Este protocolo describe el método CTAB para extraer ADN de alta calidad de micobacterias, superando los desafíos que plantean sus duras paredes celulares ricas en ácido micólico. El proceso implica digestión enzimática, lisis celular con CTAB y purificación del ADN mediante extracción orgánica y precipitación de etanol. Este método produce ADN adecuado para estudios moleculares y es fiable para la investigación micobacteriana.
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Artículo de método
Extracción de ácido desoxirribonucleico de genoma completo de especies de Mycobacterium mediante la técnica de bromuro de cetiltrimetilatonio
En este artículo
Resumen
Resumen
La extracción eficiente y fiable del ADN es un paso fundamental en la biología molecular, proporcionando material genético de alta calidad para aplicaciones posteriores como PCR, secuenciación y análisis genómicos. Sin embargo, la composición única de la pared celular de las micobacterias, ricas en lípidos y ácidos micólicos, plantea desafíos significativos para un aislamiento eficiente del ADN. El método del bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) se emplea ampliamente debido a su eficacia para extraer ADN de alta pureza de especies micobacterianas, incluyendo cepas de rápido y lento crecimiento. La técnica consiste en la alteración enzimática de las células bacterianas mediante lisozima y proteinasa K, seguida de la lisis de los componentes celulares mediante CTAB, que se une selectivamente y forma un complejo con polisacáridos y proteínas. La purificación y concentración de ADN se logran mediante extracción con disolventes orgánicos y precipitación de etanol. Según nuestros datos, el protocolo CTAB produce grandes cantidades de ADN (200 - 1000 ng/μL) con alta calidad y contaminación mínima, como lo demuestran la electroforesis en gel y el análisis NanoDrop. El ADN extraído de diferentes especies micobacterianas es de alta pureza y es adecuado para diversos estudios moleculares. Este estudio demuestra los pasos procedimentales del método CTAB, destacando su utilidad para superar los desafíos únicos asociados a la extracción de ADN micobacteriano.
Introducción
Extraer ADN de alta calidad es un paso fundamental en la biología molecular, esencial para aplicaciones posteriores como la PCR, la secuenciación del genoma completo y otros estudios genómicos. Para Mycobacterium, un género que incluye tanto especies patógenas, como Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), como especies ambientales no patógenas como Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), la extracción de ADN puede ser complicada debido a sus paredes celulares gruesas, ricas en lípidos ehidrofóbicas 1,2,3
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Protocolo
Los resultados representativos se generaron con la aprobación del comité de ética REC: BES de la Universidad de Stellenbosch (BES-2024-22504). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de la suspensión de cultivo micobacteriano
NOTA: Dependiendo de la especie examinada, este paso debe realizarse en un laboratorio de nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2) o de nivel 3 (BSL-3). El tiempo de incubación y las condiciones del cultivo también dependen de los requerimientos de crecimiento de la especie micobacteria....
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Resultados
Este protocolo de extracción de ADN utilizando el método CTAB (Figura 1) fue evaluado en varias especies micobacterianas como M. tuberculosis, M. abscessus y M. chelonea. Se extrajo y comparó ADN en cuanto al rendimiento, pureza e integridad del ADN extraído entre muestras.
La concentración de ADN varió entre las especies micobacterianas y osciló entre 190-600 ng/μL y >1000 ng/μL en algunos casos, lo que.......
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Discusión
Los resultados representativos demuestran la utilidad del método CTAB para extraer ADN de especies micobacterianas y abordar los desafíos asociados a la extracción de ADN de estos organismos. Las micobacterias son bien conocidas por sus complejas y ricas en lípidosde las paredes celulares 2. Los resultados actuales destacan varios aspectos críticos que contribuyen al éxito de esta técnica, ya que proporciona ADN intacto de alta concentración y alta calidad que deb.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.
Agradecimientos
Los autores expresan su sincero agradecimiento al equipo de genómica de la TB: Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa y Rob M Warren, por sus contribuciones al desarrollo y optimización de este protocolo, así como por su invaluable apoyo a lo largo de este estudio. Este trabajo y las personas implicadas contaron con el apoyo de subvenciones y financiación del Consejo Sudafricano de Investigación Médica (SAMRC), la Fundación Nacional de Investigación (NRF) y la Universidad de Stellenbosch (SU). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos, el análisis o la preparación del manusc....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Puntas de pipeta de 1 mL | Cualquier proveedor | ||
| 10 & micro; Puntas de la pipeta en L | Cualquier proveedor | ||
| Dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| Tubos de polipropileno de 15 mL | Cualquier proveedor | ||
| Tubos de 2 ml y tubos de 1,5 ml | Cualquier proveedor | ||
| 200 y micro; Puntas de la l de la pipeta | Cualquier proveedor | ||
| 2-PROPANOL, BIOREACTIVO, PARA B MOLECULAR Y | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L | Almacenar en -20 y grados; C |
| 37° Incubadora C | Cualquier proveedor | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65 y grado; Incubadora C | Cualquier proveedor | ||
| Gel de agarosa | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Sistema de documentación de gel UV Bio-Rad, | BioRad | ||
| Centrifuge (para tubos de 15 ml de 50 ml) y Microfuge (para tubos de 2 ml) | Cualquier proveedor | ||
| CLOROFORMO PARA ANÁLISIS EMPARTA ® ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) | En una campana extractora, mezcla 384 ml de cloroformo y 16 ml de alcohol isoamílico | ||
| Solución CTAB/NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | Disuelve 4,1 g de NaCl en 80 ml de agua destilada. Mientras remueve, añade 10 g de CTAB. Solución térmica a 65°C; Incubadora C. Ajusta el volumen a 100 ml con agua destilada. Guárdalo a temperatura ambiente hasta 6 meses. |
| Escalera de ADN 1 Kb | Thermo Fisher Scientific | ||
| ALCOHOL ETÍLICO, PURO, 200 GRADOS, PARA MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Mezcla 75 ml de etanol absoluto y 25 ml de agua destilada |
| Lisozima (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Reconstituye la lisozima liofilizada (llevada a temperatura ambiente) con agua destilada a 10 mg/ml |
| Medios de Middlebrook 7H9 | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Sigue las directrices del fabricante para preparar el medio líquido |
| ENRIQUECIMIENTO MIDDLEBROOK OADC 6 x 100 ml F | BD | 212240 | |
| Medio del Tubo Indicador de Crecimiento de Micobacterias (MGIT) | BD | 245122 | |
| Sistema NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pipeta P10 | Cualquier proveedor | ||
| Pipeta P1000 | Cualquier proveedor | ||
| Pipeta P200 | Cualquier proveedor | ||
| Proteinasa K, recomposición, PCR grd 2x250mg | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Reconstituir el vial de la Proteinasa K liofilizada con agua destilada a 10 mg/ml. Congelar alicotas en tubos de 2 ml a -20 ºC; C |
| Seguro para SYBR | Thermo Fisher Scientific | ||
| pH del tampón Tris/EDTA (TE) 8,0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP o 382499997 | |
| Vórtice | Cualquier proveedor |
Referencias
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the ....
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Reimpresiones y permisos
