Imágenes en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía e interacciones con sinapsis en retina murina enferma

Summary

Este artículo demuestra un método para visualizar y cuantificar la motilidad y el contacto de la microglía con puntos postsinápticos en la retina mediante microscopía confocal de disco giratorio.

Abstract

La microglía son los macrófagos residentes del sistema nervioso central (SNC) que responden a infecciones y lesiones tisulares. Además de su papel en la inflamación, la microglía desempeña un papel en el desarrollo del refinamiento de circuitos mediante la poda sináptica. Sin embargo, los mecanismos de poda sináptica en la neuroinflamación y neurodegeneración siguen siendo desconocidos. En este protocolo, utilizamos un modelo explant de retina de ratón para estudiar la dinámica de la microglía ex vivo. Para examinar la motilidad de la microglía y sus interacciones con proteínas postsinápticas, etiquetamos sinapsis con AAV-PSD95-RFP y grabamos vídeos en timelapse de microglía móvil colocalizada con proteínas postsinápticas mediante microscopía confocal de disco giratorio. Luego creamos reconstrucciones superficiales y puntuales de la microglía y PSD95 utilizando software de análisis de imágenes. Datos como la longitud del desplazamiento de la microglía, la velocidad del proceso y el contacto con puntos postsinápticos pueden extraerse de estas superficies para comprender el comportamiento de la microglía tanto en estados homeostáticos como tras una lesión neuronal. Este protocolo puede ser útil para examinar el papel de la microglía en la poda sináptica en enfermedades neurodegenerativas retinianas.

Introduction

La función de los circuitos y la homeostasis dependen de una activación sinápsica altamente regulada y otras interacciones únicas entre varios tipos^{celulares 1}. Actuando como macrófagos residentes del sistema nervioso central (SNC), las microglías son una población no neuronal en la retina que desempeña un papel único en la poda sináptica. Durante el desarrollo del SNC, la microglía puede sinapsis no funcionales o débiles para refinar la circuitería^{neuronal 2}. La microglía en el cerebro en desarrollo examina su entorno y está preparada para un papel neuroprotector durante los periodos^{críticos 3}. En el desarrollo del sistema visual, la microglía es reguladora clave en el desarrollo de neuronas corticales e interneuronas, además de mostrar cambios morfológicos durante periodos críticos de remodelación^{sináptica 4}. De manera similar, en la retina en desarrollo, la microglía despeja las células apoptóticas para dar paso a nuevas conexiones sinápticas, confirmado con la regulación al alza del marcador homeostático P2Ry12 durante estos eventos^{de aclaramiento 5}. Sin embargo, hallazgos recientes destacan que la microglía puede no desempeñar un papel definitivo en el refinamiento de la circuitería neuronal en el sistema visual^{en desarrollo 6}, subrayando que existe controversia sobre el papel que juega la microglía en el desarrollo de circuitos visuales.

En contextos de lesiones, la microglía cambia la morfología a un estado activo y puede desempeñar un papel neurodegenerativo. Por ejemplo, la microglía en modelos de enfermedad de Alzheimer mostró un aumento de la absorción de placas amiloides-beta⁷ y marcadores sinápticos como SPH y PSD95-8. En la neurodegeneración retiniana, muchos grupos de investigación han encontrado microglía con material sináptico engullido, pero no hay evidencia clara de engullecimiento activo de sinapsis^intactas 9,10,11,12,13. Por ejemplo, He et al. encontraron que la microglía aumenta en número y aumenta el volumen de material sináptico engullido en un modelo de retinitis^{pigmentosa 9}, pero no está claro si hubo fagocitosis de sinapsis intactas frente a eliminación de residuos. Además, las clasificaciones microgliales tradicionales —como "reposo vs. activado" o "M1 vs. M2"— están simplificadas en exceso y son cada vez más inexactas según los conocimientos modernos. La microglía existe en un gradiente de estados, no en categorías^{discretas 12}. Por ello, Paolicelli et al. pidieron un cambio de clasificaciones binarias obsoletas hacia una nomenclatura más matizada y rigurosamente definida para los estados microgliales, con el fin de comprender y definir mejor la morfología y actividad de la^{microglía 12}. Por lo tanto, las estrategias para evaluar la función de la microglía ex vivo e in vivo aumentarán la capacidad del campo para discernir estados y actividad de la microglía tanto en contextos de desarrollo como de enfermedades.

Aunque existen estrategias para estudiar la función de la microglía tanto ex vivo como in vivo, la imagen en vivo en vivo tiene varios beneficios. En primer lugar, la claridad corneal o el desarrollo de cataratas no impiden la imagen retiniana, creando una visualización clara de procesos minúsculos y puntos sinápticos. Además, la imagen in vivo requiere más habilidad técnica para montar, lo que hace que las preparaciones ex vivo sean de mayor capacidad, resultando en más animales por experimento. A pesar de los beneficios teóricos que la imagen in vivo puede permitir, se requiere una alta potencia láser (100-230 μW) para capturar la motilidad del proceso microglórico para imágenes^{longitudinales 14,15}. Sin embargo, la imagen ex vivo de la microglía con menor potencia láser y medios de imagen adecuados puede proporcionar la misma calidad de imagen que la imagen in vivo con la preparación adecuada, aunque el tejido ya no esté in situ.

Hemos demostrado que la microglía aumenta en número, complejidad y movimiento de proceso tras la elevación transitoria de la presión intraocular (PIO)¹⁰. En tejido fijo, esta microgliosis provoca una mayor colocalización con proteínas^{sinápticas 10}. Trabajos previos también han demostrado la pérdida temprana de sinapsis y la degeneración de dendritas de las células ganglionares de la retina (RGCs) en el modelo murino de hipertensión ocular inducida por láser (LIOH) y otros modelos neurodegenerativos 10,16,17,18,19,20. Sin embargo, aún se desconoce si desempeñan un papel activo en la poda de sinapsis o un papel más pasivo en la eliminación de restos celulares, incluidas las sinapsis desensambladas. Como el desensamblaje de sinapsis es una de las primeras características de la neurodegeneración, comprender la dinámica de la microglía y su papel en el desensamblaje de sinapsis es^{fundamental 8,10}. Aquí utilizamos imágenes en vivo para comprender la dinámica de la microglía y su interacción con la proteína de densidad postsináptica excitatoria 95 (PSD95) en las dendritas de los CGR.

Protocol

Los animales se alojaban en la Universidad de California, San Francisco, bajo ciclos de luz de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, y se les daba agua y dieta estándar ad libitum, salvo que se especificara. Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, San Francisco. Consulte la Tabla de Materiales para los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo. En la Figura 1 se muestra una visión general del procedimiento experimental, desde la inyección intravítrea hasta la imagen y el análisis.

1. Producción y eficiencia del virus AAV-PSD95-TagRFP

1. Construye AAV-PSD95-tagRFP tomando la secuencia PSD-95pTagRFP (plásmido Addgene #52671; RRID:Addgene_52671) e insertarlo aguas abajo del promotor CMV en AAV-CMV-GFP tras retirar el GFP (plásmido de Addgene #67634; RRID: Addgene_67634).
2. Prepara el virus usando HEK293T triple transfectado, purificado con PEG/cloroformo, y concentrado hasta un título de^10,12 ip/mL (como se describe en Negrini et al.).²¹.
   NOTA: Este método de producción viral suele producir un título más bajo que la ultracentrifugación, pero para estos experimentos es deseable tener células escasamente^{infectadas 21}. La versión de cápside/serotipo utilizada en estos experimentos era de 7m8 (plásmido de Addgene # 64839; RRID: Addgene_64839).
   1. Prueba la eficiencia del AAV antes de proceder con el protocolo completo de imagen.
      NOTA: Los lectores que implementen este protocolo deben aspirar a un etiquetado escaso de las RGC, ya que el objetivo es identificar y aislar dendritas individuales de las RGC.
3. Verifica la transfección exitosa y luego fija la retina en un 2% de PFA con 1x ACSF. Para proteínas sinápticas, comprueba la señal bajo un microscopio confocal a 63x para verificar la resolución clara del marcaje fluorescente.
   NOTA: La menor concentración de fijación ayuda a preservar el marcaje para las proteínas sinápticas. Si el AAV utilizado no es para componentes sinápticos, los lectores pueden optar por usar un PFA al 4%.

2. Cuidado de ratones e inyecciones intravítreas AAV-PSD95-TagRFP

1. Cruzar ratones albinos CD-1 macho y hembra (cepa 022) con B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (cepa 005582) para producir ratones albinos CD-1 con microglía que expresa EGFP. Esperar un mínimo de cuatro generaciones de retrocruce para usar los ratones heterocigotos macho y hembra Cx3cr1 en experimentos. Mantener y refrescar la cepa tras 10 generaciones de nuevo en el fondo CD-1 para evitar la deriva genética.
2. Anestesiar animales (P30-P60) usando anestesia isoflurana mediante una cámara de inducción con anestesia al 3-5% en oxígeno con un caudal de 1 L/min de oxígeno. Coloque al animal sobre un estereomicroscopio, asegurándose de que el isoflurano se administre continuamente a través de un cono nasal. Para confirmar que el animal está anestesiado, pellizca el dedo del pie al menos 3 veces para confirmarlo.
3. Añade una gota de proparacaína al 0,5% antes de inyectar el AAV. Inyectar 2 μL de AAV-PSD95-RFP lentamente intravítreo en ambos ojos en el limbo superotemporal usando una jeringuilla de 26s G 10 μL. Retira la aguja lentamente para evitar el reflujo del VA a través del lugar de inyección. Aplica pomada antibiótica en los ojos después de la inyección.
4. NOTA: La aguja no debe atravesar más de la mitad de la circunferencia de la cámara vítrea. Al hacerlo, la retina y el cristalino pueden dañarse con la punta de la aguja, lo que puede provocar una transfección irregular o incluso infructuosa. El desarrollo o hemorragia de cataratas indica una técnica de inyección defectuosa.
5. Después de la inyección, confirma que los animales están alerta antes de devolverlos a sus jaulas y habitaciones originales. Si un animal presenta dolor tras la inyección, administre buprenorfina mediante inyección intraperitoneal. Espera 3 semanas para la expresión de la AAV. Si se utiliza un modelo inducible para elevar la presión intraocular (u otra manipulación), esperar 3 semanas antes de inducir una presión intraocular elevada en un ojo, utilizando el ojo contralateral o los ojos de un animal ingenuo como control.

3. Eutanasia y montaje plano retiniano

1. Preparar una solución fresca 1x de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, pH 7,4) en 1x PBS que contenga los siguientes componentes en mM: 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgCl 2,6H ₂O, 2,5 CaCl_{2,2H 2}O, 1_{NaHPO 4}, 11 glucosa y 20 HEPES).
2. Oxigena la solución durante al menos 15 minutos antes de usarla para la disección aguda. Conecta el tubo a un tanque de oxígeno y coloca un tapón con un agujero en el centro para evitar que el gas escape.
3. Eutanasiar al ratón con al menos 1 mL de anestesia isoflurana en una pequeña cámara de inducción, seguida de una luxación cervical. Marca el lado nasal de la córnea con un marcador antes de enuclear para que la localización de la retina pueda ser rastreada durante todo el experimento.
   1. Para enuclear los ojos inyectados con microperlas o con láser, realiza una peritomía conjuntival limitada y coloca las tijeras detrás del ojo para diseccionar el ojo en la base del nervio óptico. Esto permite que el delicado ojo permanezca intacto.
4. Usando un microscopio de disección, haz un pequeño orificio con una aguja de 23 G o 25 G en la córnea, lo que permite que el ACSF oxigenado perfunda el ojo. Introduce unas tijeras en este agujero para hacer un corte fiduciario en la nariz.
5. Corta el resto de la córnea y el iris en el limbo.
6. Quita el iris y la lente. Si la retina se pega al cristalino, sepáralo con pinzas.
7. Separa la retina de la esclerótica usando pinzas para diseccionar suavemente entre la EPR y la retina neural.
8. Coloca la retina en el lado no cuadriculado de un papel filtro de membrana de Ésteres Mixtos de Celulosa (MCE) para una visualización y imagen clara.
9. Haz pequeños cortes relajantes en la retina en los otros tres cuadrantes, siendo el corte más largo en la retina nasal para seguir la localización retiniana.
   NOTA: La retina debería parecer un trébol de cuatro hojas.
10. Transfiere la retina del papel filtro a una toallita de laboratorio. Usa una gota de ACSF para humedecer la retina y luego usa la toallita para secar el papel filtro. Repite durante al menos 8-10 gotas para que la retina se adhiera al papel filtrante.
11. Coloca la retina en una cámara oxigenadora mientras diseccionas el ojo contralateral.
12. Cuando esté listo para la imagen, seca el papel de filtro como se menciona en el paso 3.10 e invierte la retina sobre una placa de Petri de Matek. Pesa la retina con cuentas metálicas o un anillo. Añade de 3 a 5 gotas de ACSF.
    NOTA: Las pequeñas cuentas metálicas, como las de un baño de cuentas metálicas o de un anillo, tienen suficiente tamaño y peso para evitar la deriva sin alterar la integridad retiniana.
13. Crea un anillo tomando un alambre de acero y cuerdas de nailon estiradas, pegando y añadiendo un peso para obtener un anillo con cuerdas paralelas fijas y tensas.
    1. Envuelve el alambre alrededor de un cilindro de media pulgada de diámetro y tira con un alicate tenso. Corta cada anillo del cilindro y aplana entre una prensa.
    2. Lija el anillo en una cara para que quede rugoso y plano. Estira cuerdas de nailon sobre la abertura de una botella de 1-2 pulgadas de diámetro y mantenla en su sitio con gomas elásticas.
    3. Coloca el anillo sobre las cuerdas de nylon y pégalo cuidadosamente a las cuerdas de nailon aplicando pequeñas cantidades de pegamento a lo largo del perímetro interior del anillo. Después, coloca un peso ligero sobre el anillo, por ejemplo, una moneda o un alambre metálico delgado, para sujetar el anillo en su sitio.
    4. Después de secarlos, corta las cuerdas de nylon del borde exterior del anillo usando tijeras de precisión. El resultado son cuerdas fijas paralelas que extienden tensamente el diámetro del anillo.
    5. Si la densidad de la cuerda de nailon dentro del anillo es demasiado alta, corta cuerdas individuales con tijeras de muelle de microdisección para adaptarlas a las necesidades del experimento.
       NOTA: El proceso de disección y montaje solo debería durar ~5 minutos. Cuanto más rápido tarde el tejido en estar en condiciones fisiológicas equilibradas ex vivo, más sano será el tejido.

4. Adquisición de confocales de disco giratorio

NOTA: Enciende la cámara de humidificación al 5% de_CO2 y déjala funcionar al menos 1 hora antes de hacer la imagen. Permitir que el sistema y la muestra alcancen el equilibrio térmico ayudará a reducir la deriva.

1. Empieza a escanear el ocular a 10x para enfocar la microglía. Al escanear el tejido en busca de áreas a imaginar, utiliza el canal de la microglía como referencia y céntrate solo en la microglía que tenga puntos sinápticos brillantes colocalizados (dentro de 10-20 μm). Como el marcaje de AAV no es homogéneo en todo el tejido, escanea las áreas que tienen microglía y puntos colocalizados dentro del mismo plano. Una vez que se haya localizado un área que cumpla estos criterios, cambia a 60x para enfocar y luego a modo cámara haciendo clic en el botón de cámara .
   1. Usando el software del sistema de imagen, haz clic derecho en la pantalla para encontrar la navegación xy. Aparecerá una pantalla de vista previa que puede escanear el tejido creando un marco de 3 x 3, 5 x 5, o un tamaño personalizado para detectar áreas óptimas. Utiliza el tamaño de fotograma de 3 x 3 o 5 x 5 y pantalla con un canal de referencia para evitar el fotoblanqueo continuo.
      NOTA: Para este protocolo, usamos el canal de microglía.
2. Fotografía la retina montada rápidamente con un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo 60x (NA 1,49).
3. Para previsualizar la muestra, haz clic derecho en la pantalla, selecciona En directo y haz clic en el botón de ajuste automático para que el sistema ajuste la vista según las LUTs actuales. Para ajustar los ajustes del láser, selecciona primero cada canal individualmente y ajusta la potencia y la exposición del láser según sea necesario. Luego, haz clic derecho en el fluoróforo para Asignar ajustes al microscopio y guarda los ajustes personalizados, ya que el software no los guarda al cambiar de canal.
   1. Cambia al siguiente canal y ajusta según sea necesario. Haz clic derecho en el fluoróforo para guardar la configuración. Si adquieres varios canales en el mismo fotograma, introduce los mismos valores que se usan después de previsualizar cada canal individualmente. Haz clic derecho en el fluoróforo para guardar la configuración.
   2. Para adquisición multicanal, selecciona los canales de interés en la pestaña Lambda . Para imágenes en vivo, combina todos los canales en un solo canal para capturar rápidamente el movimiento fino de la celda de interés y permitir que cada canal se adquira simultáneamente, en lugar de por separado, lo que puede generar un retraso en el timelapse dependiendo de la velocidad de la celda.
4. Procede a conseguir un timelapse para el tiempo deseado.
   1. En la pestaña de tiempo de la esquina inferior izquierda, introduce un time lapse de 5-10 minutos con un intervalo de 20 s.
   2. En la pestaña de ajustes de adquisición a la derecha, ajusta la resolución de imagen a 608 x 832 con un tamaño de píxel de 0,12 μm.
   3. Recoge imágenes en 10 - 20 μm utilizando un paso de 0,3 μm para asegurar una resolución aceptable de los procesos finos de la microglía y los puntos sinápticos a lo largo del eje z. Para asegurar un seguimiento de celdas exitoso, mantén el intervalo de tiempo entre fotogramas en 20 - 30 s.
      NOTA: Debido a la fragilidad del tejido ex vivo, se recomienda obtener imágenes de la retina experimental primero y no durante más de una hora. Esto es para normalizar la condición del ojo control contralateral, que debería estar en una cámara oxigenada mientras se obtiene la imagen de la primera retina.
5. Utiliza este protocolo para obtener imágenes de las capas más superficiales de la retina. Al adquirir lapsos de tiempo superiores a 20 μm, resulta más difícil capturar el movimiento fino del proceso durante los intervalos de 20 s. Por lo tanto, solo microglía de imagen que encajen dentro del pila de 20 μm.

5. Seguimiento del análisis y exportación de datos

1. Renderizado de superficies para microglía
   1. Convierte el archivo timelapse a formato IMS usando el software de conversión de archivos. Introduce los siguientes tamaños de vóxeles basados en las propiedades de imagen adquiridas en el paso 4.2: x = 0,1272423 micras, y = 0,1272423 micras, z = 0,3 micras.
   2. Una vez lanzado, el software de análisis comenzará en Arena. Haz clic en la carpeta Observar para abrir el archivo que ya había convertido. Asegúrate de que la imagen esté en vista 3D.
   3. Para detectar microglias individuales completas, haz clic en el icono de la superficie azul en la barra de herramientas de objetos . Selecciona las tres últimas opciones en Configuración del algoritmo : Seguimiento de superficies (a lo largo del tiempo), Clasificar superficies y Estadísticas objeto-objeto. Haz clic en el botón azul de reproducir para pasar al siguiente paso.
      1. En caso de múltiples microglías, selecciona Segmentar solo una Región de Interés (ROI) para asegurar que existan microglías individuales dentro de un objeto superficial. Configura los parámetros x, y y z en consecuencia para formar solo una superficie de la microglía individual de interés.
   4. Selecciona el canal para el que se creará un renderizado de superficie. Si lo deseas, selecciona Suavizado para suavizar la creación de la superficie y utiliza una proporción 1:1 - 1,25 respecto al tamaño voxel de la imagen. Por ejemplo, si la imagen tiene un tamaño de vóxel de 0,12 x 0,12 x 0,3 μm, fije el detalle de la superficie en 0,15 - 0,16 μm. En umbral, selecciona Segmentación por Aprendizaje Automático para entrenar al software en la detección de las celdas de interés.
      NOTA: Este siguiente paso consiste en enviar datos de entrenamiento a Imaris AI mediante Segmentación por Aprendizaje Automático.
   5. En Datos de Entrenamiento, observa las dos herramientas de pincel: Fondo (para detectar fondo) y Primer Plano (para detectar la señal real de la muestra). Dibuja pinceladas seleccionando el pincel deseado y usando el botón Shift + Click izquierdo . Asegúrate de que Interpolar Pantalla esté seleccionada en Configuración. Selecciona Entrenar y Predecir para introducir los datos de entrenamiento de las pinceladas hechas.
      NOTA: Alimentar más de seis caricias resulta en un tiempo de procesamiento más largo para la IA y en una captura inprecisa de la célula.
      1. Usa el puntero amarillo del centro para moverte por la pila z. Dibuja varias pinceladas a lo largo de los planos x, y y z, así como en algunos (no todos) periodos de tiempo del timelapse. Haz 3-5 pinceladas cortas por entrada, ya que la IA aprende mejor con pequeños fragmentos de información a la vez. Ajusta este paso iterativamente con cada entrada hasta que se cree una superficie precisa de la célula.
      2. Selecciona el rectángulo amarillo para alternar entre la pantalla de entrenamiento y la superficie real creada como comprobación final. También comprueba a lo largo del lapso de tiempo que la superficie representa con precisión la celda.
   6. Una vez logrado el renderizado preciso de la superficie, se pasa al siguiente paso. Desactiva los objetos divididos.
   7. Ajusta el número de vóxeles en el histograma. Mueve el umbral para eliminar objetos pequeños que no estén conectados a la superficie principal.
      NOTA: Este paso se utiliza para eliminar cualquier superficie pequeña no deseada que se haya creado debido al ruido de fondo. El objetivo es eliminar cualquier superficie que no esté conectada al cuerpo celular principal de interés.
   8. Después, edita la superficie según sea necesario. Limpia manualmente cualquier objeto que no forme parte de la superficie principal o corte los bordes usando la herramienta tijera según sea necesario.
   9. Si se desea, establece un umbral de espacios permitidos que aún puedan asociarse al objeto. Selecciona el algoritmo de seguimiento de la celda en movimiento.
      NOTA: El movimiento autorregresivo es la herramienta más utilizada para el seguimiento de celdas, ya que rastrea el movimiento continuo durante todo el timelapse.
      1. La distancia máxima y el tamaño máximo de la brecha son números definidos por el usuario que establecen puntos significativos de los que la superficie puede desviarse. Establece una distancia máxima de 0,96 μm y un tamaño máximo de 3 (ajustes por defecto).
   10. De forma similar a cómo se filtraban los objetos de la superficie en el paso 5.1.7, las pistas de filtro que no están asociadas a la superficie principal. Esto también se ajusta mediante un histograma. Define dónde establecer el umbral buscando cuándo se eliminan de los ajustes del filtro pequeñas pistas puntuales que duren no más de cinco intervalos de tiempo.
   11. Después, establece clasificaciones si lo deseas. Por ejemplo, categoriza la longitud de desplazamiento entre 0 - 1 μm y 1+ μm para determinar un movimiento de proceso pequeño o un desplazamiento significativamente grande del proceso o celda.
   12. Por último, coloca etiquetas adecuadas en ciertos eventos usando las clasificaciones del paso anterior.
       NOTA: Este paso se utiliza mejor una vez que se han generado puntos para la señal postsináptica.
2. Clasificación puntual para PSD95
   1. Para detectar microglias individuales completas, haz clic en el icono de la superficie azul en la barra de herramientas de objetos . Selecciona las tres últimas opciones en Configuración del algoritmo : Seguimiento de superficies (a lo largo del tiempo), Clasificar superficies y Estadísticas objeto-objeto. Haz clic en el botón azul de reproducir para pasar al siguiente paso.
   2. Selecciona el canal fuente para el marcador sináptico. Desactiva el slicer y cualquier otro canal para visualizar solo PSD95. Utiliza el botón ctrl y la herramienta de selección de punteros para estimar el diámetro xy del punto.
      1. Elige algunos puntos brillantes que duren durante todo el timelapse (tamaño que oscile entre 0,6 μm y 1,2 μm).
      2. Desactiva la resta. Si la imagen requiere resta de fondo, utiliza la herramienta de rescrata de fondo en Procesamiento de Imágenes antes de procesar el timelapse.
   3. Después, añade un filtro basado en la calidad del spot. Arrastra el histograma para que todos los puntos PSD95 se capturen con precisión durante todo el timelapse.
      NOTA: La calidad se basa en la intensidad del centro del punto⁹. Este filtro captura con mayor precisión la señal real del PSD95, en comparación con el número de filtros o diámetros de vóxeles.
   4. A continuación, elimina cualquier punto generado por el ruido usando el paso de edición. Alterna entre el cursor de cubo o el cursor circular para eliminar puntos singulares o múltiples, respectivamente, que solo aparecen durante 1-2 periodos de tiempo debido al ruido.
   5. Si se desea, establece un umbral de espacios permitidos que aún puedan asociarse al objeto. Selecciona el algoritmo de seguimiento adecuado para el marcador sináptico.
      1. La distancia máxima y el tamaño máximo de la brecha son números definidos por el usuario que establecen puntos significativos de los que las manchas pueden desviarse. Establece una distancia máxima de separación de 14,6 μm y un tamaño máximo de 3 (ajustes por defecto).
   6. De forma similar a cómo se filtraron los objetos puntuales en el paso 5.2.3, filtrar pistas que no están asociadas con puntos distintos. Esto también se ajusta mediante un histograma. Para definir dónde establecer el umbral, busca cuándo se eliminan las huellas de objetos pequeños.
   7. Establece clasificaciones si lo deseas. Por ejemplo, distinguir entre puntos engolidos, de contacto o no contactados usando la clasificación de Distancia Más Corta a la Superficie . Colocado envuelto como cualquier punto < 0 μm dentro de la superficie, contactado entre 0 y 0,5 μm de la superficie, o sin contacto como 0,5+ μm de la superficie.
   8. Por último, coloca etiquetas adecuadas en ciertos eventos usando las clasificaciones del paso anterior.
3. Una vez que las superficies y puntos representen con precisión la microglía y puntos de interés, exporta todas las estadísticas de cada objeto en la pestaña de estadísticas . Asegúrese de que se extraigan las estadísticas detalladas, que incluirán la longitud, velocidad y eventos de contacto clasificados.
   1. Muchas estadísticas, como área, volumen, longitud de desplazamiento y velocidad, son salidas de Imaris. Exporta la longitud y velocidad del desplazamiento de la superficie para definir la dinámica de la microglía en el experimento.
      1. Defina la longitud de desplazamiento como la distancia entre la posición inicial y la posición final de la superficie, medida en μm²².
      2. Defina la velocidad como la velocidad instantánea de la superficie de un intervalo de tiempo a otro, medida en μm/^{s 22}.
         NOTA: Los eventos de contacto son un fenómeno descrito por los autores como puntos postsinápticos intactos que comparten una distancia de 0 μm entre microglía individual durante al menos cinco intervalos de tiempo consistentes dentro del lapso de tiempo.

Results

Se fotografiaron microglías de las retinas murinas CX3CR1-GFP utilizando el protocolo descrito. Los ratones iban desde P30 hasta P60 en el momento de la inyección AAV-PSD95-RFP, y habían transcurrido al menos 21 días para permitir la expresión de AAV. Imágenes representativas de la microglía y sus interacciones con los puntos PSD95 antes y después del análisis se muestran en la Figura 2. Para inducir la activación de la micro...

Discussion

Este protocolo permite la visualización y seguimiento de la interacción individual de la microglía con sitios postsinápticos a lo largo de las dendritas de los RGCs. En una enfermedad neurodegenerativa como el glaucoma, la microglía se colocaliza con las sinapsis en la capa plexiforme interna (IPL) de la retina. El papel de la microglía en el desensamblaje sinápsis no se entiende bien. Sin embargo, la microglía puede contribuir a través de varios mecanismos potenciales, incluyendo la abs...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aguja de calibre 25	Alcon	8065420920
Escala 26s 10 y micro; Jeringuilla L	Hamilton	701RNWG
7m8	Addgene	64839	http://n2t.net/addgene:64839
Alambre multipropósito de acero inoxidable 304 doblable y permanecer	Materiales Avanzados de Stanford	SS3368	Alambre de acero para hacer anillos
Cloruro de calcio hexahidrato	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Microscopio de disección	Amscope		Diseccionar y montar retinas
Tijeras de disección	FST	15024-10
D-(+)-glucosa	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Pinzas	Dumont	11252-21
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Imaris 10.0.2	Oxford Instruments		Software de análisis
Convertidor de archivos Imaris	Oxford Instruments
Control del Gel Ultra Superglue Loctite	Loctite	1363589	Pegamento para hacer anillos
Cloruro de Magnesio Hexahidrato	Sigma-Aldrich	M9272-100G
Papel filtro de membrana MCE (13 mm)	Millipore	HABG01300	0,45 & mu; m Tamaño de los poros
Cámara Microambiental	Tokai Hit	STXG-TIZBX-SET
Microscopio invertido Nikon Eclipse Ti2-E	Nikon
Elementos NIS	Nikon
Neomicina y sulfas de polimixina B y bacitracina Ungüento para solución de cinc para oftalámica, USP	Bausch + Lomb	24208-780-55
Pincel Tamaño 00	Amazon
Prism 8.0	GraphPad
Proparacaína Solución Hidroclorhídrica Óptica USP, 0,5%	Sandoz	61314-0016-01
Placa de Petri recubierta con PDL (35 mm)	Matek	P35GC-1.5-14-C	Cubierta nº 1.5
PSD95_pTagRFP	Addgene	52671	http://n2t.net/addgene:52671
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Monohidrato monobásico de fosfato de sodio	Sigma-Aldrich	S9638-25G