Un sistema de expresión dual basado en la complementación de GFP para evaluar el contacto célula-célula mediado por citonemas en discos imaginales de ala de Drosophila vivos

Summary

Describimos un protocolo para medir los contactos entre células en capas epiteliales adyacentes en discos imaginales de ala de Drosophila vivos utilizando un enfoque basado en la reconstitución de GFP.

Abstract

El crecimiento y el patrón del tejido embrionario están controlados en gran medida por señales intercambiadas localmente entre poblaciones celulares dentro de los propios tejidos. Los citonemas son un tipo de filopodios de señalización identificados por primera vez en Drosophila que conectan y median el intercambio entre las células productoras y receptoras de señales. En el disco imaginal del ala de Drosophila en desarrollo, los citonemas están involucrados en el intercambio de señales entre distintas poblaciones de células dentro del epitelio propio del disco (DP), que formará el ala adulta, así como entre las células DP y las células en los tejidos adyacentes asociados al disco. Los citonemas hacen sinapsis con las células diana para formar contactos íntimos con la membrana.

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar el contacto mediado por citonema entre las células DP y las células del epitelio de la membrana peripodial adyacente (PerM), que está separado de las células DP por la luz del disco, utilizando un enfoque de reconstitución de GFP en discos de alas vivas. Utilizando los sistemas GAL4-UAS y LexA-LexAop, se expresan fragmentos complementarios de GFP dividida (spGFP1-10, spGFP11), cada uno fusionado con el dominio transmembrana de CD4, a ambos lados de la luz del disco. La obtención de imágenes de la fluorescencia GFP reconstituida en preparaciones de discos de ala viva mediante microscopía confocal se utiliza para generar pilas de imágenes a partir de las cuales se puede localizar y cuantificar la fluorescencia GFP reconstituida. Con este sistema, es posible coexpresar transgenes de interferencia de ARN o codificación de proteínas en células productoras de citonema o diana para medir su efecto en los contactos celulares DP-PerM. Este sistema, fácilmente adaptable a otros tejidos, permite así la identificación de factores importantes para la formación o función del citonoma.

Introduction

El desarrollo de los tejidos embrionarios está controlado por células ubicadas en "centros organizadores" que envían señales a las células distantes dentro de un tejido, controlando sus decisiones para proliferar (es decir, crecer y dividirse) o adoptar destinos particulares¹. Esta señalización celular no autónoma está mediada por ligandos producidos por la organización de células centrales que forman gradientes de concentración a través de los tejidos y provocan respuestas dependientes de la concentración. En muchos casos, estos ligandos se entregan o se recogen a través de filopodios de señalización basados e....

Protocol

El controlador de protuberancia-GAL4 se utiliza para expresar CD4-spGFP1-10 específicamente en la región de la bolsa del ala del DP (Figura 1A). El controlador PerM-LexA²¹ se utiliza para expresar CD4-spGFP11 específicamente en el PerM (Figura 1A). Estos dos sistemas de expresión son independientes entre sí, lo que permite la expresión simultánea y específica de diferentes transgenes en DP y PerM (Figura 1B, C).

El esquema genético básico implica el cruce de moscas para generar larvas del genotipo n....

Results

Para probar la utilidad del procedimiento GRASP para medir los contactos entre las células DP y PerM, examinamos discos de alas de cuatro genotipos diferentes: discos de control negativo de tipo salvaje (genotipo: w¹¹¹⁸) que solo mostrarán niveles de fondo de autofluorescencia en el canal GFP; discos que expresan el CD4-spGFP1-10 en la capa DP, pero carecen del transgén CD4-spGFP11, que mostrará el nivel de fluorescencia producido por GFP1-10 solo (que esperábamos que fuera insignificante, ya que GFP1.......

Discussion

Los citonemas juegan un papel importante en la distribución de ligandos, controlando el crecimiento y la organización de los tejidos en desarrollo. El intercambio de señales tiene lugar donde las puntas de los citonemas hacen contactos íntimos de la membrana con sus objetivos. En este protocolo, describimos un método simple para analizar los contactos mediados por citonema entre las capas epiteliales en el disco del ala utilizando la técnica GRASP.

La técnica .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio de disección Discovery V12	Zeiss		microscopio de disección
Pinzas Dumont #55, Consejos de biología	Herramientas de ciencia fina	11255-20	pinzas de disección
EP-Slik (slik20358)	BDSC	Panneton et al. 2015	cepa de mosca para expresar Slik
FIJI		Schindelin J. et al. (2012)	Software de análisis de imágenes
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	Tinción nuclear de imágenes en vivo
LexAop-CD4-spGFP11	BDSC	93018	Cepa de mosca
Microscopio confocal LSM 700	Zeiss		microscopio confocal
nub-GAL4	Centro de Stock de Drosophila de Bloomington (BDSC)	86108	Cepa de mosca
PerM-LexA		Rambaud, Joseph et al., 2025	Cepa de mosca
Placa de punto de vidrio PYREX de 9 depresiónvender	Ciencias de la vida de Corning	7220-85	para recoger y lavar larvas
Medio Drosophila de Schneider	ThermoFisher Scientific	21720024	medio de imagen en vivo
Espaciadores de imagen SecureSeal, 8 pocillos, 0,12 mm de espesor	Gracia Bio-Laboratorios	654008	espaciador
Kit de elastómero de silicona SYLGARD 184	Sylgard	3097358-1004	para hacer placas de disección
UAS-CD4-spGFP1-10	BDSC	93017	Cepa de mosca
Negro Zen	Zeiss		Software de adquisición