeño y se espera una baja concentración de ADN. - Añade 1000 μL de etanol al 75% bien frío.
- Mezcla invirtiendo los tubos varias veces.
- Centrifuga a 12000 × g durante 30 minutos (en la misma orientación que en el paso 3).
- Aspira o decanta todo el etanol sin alterar el pellet.
NOTA: Los pasos 5-8 pueden repetirse si se anticipa una coprecipitación alta de sal. - Deja que los tubos se sequen al aire en RT durante la noche o al menos durante 30 minutos.
- Añade entre 25 y 50 μL de tampón TE (pH 8) a cada tubo para resuspender el ADN.
NOTA: El ADN puede ser resuspendido en Tampón Tris (10 mM, pH 8) o en agua libre de nucleasa si las aplicaciones aguas abajo son sensibles a EDTA. - Deja que la cápsula de ADN se resuspenda durante la noche a 4 °C.
- Guarda a 4 °C durante 2-3 días antes de realizar una evaluación de control de calidad.
- Guárdalos a -80 °C durante mucho tiempo.
4. Cuantificación del ADN y control de calidad
NOTA: El control de calidad del ADN generalmente se realiza utilizando un espectrofotómetro de microvolumen y electroforesis en gel. También se puede utilizar un sistema de cuantificación basado en fluorescencia para cuantificar el ADN extraído.
- Método del espectrofotómetro
- Mide la concentración de ADN y determina la calidad siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA: Idealmente, una muestra de ADN tiene una relación de 260/280 entre 1,7 y 2,0. Un valor de 1,8 suele considerarse puro para el ADN. Los valores por debajo de este rango indican contaminación por proteínas residuales, guanidina u otros reactivos que se absorben fuertemente en o cerca de 280 nm. Una proporción de 260/230 entre 2,0 y 2,2 es ideal. Si la proporción es menor de lo esperado, esto puede indicar la presencia de contaminantes que se absorben a 230 nm, como EDTA, fenol y carbohidratos. Consulta también los gráficos de absorbancia obtenidos para la muestra.
- Mide la concentración de ADN y determina la calidad siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Electroforesis
- Realizar electroforesis en gelde agarosa 19 para evaluar la integridad del ADN y determinar si ha ocurrido fragmentación o degradación.
- Para visualizar el ADN bajo el sistema de documentación del gel UV, utiliza un gel de agarosa al 1,0% que contiene un tinte seguro para SYBR. Haz correr el gel a 80 V durante 45 minutos.
NOTA: El objetivo es tener bandas claras, distintas y de alto peso molecular por encima de la banda más alta de la escalera de ADN. Usa un buffer TAE nuevo de 1× cada vez.
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Resultados
Este protocolo de extracción de ADN utilizando el método CTAB (Figura 1) fue evaluado en varias especies micobacterianas como M. tuberculosis, M. abscessus y M. chelonea. Se extrajo y comparó ADN en cuanto al rendimiento, pureza e integridad del ADN extraído entre muestras.
La concentración de ADN varió entre las especies micobacterianas y osciló entre 190-600 ng/μL y >1000 ng/μL en algunos casos, lo que...
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Discusión
Los resultados representativos demuestran la utilidad del método CTAB para extraer ADN de especies micobacterianas y abordar los desafíos asociados a la extracción de ADN de estos organismos. Las micobacterias son bien conocidas por sus complejas y ricas en lípidosde las paredes celulares 2. Los resultados actuales destacan varios aspectos críticos que contribuyen al éxito de esta técnica, ya que proporciona ADN intacto de alta concentración y alta calidad que deb...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.
Agradecimientos
Los autores expresan su sincero agradecimiento al equipo de genómica de la TB: Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa y Rob M Warren, por sus contribuciones al desarrollo y optimización de este protocolo, así como por su invaluable apoyo a lo largo de este estudio. Este trabajo y las personas implicadas contaron con el apoyo de subvenciones y financiación del Consejo Sudafricano de Investigación Médica (SAMRC), la Fundación Nacional de Investigación (NRF) y la Universidad de Stellenbosch (SU). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos, el análisis o la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Puntas de pipeta de 1 mL | Cualquier proveedor | ||
| 10 & micro; Puntas de la pipeta en L | Cualquier proveedor | ||
| Dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| Tubos de polipropileno de 15 mL | Cualquier proveedor | ||
| Tubos de 2 ml y tubos de 1,5 ml | Cualquier proveedor | ||
| 200 y micro; Puntas de la l de la pipeta | Cualquier proveedor | ||
| 2-PROPANOL, BIOREACTIVO, PARA B MOLECULAR Y | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L | Almacenar en -20 y grados; C |
| 37° Incubadora C | Cualquier proveedor | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65 y grado; Incubadora C | Cualquier proveedor | ||
| Gel de agarosa | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Sistema de documentación de gel UV Bio-Rad, | BioRad | ||
| Centrifuge (para tubos de 15 ml de 50 ml) y Microfuge (para tubos de 2 ml) | Cualquier proveedor | ||
| CLOROFORMO PARA ANÁLISIS EMPARTA ® ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) | En una campana extractora, mezcla 384 ml de cloroformo y 16 ml de alcohol isoamílico | ||
| Solución CTAB/NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | Disuelve 4,1 g de NaCl en 80 ml de agua destilada. Mientras remueve, añade 10 g de CTAB. Solución térmica a 65°C; Incubadora C. Ajusta el volumen a 100 ml con agua destilada. Guárdalo a temperatura ambiente hasta 6 meses. |
| Escalera de ADN 1 Kb | Thermo Fisher Scientific | ||
| ALCOHOL ETÍLICO, PURO, 200 GRADOS, PARA MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Mezcla 75 ml de etanol absoluto y 25 ml de agua destilada |
| Lisozima (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Reconstituye la lisozima liofilizada (llevada a temperatura ambiente) con agua destilada a 10 mg/ml |
| Medios de Middlebrook 7H9 | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Sigue las directrices del fabricante para preparar el medio líquido |
| ENRIQUECIMIENTO MIDDLEBROOK OADC 6 x 100 ml F | BD | 212240 | |
| Medio del Tubo Indicador de Crecimiento de Micobacterias (MGIT) | BD | 245122 | |
| Sistema NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pipeta P10 | Cualquier proveedor | ||
| Pipeta P1000 | Cualquier proveedor | ||
| Pipeta P200 | Cualquier proveedor | ||
| Proteinasa K, recomposición, PCR grd 2x250mg | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Reconstituir el vial de la Proteinasa K liofilizada con agua destilada a 10 mg/ml. Congelar alicotas en tubos de 2 ml a -20 ºC; C |
| Seguro para SYBR | Thermo Fisher Scientific | ||
| pH del tampón Tris/EDTA (TE) 8,0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP o 382499997 | |
| Vórtice | Cualquier proveedor |
Referencias
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
- Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
- Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
- Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
- Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
- Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
- Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
- Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
- Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
- Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
- Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
- Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
- Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
- Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
- Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
- Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
- Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
- Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
- Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
- Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).
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