Describimos un protocolo para medir los contactos entre células en capas epiteliales adyacentes en discos imaginales de ala de Drosophila vivos utilizando un enfoque basado en la reconstitución de GFP.
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Artículo de método
Un sistema de expresión dual basado en la complementación de GFP para evaluar el contacto célula-célula mediado por citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila vivos
En este artículo
Resumen
Resumen
El crecimiento y el patrón del tejido embrionario están controlados en gran medida por señales intercambiadas localmente entre poblaciones celulares dentro de los propios tejidos. Los citonemas son un tipo de filopodios de señalización identificados por primera vez en Drosophila que conectan y median el intercambio entre las células productoras y receptoras de señales. En el disco imaginal del ala de Drosophila en desarrollo, los citonemas están involucrados en el intercambio de señales entre distintas poblaciones de células dentro del epitelio propio del disco (DP), que formará el ala adulta, así como entre las células DP y las células en los tejidos adyacentes asociados al disco. Los citonemas hacen sinapsis con las células diana para formar contactos íntimos con la membrana.
Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar el contacto mediado por citonema entre las células DP y las células del epitelio de la membrana peripodial adyacente (PerM), que está separado de las células DP por la luz del disco, utilizando un enfoque de reconstitución de GFP en discos de alas vivas. Utilizando los sistemas GAL4-UAS y LexA-LexAop, se expresan fragmentos complementarios de GFP dividida (spGFP1-10, spGFP11), cada uno fusionado con el dominio transmembrana de CD4, a ambos lados de la luz del disco. La obtención de imágenes de la fluorescencia GFP reconstituida en preparaciones de discos de ala viva mediante microscopía confocal se utiliza para generar pilas de imágenes a partir de las cuales se puede localizar y cuantificar la fluorescencia GFP reconstituida. Con este sistema, es posible coexpresar transgenes de interferencia de ARN o codificación de proteínas en células productoras de citonema o diana para medir su efecto en los contactos celulares DP-PerM. Este sistema, fácilmente adaptable a otros tejidos, permite así la identificación de factores importantes para la formación o función del citonoma.
Introducción
El desarrollo de los tejidos embrionarios está controlado por células ubicadas en "centros organizadores" que envían señales a las células distantes dentro de un tejido, controlando sus decisiones para proliferar (es decir, crecer y dividirse) o adoptar destinos particulares1. Esta señalización celular no autónoma está mediada por ligandos producidos por la organización de células centrales que forman gradientes de concentración a través de los tejidos y provocan respuestas dependientes de la concentración. En muchos casos, estos ligandos se entregan o se recogen a través de filopodios de señalización basados en actina larga llamados citonemas que conectan las células emisoras y receptoras de señales en los tejidos 2,3. Descubiertos por primera vez enel disco imaginal 4 del ala de Drosophila, los citonemas también se han identificado en mamíferos y otros vertebrados 5,6,7,8,9. Una mejor comprensión del papel de los citonemas en la señalización celular no autónoma, mientras se encuentra en una etapa temprana, es crucial para descifrar cómo las células se comunican para organizarse en tejidos y cómo estas líneas de comunicación se modifican en diversas condiciones patológicas, incluidas las malformaciones del desarrollo y el cáncer.
Los citonemas pueden extenderse desde las células de origen para entregar ligandos a las células diana o desde las células diana para recibir ligandos cerca de sus fuentes 2,3. Los citonemas hacen contactos íntimos con sus objetivos, donde se cree que forman estructuras similares a sinapsis, donde puede ocurrir la transferencia de ligandos 3,10,11. Este contacto puede ocurrir entre las puntas de los citonemas fuente y diana o entre los citonemas y los cuerpos celulares3. Aunque no se caracteriza ampliamente, la adhesión celular a través de moléculas de adhesión o a través de interacciones receptor-ligando es, en algunos casos, necesaria para la activación adecuada de eventos de señalización aguas abajo 12,13,14, lo que lo convierte en un aspecto importante de la biología del citonoma.
Varios estudios han aplicado la técnica de "reconstitución de GFP a través de socios sinápticos" (GRASP) al análisis de contactos de citonemas. Este método fue desarrollado para identificar y mapear socios sinápticos en sistemas nerviosos complejos15. Se basa en la expresión de los dos fragmentos complementarios de split-GFP (spGFP1-10 y spGFP11), cada uno fusionado con la región extracelular de un dominio transmembrana (por ejemplo, de CD4), en diferentes poblaciones de células. Si las membranas plasmáticas de las células de esas dos poblaciones entran en contacto directo, se acercan los dominios complementarios de spGFP, lo que lleva a la reconstitución de la fluorescencia de GFP. Este enfoque se ha utilizado en Drosophila para identificar la existencia de contactos de citonema entre las células dentro del disco del ala y entre el disco del ala y otros tejidos estrechamente opuestos 12,16,17,18,19,20,21.
Este artículo describe la aplicación de GRASP a la caracterización de contactos entre dos capas epiteliales morfológicamente distintas del disco imaginal del ala de Drosophila, el disco propiamente dicho (DP) y la membrana peripodial (PerM). Estas capas epiteliales forman un saco que rodea una luz central, con las células DP columnares pseudoestratificadas ubicadas en un lado y las células PerM escamosas en el otro, ambas con sus membranas apicales orientadas hacia adentro hacia la luz (Figura 1A). Existe alguna evidencia de señalización translumenal entre las dos capas 22,23,24,25, y recientemente documentamos la señalización de la DP para controlar la proliferación de células PerM mediada por citonemas apicales en la DP21. Este protocolo implica el uso de los sistemas de expresión transgénica GAL4 / UAS y LexA / LexAop para expresar fragmentos complementarios de spGFP fusionados con CD4 en las membranas de las células DP y PerM. Utiliza fluorescencia GFP reconstituida para leer el contacto de la membrana entre las dos poblaciones celulares.
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Protocolo
El controlador de protuberancia-GAL4 se utiliza para expresar CD4-spGFP1-10 específicamente en la región de la bolsa del ala del DP (Figura 1A). El controlador PerM-LexA21 se utiliza para expresar CD4-spGFP11 específicamente en el PerM (Figura 1A). Estos dos sistemas de expresión son independientes entre sí, lo que permite la expresión simultánea y específica de diferentes transgenes en DP y PerM (Figura 1B, C).
El esquema genético básico implica el cruce de moscas para generar larvas del genotipo nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Como control negativo, dejamos fuera el transgén LexAop-CD4-spGFP11 . Otros transgenes (por ejemplo, ARN bicatenario codificante de proteínas) se pueden expresar según se desee en la capa DP (bajo el control de secuencias UAS ) o en el PerM (bajo el control del operador LexA).
Este es un protocolo de imágenes en vivo que no se puede interrumpir. La preparación del material se estima en ~ 10 min. Las disecciones no deben realizarse durante más de 20 minutos a la vez antes de la obtención de imágenes. Las imágenes tardan ~30 min y no deben durar más de ~1 h. Para múltiples afecciones o un alto número de muestras, el procedimiento debe llevarse a cabo en múltiples rondas para garantizar los mejores resultados.
1. Preparación del material
- Antes de la disección, limpie las pinzas, una placa de depresión de vidrio de 9 pocillos (u otro recipiente adecuado para recolectar y limpiar larvas) y una placa de Petri reutilizable recubierta de Sylgard (silicona) utilizada para la disección con etanol al 70%.
- Prepare portaobjetos de microscopio realizando un lavado con etanol al 70% y luego pegando un espaciador de imágenes al portaobjetos seco. Corte pocillos individuales de la tira de 8 pocillos con unas tijeras y córtelos por la mitad (Figura 2A). Retire el respaldo protector de un lado de cada mitad y pegue los espaciadores a la corredera, espaciados ligeramente para crear un espacio protegido en el medio donde se colocarán los discos (Figura 2B).
NOTA: En nuestra experiencia, esto simplifica el montaje de la muestra, ya que el volumen preciso de medio transferido al portaobjetos es menos crítico. Cualquier pequeño exceso de volumen simplemente fluirá a través del espacio al cubrirse. Como obtenemos imágenes durante un tiempo relativamente corto (generalmente ~ 1 h), no experimentamos ningún problema con el secado medio. - Descongele el medio de imágenes en vivo (medio Drosophila de Schneider sin suplementar almacenado en alícuotas congeladas de 10 ml) y manténgalo fácilmente accesible en un cubo de hielo.
- En un tubo de microcentrífuga de 2 ml, mezcle 1,5 ml de medio con 20 μl de 200 μg/ml de Hoechst 33342 (concentración final de 2,7 μg/ml). Mantenga el tubo en hielo.
NOTA: Esta forma específica de tinte Hoechst se usa porque es altamente permeable a la membrana. PRECAUCIÓN: Se deben usar guantes al manipular Hoechst 33342. Las herramientas deben lavarse después de su uso.
2. Disección del disco del ala y preparación del deslizamiento
- Después del cruce genético y la cría a 25 ° C, recoja las larvas errantes del tercer estadio del tubo y lávelas en un medio frío de imágenes en vivo en una placa de depresión de vidrio de 9 pocillos.
NOTA: Los citonemas son muy frágiles. En los siguientes pasos, se debe tener cuidado de manipular los tejidos alrededor de los discos, tratando de evitar el contacto directo entre los discos y las herramientas de disección. Preparamos tres o cuatro larvas a la vez, ya que es inevitable dañar algunos discos, y esto solo puede notarse durante los pasos de imagen. - Bajo el microscopio de disección, transfiera las larvas a una gota de medio de imagen en vivo en una placa de Petri recubierta de silicona y comience a diseccionar con dos pinzas de disección. Para hacerlo, primero mantenga firme la cabeza y la parte anterior del cuerpo pellizcando las larvas con un par de fórceps a aproximadamente un tercio de la longitud del cuerpo (desde la parte anterior). Con el segundo par de fórceps, pellizque el cuerpo justo después del primer fórceps. Luego, retire la parte posterior de las larvas para aislar la "mitad" anterior.
- Invierta la mitad anterior asegurándola con un par de pinzas a cada lado del extremo cortado y empujando la cabeza con el otro par (como si girara un calcetín al revés), para exponer las estructuras internas, incluidos los discos imaginales, la tráquea, las glándulas salivales, el cuerpo graso y el intestino.
- Retire con cuidado las glándulas salivales, el cuerpo graso y el intestino, teniendo cuidado de no perturbar los troncos laterales de la tráquea, que deben recubrir y proteger los discos de las alas.
- Use fórceps para transferir cuidadosamente las mitades anteriores limpias con los discos de las alas adheridas a una gota de medio limpio de imágenes en vivo con Hoechst, colocada entre los espaciadores en un portaobjetos preparado (Figura 2C). Aísle los discos de las alas del resto de los tejidos diseccionándolos suavemente de las ramas finas de la tráquea que se conectan al disco, usando una hoja de las pinzas de disección o un alambre fino de tungsteno conectado a un portaagujas de disección. Deseche el resto de la carcasa.
- Oriente los discos con una cuchilla de las pinzas de disección o la aguja de disección de alambre de tungsteno. Debido a su forma aplanada en forma de lágrima, los discos de las alas caerán con el DP o el PerM hacia arriba. Para este protocolo, oriente todos los discos con el lado PerM hacia arriba.
- Ajuste el volumen del medio para llenar el pocillo por completo, ligeramente por encima del nivel del espaciador de imágenes, agregando o quitando el medio según sea necesario. Retire el respaldo protector de la parte superior de cada mitad del espaciador de imágenes y luego baje con cuidado un cubreobjetos sobre la muestra. Presione suavemente el cubreobjetos donde entra en contacto con los espaciadores de imágenes (por ejemplo, con el extremo redondeado de las pinzas de disección) para asegurarse de que el cubreobjetos se adhiera al espaciador.
NOTA: El nivel medio debe estar ligeramente por encima de la altura del espaciador para evitar atrapar burbujas de aire, pero no tan alto como para generar un flujo significativo cuando se baja el cubreobjetos.
3. Imágenes
- Tome imágenes de muestras a temperatura ambiente utilizando un microscopio confocal (láser de iones de argón con una longitud de onda de 488 nm para GFP, láser UV con una longitud de onda de 350 nm para Hoechst) equipado con una lente de inmersión en aceite de 40x/1,30 NA y software de microscopía. Adquiera pilas de imágenes con un tamaño de paso de 1 μm que se extiendan desde justo por encima del nivel más alto de la PerM (donde disminuye la fluorescencia de Hoechst) hasta el lado basal de la DP, que generalmente equivale a más de 100 imágenes por pila. Adquiera pilas de imágenes repetidas para generar películas de lapso de tiempo.
NOTA: Imaginamos una diapositiva durante no más de ~ 1-2 h. - Para la configuración del software del microscopio, adquiera imágenes utilizando codificación de 8 bits, promedio de línea de 2, ganancia del detector generalmente entre 650 y 750 y pistas de canales separadas para reducir el sangrado de la señal. Utilice configuraciones idénticas de láser y detector para todas las condiciones, predeterminadas mediante la realización de pruebas en cada condición de antemano.
NOTA: Con un aumento de 40x, nuestras imágenes tienen una resolución de 5,0386 píxeles por μm (tamaño de píxel: 0,1985 x 0,1985 μm2). En nuestra configuración, la configuración óptima del microscopio confocal incluía la mayor intensidad de láser posible (sin dañar el tejido) para capturar la mayor cantidad de señal posible, mientras que al mismo tiempo producía poca o ninguna saturación; y el ruido más bajo posible evaluado en controles negativos, logrado al reducir el desplazamiento del detector y la velocidad de adquisición (si es necesario). Por lo general, utilizamos menos del 5% de potencia láser y velocidad máxima del cabezal de escaneo ('9' en la configuración del software Zen). Una sola pila de imágenes suele tardar ~ 1 min 45 s en adquirirse, y las imágenes se toman cada 2-3 min para los análisis de lapso de tiempo.
4. Análisis de imágenes
- Pilas de proyectos utilizando la función de proyección de máxima intensidad del paquete de software ImageJ (haga clic en la imagen | Pilas | Z, seleccione Intensidad máxima en el menú).
- En las imágenes MIP, determine el área de la bolsa del ala en función del patrón de plegado del disco del ala (utilizando el canal de Hoechst) utilizando la selección de polígonos. Utilice la misma selección en el canal GFP con la función Borrar exterior (haga clic en Editar | Borrar exterior) para establecer cada valor de píxel exterior en 0.
- En las imágenes MIP, use el canal Hoechst para limpiar las imágenes GFP, eliminando específicamente cualquier mancha artefactual que aparezca en ambos canales estableciendo el valor de píxel en cuestión en 0 (haga clic en Selección de polígono, luego en Editar | borrar).
- En las imágenes MIP limpias, utilice la función Histograma (haga clic en Analizar | Histograma | List) para obtener y copiar la lista de todos los valores de píxeles en una tabla de una hoja de cálculo.
- Establezca un valor umbral basado en el análisis de la señal de fondo en controles negativos (y luego verificado en otras muestras; consulte la discusión).
- Calcule el porcentaje de superficie positiva para GFP utilizando la siguiente fórmula:
% de superficie positiva para GFP =
× 100 - Normalice los datos al final dividiendo cada valor por la media de la condición de referencia (que se establece en 1).
NOTA: Píxel válido = píxel con un valor ≥ 1, ignorando efectivamente cualquier píxel eliminado cuyo valor se estableció en 0. Los valores de píxel de 0 no se producen de forma natural. - Para determinar en qué parte de los discos se localiza la señal GFP reconstituida, use cortes XZ de pilas de imágenes para observar el eje apicobasal del epitelio del disco. Realice los cortes en Fiji sin interpolación y aumente la altura de la imagen en el eje Z utilizando la función Escala con interpolación bilineal para mejorar la visibilidad.
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Resultados
Para probar la utilidad del procedimiento GRASP para medir los contactos entre las células DP y PerM, examinamos discos de alas de cuatro genotipos diferentes: discos de control negativo de tipo salvaje (genotipo: w1118) que solo mostrarán niveles de fondo de autofluorescencia en el canal GFP; discos que expresan el CD4-spGFP1-10 en la capa DP, pero carecen del transgén CD4-spGFP11, que mostrará el nivel de fluorescencia producido por GFP1-10 solo (que esperábamos que fuera insignificante, ya que GFP1...
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Discusión
Los citonemas juegan un papel importante en la distribución de ligandos, controlando el crecimiento y la organización de los tejidos en desarrollo. El intercambio de señales tiene lugar donde las puntas de los citonemas hacen contactos íntimos de la membrana con sus objetivos. En este protocolo, describimos un método simple para analizar los contactos mediados por citonema entre las capas epiteliales en el disco del ala utilizando la técnica GRASP.
La técnica ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por una subvención del CIHR (PJT-162109) al D.H. M.J. con una beca de doctorado de la Fundación Institut de Recherches Cliniques de Montréal y del Programa de Biología Molecular de la Universidad de Montreal. Los autores agradecen enormemente la ayuda de la plataforma de microscopía e imágenes IRCM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio de disección Discovery V12 | Zeiss | microscopio de disección | |
| Pinzas Dumont #55, Consejos de biología | Herramientas de ciencia fina | 11255-20 | pinzas de disección |
| EP-Slik (slik20358) | BDSC | Panneton et al. 2015 | cepa de mosca para expresar Slik |
| FIJI | Schindelin J. et al. (2012) | Software de análisis de imágenes | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Tinción nuclear de imágenes en vivo |
| LexAop-CD4-spGFP11 | BDSC | 93018 | Cepa de mosca |
| Microscopio confocal LSM 700 | Zeiss | microscopio confocal | |
| nub-GAL4 | Centro de Stock de Drosophila de Bloomington (BDSC) | 86108 | Cepa de mosca |
| PerM-LexA | Rambaud, Joseph et al., 2025 | Cepa de mosca | |
| Placa de punto de vidrio PYREX de 9 depresiónvender | Ciencias de la vida de Corning | 7220-85 | para recoger y lavar larvas |
| Medio Drosophila de Schneider | ThermoFisher Scientific | 21720024 | medio de imagen en vivo |
| Espaciadores de imagen SecureSeal, 8 pocillos, 0,12 mm de espesor | Gracia Bio-Laboratorios | 654008 | espaciador |
| Kit de elastómero de silicona SYLGARD 184 | Sylgard | 3097358-1004 | para hacer placas de disección |
| UAS-CD4-spGFP1-10 | BDSC | 93017 | Cepa de mosca |
| Negro Zen | Zeiss | Software de adquisición |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
