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Bioimpresión de cortes tumorales de hidrogel como modelo 3D para el linfoma de células del manto

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DOI:

10.3791/68417

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12 de septiembre de 2025

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1Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology and University of Tuebingen, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute, 3Department of Clinical Pathology, Robert Bosch Hospital, 4Robert Bosch Hospital, 5Departments of Clinical Pharmacology, Pharmacy and Biochemistry, University of Tuebingen, 6iFIT Cluster of Excellence (EXC 2180), Image-guided and Functionally Instructed Tumor Therapies, University of Tuebingen, 7German Cancer Consortium (DKTK) and German Cancer Research Center (DKFZ), Partner Site Tuebingen, 8National Center for Tumor Diseases (NCT), NCT South-West, a partnership between DKFZ, University Hospital Tuebingen, University of Tuebingen, Tuebingen, Bosch Health Campus, Stuttgart, Robert Bosch Hospital, Stuttgart, University Hospital Ulm, and Ulm University

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona una descripción detallada de la generación, el cultivo y el análisis del linfoma de células del manto en cortes de tumor de hidrogel impresos en 3D.

Resumen

El linfoma de células del manto (LCM) es una neoplasia de células B poco frecuente y agresiva que recae con frecuencia y solo muestra una respuesta limitada a la quimioterapia convencional. Un desafío importante en la investigación de MCL es cultivar células primarias de MCL ex vivo, ya que las células tienden a sufrir apoptosis espontánea cuando se cultivan en cultivo en suspensión 2D. Aunque se sabe que los modelos 3D recapitulan mejor la situación in vivo de los tumores sólidos, su aplicación aún está poco explorada en los linfomas. El desarrollo de modelos 3D que repliquen las condiciones in vivo del MCL dentro del ganglio linfático podría mejorar su supervivencia, facilitar el estudio de la diafonía entre el MCL y el microambiente tumoral e imitar la respuesta al fármaco in vivo . Aquí, se estableció un modelo impreso en 3D de MCL en forma de cortes de tumor de hidrogel, junto con un método de cultivo optimizado. Se desarrolló un proceso estandarizado utilizando líneas celulares MCL o células primarias MCL, en el que las células se sumergen en un hidrogel que contiene alginato, colágeno tipo I y matriz de membrana basal mediante bioimpresión en un baño de soporte de gelatina. Los cortes tumorales de hidrogel MCL resultantes se cultivan en un soporte de filtro para mantener su estabilidad durante todo el período de cultivo. Se pueden aplicar tratamientos farmacológicos al sistema. La respuesta de las células individuales dentro del corte tumoral de hidrogel se puede rastrear mediante imágenes de fluorescencia 3D en vivo de cuatro colores. Las células primarias del LCM demostraron una viabilidad estable cuando se cultivaron en los cortes tumorales de hidrogel. Este protocolo proporciona una descripción detallada de la generación, el cultivo y el análisis de células MCL en cortes de tumor de hidrogel. Al imitar de cerca el microambiente tumoral y utilizar un cultivo de interfaz aire-líquido, el modelo presentado mejora la relevancia fisiológica en comparación con el cultivo 2D tradicional. Ofrece un potencial significativo para avanzar en los estudios biológicos y terapéuticos del LCM.

Introducción

El linfoma de células del manto (LCM) es un linfoma no Hodgkin de células B raro y agresivo que se origina en la zona del manto de los ganglios linfáticos1. La zona del manto está compuesta por un anillo de pequeños linfocitos que rodean el centro germinal del folículo de células B. Por lo general, el LCM muestra un curso clínico agresivo, con recaídas frecuentes después de la quimioterapia inicial. Debido a una mejor comprensión de la formación de la enfermedad1 y al desarrollo de nuevos tratamientos, incluida la inmunoquimioterapia2, los inhibidores de la tirosina quinasa de Bruton3 o los conjugados anticuerpo-fármaco4, las opciones de tratamiento para los pacientes con LCM han llevado a mejores tasas de respuesta y una supervivencia libre de progresión prolongada. Sin embargo, la resistencia a los medicamentos y las recaídas aún hacen que la enfermedad sea incurable5. En parte, esto es consecuencia de su heterogeneidad y de la influencia del microambiente tumoral en el desarrollo tumoral y la resistencia a los medicamentos6. Un desafío en el estudio del MCL es la dificultad de cultivar células primarias de MCL en cultivo en suspensión7, ya que las células experimentan apoptosis espontánea ex vivo 4,5. Esto destaca la necesidad de enfoques alternativos para modelar mejor el LCM en modelos preclínicos.

In vivo, los tumores son estructuras tridimensionales (3D) compuestas por varios componentes celulares, incluidas células tumorales, células inmunitarias y células estromales, así como componentes no celulares como la matriz extracelular (ECM). La ECM, que consiste en macromoléculas como el colágeno y la laminina, forma una compleja malla fibrosa de fibras elásticas que es altamente hidrófila, creando un entorno similar a un gel 2,8,9,10. Para replicar mejor estas condiciones in vivo de los tumores ex vivo, se han desarrollado una variedad de modelos 3D. En los últimos años, estos modelos se han vuelto cruciales para estudiar la farmacología y la biología del cáncer, centrándose principalmente en los tumores sólidos11.

Hasta la fecha, este campo sigue siendo poco explorado en los linfomas, ya que las células cancerosas hematológicas tienen la capacidad de crecer tanto en suspensión como en entornos estromales como los ganglios linfáticos, la médula ósea o los tejidos linfoides secundarios12. In vivo, las células del LCM se diseminan desde la zona del manto de los ganglios linfáticos a la sangre o la médula ósea, aunque proliferan principalmente dentro de los ganglios linfáticos de los que se originan13,14. Dentro de los ganglios linfáticos, las células MCL están rodeadas por células T, macrófagos y células estromales mesenquimales, todas las cuales han demostrado controlar la supervivencia o la respuesta al fármaco de las células MCL 14,15,16,17,18. Además, la diafonía MCL-microambiente tumoral, así como la porosidad y las propiedades mecánicas, son factores importantes que pueden influir en las respuestas y resistencias a los medicamentos 6,14. Por lo tanto, se requieren modelos tumorales 3D estandarizados y reproducibles de MCL que simulen el microambiente nativo para estudiar MCL primario. Hasta ahora, se han establecido principalmente modelos basados en células, como esferoides u organoides de células primarias de LCM 6,19. Mejoran con éxito la viabilidad y el cultivo a largo plazo de las células primarias de MCL. Sin embargo, la matriz extracelular está subrepresentada en estos modelos. En este contexto, la bioimpresión 3D avanzada ofrece un enfoque prometedor. Al ensamblar directamente células vivas e hidrogeles, esta tecnología permite la generación de modelos de ganglios linfáticos 3D basados en hidrogeles fisiológicamente relevantes.

Aquí, se estableció un modelo bioimpreso en 3D de MCL en forma de cortes de tumor de hidrogel, junto con un método de cultivo optimizado. Las células se incrustan en rodajas de hidrogel a base de colágeno tipo I, alginato y Matrigel mediante bioimpresión reversible de forma libre de hidrogeles suspendidos (FRESH)20. Los cortes tumorales de hidrogel se cultivan en un soporte de filtro, lo que permite que las células MCL crezcan en un entorno que recapitula de cerca las condiciones in vivo del ganglio linfático.

Este protocolo proporciona una descripción detallada de la generación, el cultivo y el análisis de células MCL en cortes de tumores de hidrogel. Mediante el uso de imágenes de fluorescencia 3D en vivo de cuatro colores, se puede rastrear la viabilidad o la respuesta al fármaco de células individuales dentro del corte tumoral de hidrogel. Las células primarias del LCM demostraron una mejor supervivencia cuando se cultivaron en las rodajas de tumor de hidrogel. Este modelo proporciona una herramienta para estudiar la biología del LCM y la respuesta al tratamiento, allanando el camino hacia la comprensión de las influencias microambientales y la variabilidad de los pacientes con LCM.

Protocolo

El trabajo con células primarias de LCM debe ser aprobado por el comité de ética local. En este estudio, el comité de ética de la Facultad de Medicina, la Universidad Eberhard-Karls y el Hospital Universitario de Tubinga aprobó la recolección y el análisis de muestras de pacientes y donantes sanos (número de proyecto 159/2011BO2), y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Las células primarias de MCL utilizadas aquí se aislaron de los ganglios linfáticos completos de los pacientes con MCL y, por lo tanto, incluyeron no solo las células de MCL, sino también otras células como las células inmunes y los fibroblastos.

1. Preparación de lechada de gelatina para el baño de apoyo.

NOTA: La suspensión de gelatina servirá como baño de soporte durante el proceso de bioimpresión 3D. Induce la reticulación de la biotinta, lo que permite la formación de una estructura 3D. La preparación de la suspensión de gelatina debe realizarse en condiciones estériles dentro de una campana de cultivo celular.

  1. Prepare una solución de gelatina al 4,5% (p/v) en HEPES 10 mM y CaCl2 11 mM disolviendo 6,75 g de gelatina en polvo en 1,5 mL de HEPES 1 M, 15 mL de CaCl2 110 mM y 133,5 mL de H2O estéril en un frasco Mason estéril con tapa. Asegúrese de que el frasco Mason sea adecuado para mezclar en un mezclador de alto rendimiento.
  2. Incubar la solución a 37 °C durante 4 h o hasta que no se observen manchas al agitar la solución, lo que indica que la gelatina se ha disuelto por completo. Enfriar la gelatina a 4°C durante la noche o durante al menos 12 h.
  3. Prepare un tampón de lavado estéril que consista en 10 mM de HEPES y 14,4 mM de CaCl2. Preenfríe el tampón de lavado a 4 °C.
  4. Rompe la gelatina solidificada al 4,5% en varios trozos con una cuchara estéril.
  5. Llene completamente el frasco Mason que contiene la gelatina al 4,5% con el tampón de lavado preenfriado, asegurándose de que el tampón permanezca frío durante todo el proceso de preparación de la suspensión de gelatina.
  6. Congele el frasco Mason que contiene gelatina a -20 ° C durante 45-60 min, hasta que la suspensión de gelatina alcance los 0 ° C, pero aún no haya comenzado a formar cristales de hielo. Use un termómetro para controlar la temperatura.
  7. Coloque la tapa y la cuchilla de la batidora en la jarra Mason, luego monte la jarra Mason en la batidora. Licúa la suspensión de gelatina durante 120 s usando la configuración de pulso.
    NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la configuración de la licuadora cuando se usa un tipo diferente de licuadora.
  8. Transfiera la suspensión mezclada a tubos de 50 ml preenfriados. Centrifugar a 3.800 x g durante 2 min a 4°C. Asegúrese de que la suspensión esté separada en una suspensión de gelatina sólida en la parte inferior y el tampón de lavado líquido en la parte superior.
  9. Realice el siguiente paso con hielo: Lave la suspensión de gelatina. Aspira la capa superior de líquido, tratando de eliminar las burbujas visibles en la parte superior del tampón de lavado. Agregue 20 ml de tampón de lavado fresco a 4 ° C al tubo. Agite el tubo para mezclar la suspensión de gelatina con el tampón de lavado.
  10. Repita el proceso de centrifugación y lavado al menos 3 veces, o hasta que no se vean burbujas en la parte superior del tampón de lavado. Después del lavado final, elimine cualquier tampón de lavado residual por aspiración. La suspensión de gelatina se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas.

2. Preparación de biotinta cargada de células

  1. Prepare una solución estéril de alginato al 5% 1-2 días antes de la impresión. Agregue 1 g de alginato a 20 ml de PBS estéril en un tubo de 50 ml. Para evitar residuos secos de polvo de alginato, agregue el PBS en pequeños incrementos, en vórtice entre adiciones. Incubar la solución en un baño de agua a 37 °C durante varias horas o durante la noche en un rodillo de tubo a temperatura ambiente. Una vez que el alginato esté completamente disuelto, almacene la solución a 4 °C hasta que la necesite.
  2. Si trabaja con una línea celular MCL, cultive las células en suspensión en un matraz T75. El día de la impresión, asegúrese de que 1,4 x 107 células estén disponibles para la preparación de 1 ml de biotinta, lo que producirá 9-10 cortes de tumor de hidrogel.
  3. Si se trabaja con células primarias de MCL, no es necesario cultivar las células en cultivo en suspensión antes de la bioimpresión. Descongele las células primarias de MCL criopreservadas directamente antes de la bioimpresión. Transfiera las células primarias del LCM a un tubo de 50 ml con medio de cultivo. Para eliminar el medio de congelación restante, centrifugue inmediatamente el tubo a 340 x g durante 5 min, luego retire el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en 20 ml de medio fresco para el recuento celular.
  4. El día de la impresión, prepare la biotinta adaptada para las células de interés. Para las células Jeko-1, prepare una biotinta compuesta de 0,5% (p/v) de alginato, 20% (v/v) de colágeno tipo I, 1x RPMI y 2 mM HEPES. Mezcle 100 μL de alginato al 5%, 200 μL de colágeno tipo I, 100 μL de 10x RPMI, 200 μL de 10 mM HEPES y 350 μL de PBS para 1 mL de biotinta. Las celdas se agregarán en el paso 2.6.
  5. Para las células primarias de MCL, prepare una biotinta compuesta de 0,5% (p/v) de alginato, 20% (v/v) de colágeno tipo I, 1x RPMI y 0,5 mM HEPES. Mezcle 100 μL de alginato al 5%, 200 μL de colágeno tipo I, 100 μL de 10x RPMI, 50 μL de 10 mM HEPES y 500 μL de matriz de membrana basal para 1 mL de biotinta. Las celdas se agregarán en el paso 2.6. Si trabaja con una línea celular MCL, transfiera la suspensión celular del matraz de cultivo a un tubo de 50 ml.
  6. Mezcle las células con azul de tripano al 0,4% en una proporción de 1:1. Cuente las células viables (sin teñir) utilizando un contador de células o una cámara de Neubauer. Calcule el volumen de suspensión celular para 1 ml de biotinta, lo que equivale a 1,4x107 células. Transfiera el volumen calculado a un nuevo tubo de 50 ml. Centrifugar a 340 x g durante 5 min, luego retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en la biotinta preparada para generar la biotinta final cargada de células.
    NOTA: Se estimó que el sedimento celular tiene un volumen de 50 μL de medio. Junto con la biotinta preparada en el paso 2.4, esto producirá 1 ml de biotinta.

3. Bioimpresión en baño

NOTA: Si es posible, realice el proceso de impresión 3D en un entorno estéril, como debajo de una campana de cultivo celular. La impresora 3D utilizada se modificó para la impresión FRESH agregando un extensor de bomba de jeringa, como se describe en Hinton et al.20.

  1. Encienda la bioimpresora y conéctela al software de la impresora 3D. Abra el archivo .stl que contiene el plano de los cortes de tumor de hidrogel. Se pueden imprimir hasta 5 rebanadas simultáneamente. Asegúrese de que cada corte de tumor de hidrogel tenga un diámetro de 8 mm y una altura de 1,5 mm. Establezca la densidad de relleno en 85%. Inicio del cabezal de la impresora.
    NOTA: El archivo STL se diseñó con Fusion 360 y se puede encontrar en el archivo de codificación complementario 1. Para la impresión 3D, se utilizó el software Cura Versión 15.04.5.
  2. Transfiera la suspensión de gelatina previamente preparada a una placa de Petri de 35 mm de diámetro hasta que esté medio llena. Asegúrese de que no queden espacios de aire en la suspensión de gelatina. Retire el exceso de agua de la suspensión con toallitas de precisión desechables para generar un baño de soporte de gelatina, que es pastoso y mantiene la forma hasta que se aplica suficiente fuerza.
  3. Transfiera la biotinta cargada de células a una jeringa de vidrio de 2,5 ml y conéctela a una boquilla roma de 0,8 mm. Invierta la jeringa y expulse con cuidado el exceso de aire y las burbujas de aire. Una vez preparada la jeringa, insértela en la bioimpresora. Usando el software de la impresora 3D, extruya biotinta hasta que comience a ser expulsada de la boquilla. Limpie la gota de biotinta expulsada con una toallita de precisión científica desechable para evitar la obstrucción de la boquilla.
  4. Coloque el baño de soporte de gelatina justo debajo de la boquilla de la jeringa. Baje el cabezal de la impresora hasta que la boquilla se coloque dentro de la suspensión de gelatina, 2 mm por encima del fondo del baño de soporte.
  5. Inicie el proceso de impresión a través del software de la impresora 3D.
  6. Una vez que se complete el proceso de impresión, retire el exceso de lechada de gelatina de la boquilla para evitar obstrucciones. Saque el baño de soporte que contiene las rodajas de tumor de hidrogel y cúbralo con una tapa para mantener la esterilidad.
  7. Incubar el baño de soporte que contiene las rodajas tumorales de hidrogel impresas a 37 °C para permitir que la gelatina se derrita. Este paso liberará las rodajas de tumor de hidrogel impresas del baño de soporte.
  8. Precaliente el tampón de lavado y el medio de cultivo celular a 37 °C. Mientras la gelatina se derrite, prepare un plato de 6 pocillos para lavar las rodajas de tumor de hidrogel. Llene dos pocillos con HEPES de 10 mM, tampón de lavado de CaCl2 de 14,4 mM (el mismo tampón utilizado para el lavado de la lechada de gelatina) y dos pocillos con medio de cultivo celular.
  9. Una vez que la gelatina se haya derretido, use una espátula estéril para transferir las rodajas de tumor de hidrogel al tampón de lavado. Lave las rodajas durante 1 minuto cada una, primero en los dos pocillos que contienen tampón de lavado, luego en los dos pocillos que contienen medio. Los cortes tumorales de hidrogel cargados de células ahora están listos para el cultivo.
  10. Guarde la biotinta restante para repetir el proceso de impresión.

4. Cultivo y tratamiento de rebanadas tumorales de hidrogel

  1. Para cultivar las rodajas de hidrogel, transfiéralas a un soporte de filtro (tamaño de poro de 0,4 μm) colocado dentro de una placa de 6 pocillos. Cultive hasta 5 rodajas de hidrogel en un solo soporte de filtro. Agregue 1,5 ml de medio de cultivo celular debajo del soporte del filtro. Agregue una gota de medio encima de las rodajas de tumor de hidrogel para evitar que se sequen.
  2. Para el tratamiento farmacológico de cortes de tumor de hidrogel, agregue la cantidad deseada del medicamento al medio de cultivo celular. Aquí, los cortes de tumor de hidrogel se trataron con doxorrubicina 0,33 μM-27 μM durante 48 h o 72 h. Cultivar siempre un conjunto de lonchas sin tratamiento como control.
  3. Coloque la placa de 6 pocillos con las rodajas tumorales de hidrogel en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO2 durante el período de cultivo deseado.

5. Análisis de viabilidad de células mediante ensayo de exclusión de azul de tripano

  1. Para evaluar la viabilidad celular después del cultivo o el tratamiento, disuelva los cortes de tumor de hidrogel. Transfiera una rebanada tumoral de hidrogel a un tubo de 1,5 ml. Agregue 500 μL por rebanada de un tampón de disolución que contenga 30 mM de EDTA, 55 mM de citrato de sodio y 150 mM de cloruro de sodio (pH 6,8). Pipetea hacia arriba y hacia abajo hasta que el hidrogel se haya disuelto por completo.
  2. Centrifugar la solución a 340 x g durante 5 min. Aspira el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 500 μL de medio por rebanada de hidrogel disuelto.
  3. Mezclar la suspensión celular en una proporción de 1:1 con un 0,4% de azul de tripano. Cuente las células viables (sin teñir) y muertas (teñidas) con un contador de células o una cámara de Neubauer. Registre el número de células vivas y muertas para su posterior análisis.

6. Imágenes de fluorescencia 3D en vivo de cuatro colores

NOTA: La tinción de cuatro colores utilizada aquí permite la diferenciación entre células vivas (TMRM positivas), células apoptóticas (sustrato fluorogénico de caspasa-3 positivo) y células muertas (PicoGreen positivo)21,22,23. Los núcleos se detectan con DRAQ5. Sin embargo, este protocolo puede ajustarse a cualquier otro colorante de fluorescencia específico fotoestable para detectar los biomarcadores, estructuras celulares o tipos celulares de elección. Antes de teñir, asegúrese de que el microscopio pueda detectar las longitudes de onda de los fluoróforos utilizados para la tinción.

  1. Para una tinción de cuatro colores de un corte de tumor de hidrogel, prepare una solución de tinción agregando TMRM, DRAQ5 y sustrato fluorogénico de caspasa-3 a 1 ml de medio de cultivo celular a una concentración final de 0,5 μM, 5 μM y 2 μM, respectivamente.
  2. Con una espátula estéril, transfiera una rodaja tumoral de hidrogel a un cubreobjetos de vidrio con cámara. Agregue la solución de tinción preparada sobre la rodaja de hidrogel hasta que esté completamente cubierta. Incubar la muestra durante 20 min a 37 °C en la oscuridad.
  3. Después de la incubación inicial, recoja la solución de tinción que cubre el corte tumoral de hidrogel y agregue 0,7 μl/ml de PicoGreen. Pipetear la solución de tinción de nuevo en la rodaja de hidrogel e incubar durante 10 min más a 37 °C en la oscuridad.
  4. Después de la incubación, retire con cuidado el exceso de medio dejando suficiente solución de tinción para mantener húmeda la rodaja de hidrogel.
  5. Analice el corte inmediatamente con un microscopio confocal. Para prevenir la fototoxicidad y el fotoblanqueo, minimice la dosis de fotones aplicada reduciendo la intensidad del láser y el tiempo de excitación. Los espectros de excitación/emisión de las tinciones descritas anteriormente se pueden encontrar en la Tabla 1.
  6. Para obtener una visión general de la distribución celular de la célula en el hidrogel, capture las secciones z. Si se han tomado secciones en Z durante la obtención de imágenes, genere reconstrucciones 3D de los cortes de tumor de hidrogel utilizando el software adecuado. Estas reconstrucciones permitirán un análisis exhaustivo de la distribución espacial y el estado celular de las células en los cortes de tumor de hidrogel.
  7. Siga las instrucciones y el script proporcionados en el Archivo complementario 1 y el Archivo complementario 2 para realizar la segmentación y reconstrucción de celdas.

Resultados

Los cortes tumorales de hidrogel que contienen células MCL se generaron con el protocolo descrito anteriormente. Los pasos del flujo de trabajo para la impresión 3D y el cultivo de los cortes tumorales de hidrogel se muestran en la Figura 1A. La impresora 3D utilizada se modificó para la impresión FRESH mediante la adición de un extensor de bomba de jeringa como se describe en Hinton et al.20 (Figura 1B). Se imprimieron hasta cinco rodajas a la vez (Figura 1C) y se cultivaron en un soporte de filtro (Figura 1D). Se agregó medio debajo del soporte del filtro para proporcionar un suministro de nutrientes a las rodajas tumorales de hidrogel. Se agregó una gota de medio en la parte superior de cada rebanada tumoral de hidrogel para evitar que se sequen. En la Figura 1E se muestra una descripción general de cinco cortes de tumor de hidrogel cultivados en un soporte de filtro, junto con imágenes de primer plano de un corte de hidrogel. Durante un período de cultivo de 3 días, los cortes tumorales de hidrogel se mantuvieron estables y mantuvieron su estructura (Figura 2A). Inmediatamente después de la impresión, las burbujas de aire estaban presentes en las rodajas de tumor de hidrogel, pero desaparecieron durante el cultivo (Figura 2A).

La viabilidad de la línea celular MCL Jeko-1 cultivada en cortes tumorales de hidrogel (3D) en comparación con las células Jeko-1 cultivadas en cultivo en suspensión (2D) se evaluó mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano (Figura 2B). Después de 3 días de cultivo, el 80% de las células eran viables, en comparación con una viabilidad inicial del 88% de las células Jeko-1 antes de la impresión. Las células Jeko-1 cultivadas en 2D mantuvieron la viabilidad inicial del 88%. No hubo diferencias significativas entre las células Jeko-1 cultivadas en 2D y 3D. Para evaluar si las células Jeko-1 proliferan en las rodajas de hidrogel, se determinó el número medio de células Jeko-1 por rebanada de hidrogel (Figura 2C). Mientras que 5x105 células Jeko-1 estaban contenidas en cada rebanada directamente después de la impresión (d0), este número casi se duplicó a 9,3x105 células después de 3 días de cultivo.

La distribución y el estado de las células Jeko-1 cultivadas en rodajas de hidrogel se evaluaron mediante imágenes de fluorescencia en vivo de cuatro colores (Figura 2D) directamente después de la impresión o después de 3 días de cultivo. Después de la impresión, las reconstrucciones 3D de las rodajas de hidrogel Jeko-1 mostraron una distribución homogénea de las células. La mayoría de las células fueron positivas para TMRM, un marcador de potencial de membrana mitocondrial22. Una minoría de células fue positiva para la actividad de Caspasa-3, un marcador para la inducción de la apoptosis23, así como para el marcador de células muertas PicoGreen21. Después de 3 días de cultivo, se observó un aumento en el número de células junto con la formación de grupos celulares. La mayoría de las células permanecieron positivas para TMRM, mientras que solo unas pocas células se tiñeron con positivo para la actividad de Caspasa-3 o PicoGreen (Figura 2C).

Para analizar si las células de MCL en cortes de hidrogel responden a la quimioterapia, las células de Jeko-1 cultivadas en cultivo en suspensión (2D) o en cortes de hidrogel (3D) fueron tratadas con el fármaco quimioterapéutico Doxorrubicina, que forma parte del tratamiento estándar para pacientes con MCL24. La estructura general de las rodajas de hidrogel se mantuvo durante el tratamiento con doxorrubicina (Figura 3A). La viabilidad de las células Jeko-1 cultivadas en rodajas de hidrogel disminuyó de forma dependiente de la dosis en respuesta al tratamiento con doxorrubicina. El IC50 de doxorrubicina en células Jeko-1 aumentó cuando las células se cultivaron en rodajas de hidrogel (IC50 = 5,8 μM) en comparación con las células Jeko-1 cultivadas en cultivo en suspensión 2D (IC50 = 2,0 μM; Figura 3B). Las imágenes de fluorescencia en vivo de cuatro colores mostraron una reducción de TMRM y un aumento de la señal PicoGreen en células Jeko-1 cultivadas en rodajas de hidrogel en respuesta al tratamiento con doxorrubicina, lo que confirma una reducción de la viabilidad inducida por el tratamiento. Las imágenes obtenidas de imágenes de fluorescencia en vivo de cuatro colores se reconstruyeron en 3D, se segmentaron en función de la señal de los núcleos DRAQ5 y se analizaron utilizando el Python Script descrito en el Archivo complementario 1. En la Figura complementaria 1 se muestra una máscara de segmentación ejemplar. El número de celda identificado a partir de la señal DRAQ5 se utilizó para determinar el número total de celdas. El número de células positivas para la actividad de TMRM, PicoGreen y Caspasa-3 se utilizó para identificar el porcentaje de células viables, muertas o apoptóticas, respectivamente. Las cuantificaciones de la tinción de fluorescencia viva de cuatro colores de células Jeko-1 cultivadas en rodajas de hidrogel durante 3 días con o sin doxorrubicina 9 μM mostraron una viabilidad comparable al ensayo de exclusión de azul de tripano (Tabla 2).

Además de las líneas celulares de MCL establecidas, se cultivaron células primarias de MCL de tres pacientes diferentes con MCL en cultivo en suspensión 2D o en cortes de hidrogel 3D (Figura 4, Figura complementaria 2). Según lo verificado por un patólogo, los tres MCL (Paciente 1-3) eran de morfología clásica / común con índices Ki67 de 20% a 50%. Las células primarias de MCL incluían todos los tipos de células aisladas de los ganglios linfáticos de los pacientes con MCL y, por lo tanto, contenían no solo células de MCL sino también otros tipos de células inmunes o células estromales. La viabilidad de las rodajas primarias de hidrogel MCL se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. Después de 4 días de cultivo, las células primarias de MCL en cortes de hidrogel mantuvieron una viabilidad del 43,6% (45,7% el día 3) en comparación con una viabilidad inicial del 71,0% antes de la impresión (Figura 4A). Esto representa una mayor viabilidad en comparación con las células cultivadas en suspensión (2D), que tuvieron una supervivencia del 19,6% después de cuatro días de cultivo (28,4% el día 3). Esta viabilidad se visualizó mediante imágenes de fluorescencia en vivo de cuatro colores, en las que la mayoría de las células eran positivas para TMRM y viables, mientras que una subpoblación era positiva para la actividad de Caspasa-3 y PicoGreen, lo que indica apoptosis y muerte celular, respectivamente (Figura 4B). Los datos de cuantificación de la Figura 4B se muestran en la Tabla 2. Las células primarias de otros dos pacientes con LCM mostraron una mayor supervivencia de las células cuando se cultivaron en las rodajas de hidrogel (3D) en comparación con el cultivo en suspensión 2D respectivo (Figura complementaria 1).

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Figura 1: Flujo de trabajo de impresión 3D de cortes de tumores de hidrogel . (A) Flujo de trabajo de impresión 3D y cultivo de células en cortes de tumores de hidrogel. (B) Configuración de la impresora utilizada para la bioimpresión 3D de rodajas de hidrogel en un baño de soporte de gelatina. (C) Impresión de un plano en el software de la impresora 3D. Se imprimieron hasta cinco rebanadas de hidrogel a la vez. (D) Representación esquemática del cultivo de rodajas de hidrogel. Las rodajas de hidrogel se cultivaron sobre un soporte de filtro en una placa de 6 pocillos. Se agregó una gota de medio encima de cada rebanada de hidrogel para mantener su humedad. Se pueden cultivar hasta cinco rodajas de hidrogel en un soporte de filtro. (E) Rodajas de hidrogel impresas en 3D cultivadas en un soporte de filtro, como se muestra en una imagen general o en imágenes de primer plano. Las barras de escala representan 5 mm, 1 mm o 200 μm como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Cultivo de una línea celular de linfoma de células del manto (LCM) en cortes de hidrogel impresos en 3D.(A) Primer plano de una rebanada de hidrogel representativa que contiene la línea celular MCL Jeko-1 después de la impresión (d0) o después de 3 días de cultivo (d3). La barra de escala representa 1 mm. (B) Viabilidad de células Jeko-1 cultivadas en suspensión (2D) o en rodajas de hidrogel (3D) durante 2 días según lo evaluado por ensayo de exclusión de azul de tripano. Se muestra la media ± SD de tres experimentos de bioimpresión independientes. (C) Número de células Jeko-1 contenido en cada rebanada de hidrogel directamente después de la impresión (d0) o después de hasta 3 días de cultivo (d1-d3). Se muestra la media ± SD de tres experimentos de bioimpresión independientes. No se observaron diferencias estadísticamente significativas (n.s., p > 0,05, prueba de Mann-Whitney). (D) Reconstrucción tridimensional de rodajas de hidrogel Jeko-1 el día de la impresión (d0) o después de 3 días de cultivo (d3). El modelo se generó a partir de pilas z de una imagen de fluorescencia 3D en vivo de cuatro colores. Las células vivas se muestran en rojo (TMRM), las células apoptóticas en amarillo (actividad enzimática Caspasa-3), las células muertas en verde (PicoGreen) y los núcleos en azul (DRAQ5). La barra de escala representa 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Tratamiento farmacológico de una línea celular de linfoma de células del manto (LCM) en rodajas de hidrogel. (A) Primer plano de una rebanada de hidrogel representativa que contiene la línea celular MCL Jeko-1 tratada con 3 μM de doxorrubicina durante 3 días (d3). La barra de escala representa 1 mm. (B) Las células Jeko-1 cultivadas en suspensión (2D) o en rodajas de hidrogel (3D) fueron tratadas con concentraciones crecientes del agente quimioterapéutico Doxorrubicina durante 2 días. La viabilidad de las células se evaluó mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. Se muestra la media ± SD de cuatro experimentos de bioimpresión independientes. (C) Reconstrucción tridimensional de rodajas de hidrogel Jeko-1 tratadas con doxorrubicina 9 μM (Doxo) durante 3 días (d3). El modelo se generó a partir de pilas z de una imagen de fluorescencia 3D en vivo de cuatro colores. Las células vivas se muestran en rojo (TMRM), las células apoptóticas en amarillo (actividad enzimática Caspasa-3), las células muertas en verde (PicoGreen) y los núcleos en azul (DRAQ5). La barra de escala representa 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Cultivo de células primarias de MCL en cortes de hidrogel impresos en 3D. (A) Viabilidad de las células primarias de MCL cultivadas en suspensión (2D) o en rodajas de hidrogel (3D) durante un máximo de 4 días, según lo evaluado por el ensayo de exclusión de azul de tripano. Se muestra la viabilidad media de un experimento. (B) Reconstrucción tridimensional de células primarias de MCL cultivadas en rodajas de hidrogel (3D) durante 3 días. Las pilas Z se generaron a partir de rodajas de hidrogel teñidas con una tinción viva de cuatro colores y se analizaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (CLSM). Las células vivas se muestran en rojo (TMRM), las células apoptóticas en amarillo (actividad enzimática Caspasa-3), las células muertas en verde (PicoGreen) y los núcleos en azul (DRAQ5). La barra de escala representa 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ManchaTMRMDRAQ5Sustrato NucView405 Caspase-3PicoGreen
Excitación/Emisión548 nm/574 nm647 nm/681 nm429 nm/ 469 nm488 nm/ 520 nm

Tabla 1: Máximos de excitación/emisión de las tinciones utilizadas para imágenes de fluorescencia 3D en vivo de cuatro colores.

Muestra% de células
TMRM (Células viables)PicoGreen (Células muertas)Caspasa-3 (células apoptóticas)
Jeko-1 Ctrl8323.618.3
Jeko-1 Doxo 9 μM27.681.386.6
Paciente primario de MCL 175.231.133.1

Tabla 2: Cuantificación de reconstrucciones 3D de tinción viva de cuatro colores de cortes de tumor de hidrogel cultivados. Los cortes tumorales de hidrogel se cultivaron durante 3 días y contenían células Jeko-1 cultivadas con o sin tratamiento con doxorrubicina 9 μM o células primarias de MCL (paciente 1).

Figura complementaria 1: Identificación celular a partir de reconstrucciones 3D de tinción viva de cuatro colores. Reconstrucciones 3D de una imagen confocal etiquetada con DRAQ5 obtenidas a partir de (A) tinción en vivo de cuatro colores y (B) una imagen segmentada en este canal generada utilizando la canalización de análisis de imágenes de Python. La barra de escala representa 200 μm. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 2: Cultivo de células primarias de MCL de los pacientes 2 y 3 en cortes tumorales de hidrogel . Viabilidad de las células primarias del LCM de (A) paciente 2 o (B) paciente 3 cultivadas en suspensión (2D) o en rodajas de hidrogel (3D) durante un máximo de 4 días según lo evaluado por ensayo de exclusión de azul de tripano. Se muestra la viabilidad media de un experimento. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Archivo complementario 1: Instrucciones para el análisis de reconstrucciones 3D obtenidas a partir de tinción en vivo de cuatro colores. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Script de Python para el análisis de reconstrucciones 3D obtenidas a partir de tinción en vivo de cuatro colores. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 1: Stl. que contiene el plano de las rodajas tumorales de hidrogel. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los cortes tumorales de hidrogel descritos en este protocolo ofrecen un modelo de MCL que imita la estructura de los ganglios linfáticos, lo que permite el estudio de la supervivencia de las células MCL y la respuesta al fármaco en un microambiente tumoral 3D generado por bioimpresión.

Los métodos de bioimpresión más utilizados se basan en la extrusión, donde la biotinta se expulsa a través de un sistema de dispensación. En la impresión por inyección de tinta, por ejemplo, las biotintas se reticulan rápidamente después de la deposición para formar estructuras3D 25. Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones, particularmente en términos de viscosidad de los materiales utilizados y la capacidad de apilar capas. Por el contrario, la bioimpresión 3D de extrusión basada en jeringas integradas, como la bioimpresión FRESH utilizada en este protocolo, aplica un enfoque de gel en gel. Esto permite la impresión de biotintas de baja viscosidad, como el colágeno, en construcciones estables, lo que permite imitar el complejo microambiente tumoral 20,26. Si bien las impresoras 3D desarrolladas específicamente para la bioimpresión pueden ser costosas, el método presentado aquí ofrece un punto de entrada más accesible. Se puede adaptar a impresoras de extrusión estándar con modificaciones relativamente simples. Estas modificaciones se pueden imprimir en 3D con filamentos asequibles, y los diseños están disponibles como recursos de código abierto, por ejemplo, por Hinton et al.20. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la preparación del baño de soporte de hidrogel para la bioimpresión FRESH es muy sensible a la temperatura y requiere una atención cuidadosa durante la preparación de la suspensión.

Con frecuencia, los modelos tumorales impresos en 3D se cultivan en sistemas flotantes, que carecen del gradiente de oxígeno in vivo 25, o en cultivos de chips microfluídicos27, que capturan un alto grado de complejidad pero tienen un bajo rendimiento y requieren un alto mantenimiento. Estos obstáculos se pueden superar con los cortes de tumor de hidrogel que se describen aquí. La configuración del cultivo de hasta cinco cortes de tumor de hidrogel en una interfaz aire-líquido se deriva del cultivo de cortes tumorales cortados con precisión de tumores sólidos28. La membrana del soporte filtrante utilizado en este protocolo está compuesta por una membrana de politetrafluoroetileno (PFTE) con un tamaño de poro de 0,4 μm, que permite el intercambio de nutrientes pero evita la unión celular o la migración celular29. El cultivo en la membrana de PTFE proporciona soporte físico para que las rodajas mantengan su estabilidad y eviten que se rompan o se desintegren. Además, proporcionan una interfaz aire-líquido, proporcionando oxígeno principalmente del aire superior y nutrientes del medio debajo del filtro30. Por lo tanto, el sistema incorpora variaciones espaciotemporales en el suministro de nutrientes, la proliferación celular y la oxigenación, ya que pueden ocurrir in vivo25. Cultivadas en las rodajas tumorales de hidrogel sobre un soporte de filtro, las células primarias de MCL mantuvieron una viabilidad de más del 40% durante 4 días, que fue superior a la viabilidad observada en el cultivo en suspensión 2D (Figura 3A, Figura complementaria 2). Las investigaciones adicionales deben abordar si se puede lograr una viabilidad prolongada mediante la adición de citocinas o el cocultivo con fibroblastos que expresan CD40L, como se ha descrito en esferoides y organoides de tumor de linfoma primario de células B 6,19,30 o cocultivos de células MCL primarias con células L de fibroblastos que expresan CD40L14. Se debe considerar la incorporación de tales enfoques en los cortes tumorales de hidrogel para mejorar el cultivo de células primarias de MCL, así como la similitud con el microambiente nativo.

Los ganglios linfáticos contienen una red bien desarrollada de fibras de matriz extracelular. Debido a su patrón, se les conoce como fibras reticulares. Principalmente, estas fibras están compuestas por colágeno y componentes específicos de la membrana basal 31,32,33. Para generar una matriz que se asemeje a la situación in vivo en los ganglios linfáticos, la biotinta utilizada para generar los cortes tumorales de hidrogel está compuesta por colágeno tipo I y Matrigel, que consta de las cuatro principales proteínas ECM de la membrana basal laminina, colágeno IV, entactina y perlecan34. Además, se agrega alginato a la biotinta para estabilizar los cortes tumorales de hidrogel, lo que permite un cultivo prolongado y el transporte de un recipiente a otro con una espátula. Las pruebas de diferentes hidrogeles que contienen colágeno y alginato mostraron la mayor viabilidad celular en combinación con una rebanada de hidrogel estable y duradera cuando se utilizó una biotinta con 0,5% de alginato y 20% de colágeno (datos no mostrados). Además de los componentes, el diámetro del corte del tumor de hidrogel de 0,8 cm se asemeja aún más al diámetro medio de los ganglios linfáticos de 1 cm35. Las imágenes en 3D en vivo de los cortes de tumor de hidrogel mostraron además una distribución uniforme de las células (Figura 2C).

Aquí, la capacidad de tratar las rodajas de hidrogel con medicamentos se demostró mediante el tratamiento con doxorrubicina, que forma parte de la terapia R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona), una terapia estándar para subgrupos de pacientes con LCM de mayor edad24. En comparación con los cultivos 2D, las influencias del microambiente tumoral en los efectos del tratamiento se pueden estudiar en los cortes de tumor de hidrogel. Como se muestra en la Figura 3, las células Jeko-1 cultivadas en rodajas de hidrogel fueron más resistentes al tratamiento con doxorrubicina que las células cultivadas en 2D. Esto está en línea con las observaciones de que la matriz extracelular puede influir en las respuestas a los medicamentos y, con frecuencia, mejorar la resistencia a los medicamentos mediante la modulación de la rigidez tumoral36, la comunicación célula-célula37 y la administración de fármacos38. Además, el análisis de citometría de flujo, así como la tinción inmunohistoquímica o de inmunofluorescencia multiplex, pueden proporcionar información más profunda sobre la respuesta al tratamiento de células individuales en los cortes de tumor de hidrogel.

En conclusión, este protocolo describe la generación y el cultivo de cortes tumorales de hidrogel, que representan un modelo de ganglios linfáticos 3D que imita la estructura tridimensional nativa de los ganglios linfáticos. Tiene el potencial de expandir la aplicación de las células MCL a otras indicaciones de linfoma primario.

Divulgaciones

Este estudio fue apoyado por la Fundación Robert-Bosch y el Ministerio de Ciencia, Investigación y Artes de Baden-Württemberg (3R-Network BW).

Agradecimientos

Agradecemos a Kerstin Willecke por su excelente asistencia técnica y a Yang Zhang por su valiosa ayuda con el análisis de imágenes en 3D.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
µ-slide 8 Pocillos Fondo de Vidrioibidi GmbH80827Portaobjetos con fondo de vidrio utilizados para imágenes en vivo de cortes de hidrogel
10x PBSCarl Roth GmbH + Co.KG9150.1Componente Bioink
10X RPMI-1640 MedioSigma-AldrichR1145Componente Bioink
Jeringa hermética a gas de 2,5 ml Modelo 1002 TLLHamilton81420Jeringa para bioimpresión
Impresora de extrusión 3D, PrintrBot SimplePrintrbotAutomodificado para permitir la impresión de biotintas
Placa de 6 pocillosTh. Geyer GmbH & Co.KG7696790Cultivo de las rodajas de hidrogel
Sistemas de filtración al vacío para la parte superior de la botella, membrana PES, 500 ml, 0,22 µ tamaño de poro m, 70  membrana de mm de diámetroCorning Inc.513-3355Filtración estéril de tampones
Cloruro de calcio deshidratadoCarl Roth GmbH + Co.KGT885.2Componente del tampón de lavado y la suspensión de gelatina
Colágeno I de rataCorning Inc.CLS354249Componente Bioink
Software Cura Versión 15.04.5 para impresión 3DCreador de ultisurfSoftware utilizado para la impresión 3D
DRAQ5Biostatus Ltd.DR50050Tinción para imágenes en vivo de cortes de hidrogel
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) sal disódica dihidratadaSigma-AldrichE5134Componente del tampón de disolución de alginato
Contador automático de células EVENano EnTek Inc.10027-452Contador de células
Placas de Petri bacteriológicas Falcon con tapa, 35 mm de diámetroHalcón351008Relleno de lechada de gelatina para formar el baño de soporte para la bioimpresión
Tubos Falcon, 50 mLSarstedt AG & Co.KG62.547.254
Suero fetal de terneroSigma-AldrichS0615Suplemento de medio de cultivo celular
Gelatina de piel de cerdoSigma-AldrichG1890Componente principal de la suspensión de gelatina
HEPES, ácido libre, grado de biología molecularMerck KGaACAS 7365-45-9Componente del tampón de lavado y la suspensión de gelatina
Línea celular Jeko-1 MCLATCCCRL-3006Línea celular MCL
Toallitas de precisión KIMTECH ScienceCorporación Kimberly Clark7551Se utiliza para extraer el exceso de agua de la suspensión de gelatina y para eliminar las gotas de la boquilla de la impresora 3D
Software LAS X Versión 3.5.7.23225LeicaSoftware utilizado para reconstrucciones 3D
Microscopio de barrido láser confocal Leica TCS SP8LeicaTCS SP8Microscopio confocal para imágenes en vivo
Mason Jar Pinta Regular 16 ozCorporación de bolasG001Frasco en el que se prepara la lechada de gelatina
Matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido (GFR) de MatrigelCorning Inc.356231Componente Bioink
Inserto de cultivo celular Millicell, 0.4 µ m tamaño de poroMerck KGaAPICMORG 50Soporte de filtro para rodajas de hidrogel
Sustrato NucView 405 Caspase-3, 1 mM en 1x PBSBiotio10405Tinción para imágenes en vivo de cortes de hidrogel
Licuadora de la serie profesional OsterOsterBPST02-B00Licuadora para generar lechada de gelatina
Penicilina/EstreptamicinaGibco15140163Suplemento para medio de cultivo celular MCL
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-ReagenzienInvitrogenP7589Tinción para imágenes en vivo de cortes de hidrogel
Rotina 35 RHettich24573Centrifugación de células
Centrífuga ROTINA 38/38RHettichZ720109Centrifugación de lechada de gelatina
RPMI-1640 + GlutaMAXGibco61870036Base del medio de cultivo para células MCL
Alginato de sodioCooperación FMCGQ9109901Componente Bioink
Cloruro de sodioMerck KGaA1.06404Componente del tampón de disolución de alginato
Citrato de sodioCarl Roth GmbH + Co.KG3580.1Componente del tampón de disolución de alginato
Cánulas de aplicación roma Sterican 21G 0,8x22 mmB. Braun9180109Boquilla para impresión 3D
Tetrametilrodamina-metiléster-perclorato (TMRM)Sigma-AldrichT5428Tinción para imágenes en vivo de cortes de hidrogel
Azul de tripano, 0,4%Sigma-AldrichT8154Tinción para análisis de viabilidad
Termómetro resistente al aguaVWR620-2099Termómetro para controlar la temperatura de la suspensión de gelatina

Referencias

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