Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Summary

Este protocolo combina la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular para aislar y caracterizar los estados de las células microgliales en el cerebelo de los cerebros de ratones postnatales tempranos. Utiliza la disociación enzimática, la centrifugación de Percoll y la inmunotinción para revelar la heterogeneidad de la microglía y mejorar la comprensión de sus funciones en el desarrollo y la enfermedad del cerebelo.

Abstract

La microglía, las células inmunitarias residentes del cerebro, exhiben perfiles transcripcionales específicos de la región y el contexto durante el desarrollo y la enfermedad. Este protocolo presenta dos métodos complementarios para estudiar las poblaciones microgliales en tejido cerebeloso de ratón: citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular.

Como primer método utilizado, el protocolo basado en citometría de flujo está optimizado para cerebros postnatales tempranos, lo que garantiza un aislamiento celular robusto y consistencia en todas las condiciones experimentales. Comienza con la disociación tisular mediante digestión enzimática, seguida de la eliminación de mielina mediante centrifugación en gradiente de densidad de Percoll para producir una suspensión de células neurales de alta calidad y una estrategia de activación basada en la expresión de CD45 y CD11b. La tinción viva/muerta garantiza la viabilidad celular, y los anticuerpos conjugados con fluorocromo se utilizan para perfilar la expresión de marcadores de superficie seleccionados en la microglía. Los controles de compensación se realizan utilizando perlas de látex con estrategias de compuerta validadas utilizando el control de fluorescencia menos uno (FMO).

El segundo método implica la secuenciación de ARN unicelular utilizando 10X Genomics, siguiendo los mismos pasos de aislamiento aguas arriba, que permiten el perfil transcriptómico de la microglía en todas las condiciones. Los grupos microgliales se identifican mediante el análisis de expresión génica y el análisis de expresión diferencial se realiza entre grupos experimentales. Un clasificador de bosque aleatorio se aplica únicamente para distinguir muestras masculinas y femeninas cuando se multiplexan.

Juntos, estos protocolos reproducibles y adaptables proporcionan un marco sólido para investigar la diversidad microglial en el cerebelo durante el desarrollo temprano del cerebro y su posible alteración después de perturbaciones experimentales.

Introduction

El período postnatal temprano es una fase crítica para el desarrollo del cerebro, caracterizada por procesos celulares y moleculares complejos que sientan las bases de las funciones cognitivas, emocionales y conductuales¹. Sin embargo, este período también está marcado por la vulnerabilidad, ya que las interrupciones pueden alterar las trayectorias del neurodesarrollo y provocar trastornos neurológicos o psiquiátricos a largo plazo. La microglía, las células inmunitarias residentes del cerebro, desempeñan un papel central en la configuración del cerebro en desarrollo a través de la poda sináptica, la fagocitosis, la vigilancia inmunológica y las respuestas a las agresiones ambientales ^2,3. Estas células exhiben una notable plasticidad, adoptando perfiles transcripcionales que varían según la región cerebral, la etapa de desarrollo y el contexto patológico ^4,5.

El análisis preciso de la activación de la microglía en el cerebro en desarrollo requiere metodologías robustas y repetibles capaces de analizar sus fenotipos dinámicos en el contexto de tejidos cerebrales inmaduros. La citometría de flujo proporciona una solución confiable, lo que permite la caracterización de alto rendimiento de poblaciones celulares y la expresión de marcadores⁶. Sin embargo, su aplicación en el estudio de la microglía de los cerebros postnatales tempranos es técnicamente desafiante debido a la naturaleza delicada del tejido y la necesidad de protocolos eficientes de aislamiento y enriquecimiento celular ^7,8.

El protocolo presentado aquí combina citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) para aislar y caracterizar la microglía de cerebros de ratones postnatales tempranos, con un enfoque particular en el cerebelo desde el día postnatal 3 (P3) hasta el día postnatal 30 (P30)⁹, una región y etapa de desarrollo para la cual las referencias metodológicas detalladas siguen siendo limitadas.

Este flujo de trabajo incluye disociación enzimática, centrifugación en gradiente de densidad para la eliminación de residuos y enriquecimiento celular, e inmunotinción mediante un panel de marcadores extracelulares e intracelulares. Para caracterizar la diversidad de la microglía, se emplea una variedad de marcadores de superficie e intracelulares^10,11. En lugar de asignar etiquetas fijas (inflamatorias o reparadoras), el protocolo define subpoblaciones basadas en perfiles de expresión de marcadores discretos. Por ejemplo, la microglía que expresa CD80, CD86 e iNOS, CD206 y Arg1, CD86 y CD64, o CD163 y CD206 se identifican y analizan como subconjuntos molecularmente distintos. Estos marcadores reflejan diferentes estados de microglía activada^10,11 y se presentan como perfiles de expresión.

Esta estrategia de activación multiparamétrica permite la identificación precisa de subconjuntos microgliales basados en la expresión de marcadores de superficie, ofreciendo un marco simplificado para analizar la heterogeneidad inmune durante el desarrollo cerebral postnatal. Para ampliar el perfil fenotípico y descubrir la diversidad transcripcional, se realiza la secuenciación de ARN unicelular después del aislamiento celular. Este estudio establece un flujo de trabajo consistente y escalable para avanzar en la comprensión de los procesos de neurodesarrollo y el impacto a largo plazo de la activación microglial. Al integrar la citometría de flujo optimizada y scRNA-seq dentro de un marco informado por el desarrollo y la región, este protocolo sirve como una herramienta poderosa para investigar la biología microglial de la vida temprana y su relevancia para los resultados del desarrollo neurológico.

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el comité ético del Centro de Investigación CHU Sainte-Justine y cumplen con las pautas y políticas del Centro de Investigación Ste-Justine y la Universidad de Montreal (Montreal, Quebec, Canadá).

1. Aislamiento celular del cerebro

1. Después de los procedimientos de anestesia / eutanasia, extraiga rápidamente todo el cerebro de la cavidad craneal y colóquelo en un tubo de 15 ml que contenga medio de cultivo de células microgliales (consulte la Tabla de materiales). Mantenga el tubo en hielo. Repita el mismo procedimiento para ratones adicionales si es necesario.
   Todos los ratones utilizados en este estudio se derivaron de colonias de cría internas en el laboratorio del Dr. Tremblay. Los ratones experimentales se generaron cruzando ratones B6.129-Cx3Cr1 ^{CreERT2-EYFP / WT} con ratones B6-Rosa26^{iDTR / WT}, ambos originalmente procedentes de Jackson Laboratories. Esta estrategia de reproducción produjo descendencia heterocigota para el alelo IDTR, lo que permitió el agotamiento condicional de las células que expresan Cx3Cr1 (principalmente microglía) a través de un sistema Cre-loxP inducible por tamoxifeno. Antes de la recolección de tejido, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de ketamina (150 μg / g) y xilacina (10 μg / g). La eutanasia se realizó por decapitación bajo anestesia profunda, de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.
2. Conserve todo el cerebro o proceda con la disección de regiones específicas si lo desea. Realice la disección en una pequeña placa de Petri que contenga medio de cultivo celular microglial (consulte la tabla de materiales) en hielo para mantener la viabilidad celular.
   NOTA: Este protocolo ha sido validado para todo el cerebro y el cerebelo de P1 a P30.
3. Retire el medio de cultivo de células microgliales y corte finamente el tejido cerebral con un bisturí en una placa de Petri.
4. Para la digestión enzimática, transfiera el tejido homogeneizado a tubos de 5 ml. Agregue 2 ml de HBSS (1x) suplementado con 2 mg/ml de colagenasa D y 14 μg/ml de ADNasa I (ver Tabla 1). Selle las tapas de los tubos con parafilm. Incubar los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 15 min, agitando el tubo cada 5 min. Para detener la digestión, coloque los tubos sobre hielo.
5. Pase el homogeneizado a través de un filtro de malla metálica de 140 μm (consulte la tabla de materiales) para eliminar los residuos grandes. Use un mortero de vidrio para disociar las células.
6. Lave el filtro varias veces con medio de cultivo de células microgliales (3 ml por lavado).
7. Recoja el filtrado con una pipeta de 10 ml y transfiéralo a un tubo de 15 ml. Centrifugar la solución a 500 g durante 7 min a 4 °C.
8. Deseche el sobrenadante invirtiendo cuidadosamente el tubo. Vuelva a suspender el gránulo raspando suavemente en una rejilla.
9. Agregue 10 ml de una solución de medio coloidal a base de sílice al 37% (ver Tabla 1) para eliminar la mielina y los desechos. Centrifugar la solución a 500 g durante 10 min a 4 °C con una fuerza de frenado mínima.
10. Aspire la capa de mielina en la parte superior de la solución con una pipeta de 10 ml.
    NOTA: La aspiración continua evita que la mielina se mezcle nuevamente con la solución.
11. Lavar las células añadiendo 10 ml de HBSS (1x) y centrifugar a 500 × g durante 7 min a 4 °C.
12. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo raspando suavemente con una rejilla, luego agregue 10 ml de tampón de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (consulte la Tabla 1). Centrifugar la solución a 500 g durante 10 min a 4 °C.
13. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo final y retenga las células. Las células aisladas ahora están listas para la tinción por citometría de flujo o la secuenciación de ARN unicelular.
14. Para el aislamiento de secuenciación de ARN unicelular, cuente las células bajo un microscopio utilizando reactivos fluorescentes estables en la mesa (consulte la Tabla de materiales) para distinguir las células nucleadas vivas y muertas, junto con el azul de tripano (consulte la Tabla de materiales). Asegurar que las células estén en excelentes condiciones, con una viabilidad de hasta el 90%, y alcanzar una concentración de 1000 células/μL). Los siguientes pasos se describen en la sección 9.1.
    NOTA: Mantenga los tubos en hielo durante todo el protocolo. Todos los pasos de centrifugación deben realizarse a 4 °C con un freno máximo, excepto el paso Percoll, donde se especifica un freno mínimo. Para obtener los mejores resultados, realice todo el protocolo el mismo día. Para el filtro del protocolo de secuenciación de ARN unicelular todas las soluciones utilizadas para el aislamiento, en el paso 1.11, use HBSS (1x) para el segundo lavado y, en el paso 1.12, retenga 70-100 μL de la solución celular.

2. Protocolo de tinción extracelular por citometría de flujo

1. Transfiera todas las celdas a una placa de 96 pocillos con un fondo cónico (consulte la Tabla de materiales). Centrifugar la placa a 500 g durante 5 min a 4 °C.
2. Invierta rápidamente la placa para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento.
3. Vuelva a suspender el sedimento celular en 25 μl de solución bloqueante (ver Tabla 1). Incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
4. Para preparar la mezcla de tinción de anticuerpos extracelulares (ver Tabla 2), centrifugar las existencias de anticuerpos a 10.000 × g para eliminar los agregados potenciales. Sin alterar el sedimento, aspire cuidadosamente el volumen deseado del sobrenadante para preparar la mezcla de tinción y ajuste el volumen a 25 μL con FACS Buffer.
5. Agregue 25 μL de la mezcla de anticuerpos extracelulares a cada pocillo. Incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Antes del uso experimental, todos los anticuerpos se ajustaron en suspensiones unicelulares cerebelosas (o cerebrales) para determinar la concentración óptima de trabajo. La titulación se realizó mediante diluciones en serie para generar una curva de saturación, y se seleccionó la dilución correspondiente a una meseta de señal con un fondo mínimo para la puesta en escena de la señal.
6. Sin mezclar, agregue 150 μL de tampón FACS a los pocillos. Centrifugar la placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Invierta la placa para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento.
7. Vuelva a suspender el sedimento celular en 200 μL de tampón FACS. Centrifugar la placa a 500 × g durante 5 min a 4 °C. Invierta la placa para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento. Repita el lavado una vez más utilizando 200 μL de tampón FACS en las mismas condiciones.

3. Tinción intracelular

1. Vuelva a suspender las células en 100 μL de tampón de saponina-paraformaldehído (PFA) (consulte la Tabla 1) para fijar y permeabilizar las células. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
2. Sin mezclar, añadir 100 μl de tampón de saponina (véase el cuadro 1). Centrifugar la placa a 500 × g durante 6 min a 4 °C. Invierta la placa para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento.
3. Vuelva a suspender el sedimento celular en 200 μL de tampón de saponina. Prepare controles de compensación agregando 20 μL de perlas (consulte la Tabla de materiales) a 11 pocillos vacíos. Centrifugar la placa a 500 × g durante 6 min a 4 °C. Invierta la placa para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento.
4. Para preparar la mezcla de tinción de anticuerpos intracelulares (ver Tabla 3), centrifugar existencias de anticuerpos a 10.000 × g para eliminar posibles agregados. Sin alterar el sedimento, aspire cuidadosamente el volumen deseado del sobrenadante para preparar la mezcla de tinción y ajuste el volumen a 50 μL con tampón de saponina.
5. Vuelva a suspender el sedimento en 50 μL de mezcla de anticuerpos intracelulares (ver en la Tabla 3). Agregue 1 μL de cada anticuerpo a los pocillos de perlas. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
6. Sin mezclar, agregue 150 μL de tampón de saponina a cada pocillo de muestra celular y agregue 100 μL de tampón FACS a cada pocillo que contenga los controles de compensación para lavar las perlas. Centrifugar la placa a 500 × g durante 6 min a 4 °C. Invierta la placa para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento.
7. Vuelva a suspender el sedimento celular en 200 μL de tampón de saponina y vuelva a suspender los controles de compensación en 200 μL de tampón FACS. Centrifugar la placa a 500 × g durante 6 min a 4 °C. Invierta la placa para eliminar el sobrenadante con un solo movimiento. Repita el lavado una vez más utilizando 200 μL de tampón de saponina en las mismas condiciones.
8. Vuelva a suspender las celdas y los controles de compensación en 200 μL de tampón FACS. Transfiera la suspensión a un tubo FACS y guárdela a 4 °C hasta la adquisición de citometría de flujo.
   NOTA: Asegúrese de que todos los pasos que involucran reactivos sensibles a la luz se realicen en condiciones mínimas de luz. Un pocillo de perlas no contiene anticuerpos, lo que corresponde al tubo de perlas sin teñir.

4. Adquisición por citometría de flujo

1. Encienda el citómetro de flujo y luego la computadora.
2. Abra el software del citómetro de flujo e inicie el inicio de los fluidos seleccionando Ejecutar en la pestaña del citómetro.
3. Para crear una nueva carpeta de experimentos, haga clic en Nueva carpeta y asigne un nombre. A continuación, haga clic en Nuevo experimento para asignar un nombre al experimento y seleccione Nuevo tubo para agregar una muestra y un tubo de muestra.

5. Configurar controles de compensación

1. Prepare perlas de compensación de tinción única para cada fluorocromo utilizado en el panel, junto con un control sin teñir.
2. Cargue los tubos de compensación en el citómetro. Establezca los voltajes de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) en aproximadamente 250.
3. Ajuste los voltajes para cada canal fluorescente para que la población negativa esté en la primera década del eje.
4. Adquirir al menos 5,000 eventos por tubo.
5. Utilice la matriz de compensación para ajustar la superposición espectral hasta que todos los picos positivos estén claramente separados de la población negativa y centrados por encima de 10⁴ en el eje respectivo.
   NOTA: Se deben realizar controles de compensación para cada experimento, ya que la configuración del citómetro o el rendimiento del fluorocromo pueden afectar significativamente la superposición espectral. Aunque se recomiendan controles de compensación basados en células en algunas aplicaciones de tejido cerebral, se utilizaron perlas de captura de anticuerpos en este protocolo debido al menor número de microglía que se puede obtener del cerebelo de ratón P3, lo que limita la viabilidad de la compensación basada en células. La fluorescencia de anticuerpos se validó inicialmente en células derivadas del cerebro y se encontró que era comparable a las señales basadas en perlas. Incluya una suspensión celular derivada del cerebro sin teñir durante la optimización inicial del panel para evaluar la autofluorescencia del tejido y establecer los niveles de señal de referencia. Este control es esencial para establecer correctamente las poblaciones negativas en cada canal fluorescente.

6. Preparar y adquirir controles FMO

1. Para cada marcador clave, prepare un control de fluorescencia menos uno (FMO) que incluya todos los anticuerpos excepto el que se está probando.
2. Ejecute los controles FMO utilizando la misma configuración de adquisición que las muestras completamente teñidas.
3. Utilice gráficos FMO para definir umbrales de compuerta para poblaciones bajas o superpuestas y para discriminar verdaderos positivos del ruido de fondo.
   NOTA: Los controles FMO deben realizarse durante la optimización inicial del panel para definir límites de compuerta precisos y confiables, especialmente en tejidos con alta autofluorescencia, como el cerebro. Si se modifican el panel de tinción, la configuración del instrumento o las condiciones experimentales, se deben repetir los controles FMO. Para experimentos posteriores que utilicen la misma configuración validada de panel y citómetro, los umbrales de activación previamente definidos se pueden reutilizar para garantizar la consistencia entre las réplicas biológicas.

7. Preparar y adquirir controles de isotipo

1. Tiña la muestra de control con anticuerpos de control de isotipo emparejados en fluorocromo y concentración con los anticuerpos de prueba.
2. Adquiera datos utilizando la misma configuración del citómetro.
3. Utilice controles de isotipo solo para evaluar la posible unión inespecífica, particularmente en el caso de marcadores intracelulares o anticuerpos mal caracterizados. No utilice controles de isotipo para la compuerta, ya que no reflejan la misma cinética de unión que los anticuerpos específicos.
   NOTA: Los controles de isotipo no son adecuados para la compuerta y no deben usarse para definir poblaciones. Su uso es opcional y debe reservarse para validar la especificidad de los anticuerpos en casos seleccionados.

8. Estrategia de activación de citometría de flujo

1. Cree los siguientes diagramas de puntos para la compuerta secuencial:
   FSC-A vs. SSC-A para excluir escombros
   FSC-A vs. FSC-H para seleccionar camisetas sin mangas.
   FSC-A vs. Amcyan (colorante de viabilidad) para controlar las células vivas.
2. Identifique la microglía como CD11b ⁺ CD45 ⁺ usando CD11b (FITC) frente a CD45 (AF700).
   NOTA: Debido a la etapa de desarrollo (P3-P15), el contexto inflamatorio y la digestión enzimática, TMEM119 y P2RY12 no fueron confiables para separar claramente la microglía de otras poblaciones mieloides mediante citometría de flujo. Por lo tanto, se utilizó la estrategia de activación CD11b ⁺ CD45 ⁺ , previamente validada en el cerebro postnatal, para identificar poblaciones de microglía y minimizar la contaminación. En condiciones de control, el rendimiento típico oscila entre 30.000 y 200.000 células microgliales por cerebro completo de P3 a P15. Para los experimentos que se centran específicamente en el cerebelo, el rendimiento promedio es de aproximadamente 5,000 células microgliales por cerebro.
3. Utilice los controles FMO para definir umbrales de acceso para marcadores de activación.
4. Identificar subpoblaciones de microglía basadas en la expresión de marcadores relacionados con el sistema inmunológico:
   CD80⁺ (Súper Brillante 436)
   CD86⁺ (PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. Caracterice aún más los subconjuntos de microglía mediante combinaciones de expresión de marcadores:
   CD206⁺ (APC)^{y luego Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE)^{y luego CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (Super Bright 600)^{y luego CD206+} (APC)
   NOTA: Las combinaciones de marcadores se utilizan para describir la heterogeneidad molecular dentro de la población microglial. Estos subconjuntos se informan basándose únicamente en la expresión de marcadores y no se les asignan roles funcionales específicos, de acuerdo con los estándares actuales que reconocen la plasticidad microglial y los fenotipos dependientes del contexto.
6. Cargar muestra experimental. Establezca FSC en 300 y SSC en 200. Utilice un caudal bajo y registre el número deseado de eventos.
7. Después de la adquisición, lave el citómetro y exporte los datos como . FSC para su análisis.
8. Analice los datos utilizando el software de citómetro de flujo.

9. Muestra de secuenciación de ARN unicelular

1. Utilizando el mismo protocolo de aislamiento celular descrito para la citometría de flujo (consulte el paso 1.14), vuelva a suspender las células disociadas en el tampón FACS. Utilice el tampón FACS en los tubos de recolección y en todos los pasos de manipulación posteriores para mantener la estabilidad celular.
2. No realice la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) si el objetivo es capturar todos los tipos de células de una región del cerebro. Sin embargo, si el experimento requiere enriquecimiento para la microglía, incluya un paso de clasificación FACS antes de la secuenciación.
3. Evalúe inmediatamente la viabilidad celular utilizando colorantes de viabilidad fluorescente estables en la mesa y azul de tripano (consulte la tabla de materiales). Cuente las células bajo un microscopio usando un hemocitómetro (consulte la Tabla de materiales).
4. Verifique que la suspensión celular muestre una viabilidad de al menos el 90% y ajústela a una concentración final de aproximadamente 1.000 células/μL antes de proceder con la secuenciación del ARN unicelular.
5. Mantenga todas las muestras en hielo y procese inmediatamente después de la disociación para minimizar el estrés celular y los cambios transcripcionales.
6. Multiplexar las muestras en pares siguiendo las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Se agruparon un macho y una hembra del mismo grupo experimental para reducir los costos experimentales.
7. Prepare las bibliotecas scRNAseq (consulte la tabla de materiales) y siga las pautas recomendadas por el fabricante.
   NOTA: La preparación de la biblioteca fue realizada por la Plataforma de Genómica del Instituto de Investigación en Inmunología y Cáncer (IRIC) de la Universidad de Montreal.
8. Secuenciar las bibliotecas scRNA-seq utilizando un sistema de secuenciación a una profundidad promedio de 3200 millones de lecturas por carril.
   NOTA: La secuenciación se realizó en Genome Quebec en Montreal.

10. Análisis de secuenciación de ARN unicelular

1. Realice un análisis de recuento de identificadores moleculares únicos (UMI) utilizando el software Cell Ranger de 10X Genomics (v8.0.0) con el genoma de referencia Mouse GRCm39 2024-A. Utilice el paquete Seurat R (v5.1) para el análisis posterior.
2. Llevar a cabo un control de calidad excluyendo las células con ARN mitocondrial que superen, por ejemplo, el 30% del ARN total (Figura 1A), o un umbral más estricto elegido para eliminar las células con estrés potencial. Filtre las células de baja calidad con log10GenesPerUMI superior a 0,75 (Figura 1B), recuentos de características únicas ("nUMI") por debajo de 500 y número de genes detectados por célula ("nGene") superior a 300 (Figura 1C). A continuación, elimine las gotas con el paquete "scDblFinder" en R. Con un gráfico de correlación de nUMI y nGene que muestra los umbrales, el efecto de filtrado ahora debería ser visible (Figura 1D).
3. Mitigue los efectos de los lotes identificando 2.000 genes altamente variables por muestra utilizando la función SelectIntegrationFeatures de Seurat.
4. Integre conjuntos de datos mediante el análisis de correlación canónica (CCA) y realice análisis de componentes principales (PCA) para reducir la dimensionalidad. Utilice la función RunPCA con 50 componentes principales (PC), escalando los datos y haciendo una regresión de las fuentes de variación no deseadas (por ejemplo, el contenido mitocondrial). Evalúe el número de PC retenidos en función del gráfico de codos y el análisis de JackStraw.
5. Visualice clústeres utilizando el algoritmo de aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP) a través de la función RunUMAP de Seurat. Identifique perfiles de expresión génica específicos del clúster con la función FindAllMarcadores . Anote grupos basados en firmas transcripcionales mediante referencias cruzadas de genes marcadores identificados con recursos de células individuales seleccionadas como PanglaoDB y CellMarker (Figura 2). Los tipos de células, incluida la microglía, se infieren a partir de estos perfiles transcriptómicos en lugar de un marcador de superficie predefinido.

11. Separación celular basada en el sexo

1. Identificar células masculinas y femeninas en función de la expresión de genes específicos del sexo: cuatro específicos de la mujer (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) y tres específicos del hombre (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. Clasifique las poblaciones masculinas y femeninas filtrando las células que expresan recuentos normalizados de UMI > 1 para cualquiera de estos genes utilizando la función Subconjunto de Seurat.
3. Genere objetos Seurat creando subconjuntos de celdas masculinas y femeninas por separado. Almacene y analice estos objetos de forma independiente para comparaciones posteriores.
4. Valide la clasificación visualizando la expresión génica específica del sexo utilizando las funciones FeaturePlot y VlnPlot , lo que garantiza una separación clara entre las poblaciones de células masculinas y femeninas.
   NOTA: Los pasos 12.1 y 12.2 deben realizarse sólo cuando la muestra se ha multiplexado mezclando un macho y una hembra.

12. Clasificación de microglía basada en modelos estadísticos

1. Cree cinco modelos estadísticos en R (bosque aleatorio, regresión logística, Bayes ingenuo, máquina de vectores de soporte, árbol de decisión) utilizando un conjunto de entrenamiento de ~ 1,000 celdas con etiquetas de grupo conocidas.
2. Evalúe el rendimiento del modelo utilizando curvas de validación cruzada y características operativas del receptor (ROC) de 10 veces (Figura 3). Identifique los genes clave que contribuyen a la clasificación utilizando la función FindAllMarkers en Seurat.
3. Seleccione el modelo con el área más alta bajo la curva ROC (AUC). El modelo de bosque aleatorio se seleccionó en función de su puntuación superior de AUC.
4. Aplique el modelo seleccionado a celdas no clasificadas utilizando la función predict del paquete R de RandomForest . Combine las clasificaciones predichas con conjuntos de datos previamente anotados en Seurat mediante merge.
5. Valide las clasificaciones visualizando la expresión génica de marcadores con FeaturePlot y VlnPlot. Para garantizar la consistencia de las identidades celulares predichas, evalúe los enriquecimientos del conjunto de genes marcadores que se superponen antes y después de agregar las células clasificadas con una prueba estadística adecuada (por ejemplo, la prueba exacta de Fisher).

13. Análisis diferencial de expresión génica de microglía

1. Realice análisis de expresión génica diferencial (DEG) entre dos grupos específicos de interés utilizando la función de Seurat "FindMarkers", con ident.1 representando el grupo de interés e ident.2 representando el grupo de referencia.
   NOTA: El resultado enumera los genes que se expresan diferencialmente en ident.1 en relación con ident.2. En este contexto, los genes regulados al alza son aquellos con mayor expresión en ident.1 en comparación con ident.2, mientras que los genes regulados a la baja muestran una menor expresión en ident.1. Sus comparaciones se utilizan para generar gráficos de volcanes e interpretar el cambio transcripcional específico de la condición.
2. Identifique genes expresados diferencialmente (DEG) con un valor P ajustado≤ 0,05. Para comparaciones entre dos grupos específicos, use la función FindAllMarkers con los siguientes criterios: genes expresados en al menos el 10% de las células (min.pct = 0,1) y un umbral de cambio de pliegue log2 de 0,25 (logfc.threshold=0,25). Para comparaciones de varios grupos en toda la microglía, use la función FindAllMarkers con los mismos parámetros. Los genes con un valor p ajustado ≤ 0,05 se consideran significativamente diferenciados. Para visualizar patrones de expresión DEG, genere un gráfico de volcán mediante la función integrada en el paquete EnhancedVolcano (Figura 4).
3. Compare los resultados de la citometría de flujo examinando primero los marcadores de citometría utilizados para encontrar microglía, específicamente CD45⁺ y CD11b⁺, que corresponden a los genes PtprceItgam. Confirme la expresión génica utilizando las funciones FeaturePlot en Seurat.
4. Evaluar los marcadores comúnmente asociados con distintos estados microgliales, incluidos CD80yNOS2, así como Mrc1, Arg1, Fcgr1 y CD163. Utilice las funciones de Seurat FeaturePlot y DotPlot para visualizar su expresión en los grupos de células.
5. Genere un diagrama de puntos utilizando la función DotPlot en Seurat para resumir expresiones de marcadores y validar la clasificación de la población.

Results

Este protocolo utiliza eficazmente la citometría de flujo para caracterizar las poblaciones de células microgliales en muestras de cerebro de ratón, basándose en la expresión de marcadores de superficie e intracelulares seleccionados. Las siguientes secciones detallan los resultados obtenidos de los pasos clave del flujo de trabajo, destacando la distribución y heterogeneidad de los subconjuntos de microglía en respuesta a las condiciones experimentales.

Validación de la estrategia de compensación y cierre
Se utilizaron perlas de compensación para calibrar las señales de fluorescencia y corregir la superposición espectral entre fluorocromos. Las poblaciones positivas y negativas para cada fluorocromo se separaron claramente, lo que permitió una generación precisa de matrices de compensación. Los umbrales de activación se validaron inicialmente utilizando el control Fluorescence Minus One (FMO) durante la optimización del panel para distinguir la señal real del fondo, particularmente para marcadores deficientes o superpuestos. Estos umbrales se reutilizaron posteriormente en experimentos utilizando el mismo panel de tinción y la misma configuración del citómetro para garantizar la consistencia. Se incluyeron controles de isotipo para monitorear la posible unión no específica, particularmente para marcadores intracelulares, pero no se utilizaron para tomar decisiones de compuerta.

Identificación de células microgliales
La estrategia de activación de células vivas/muertas (Amcyan) excluyó con éxito las células muertas. La estrategia de activación aisló eficazmente las poblaciones de células microgliales basadas en la expresión de CD45 (AF700) y CD11b (FITC). Los parámetros de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) se optimizaron (FSC = 300, SSC = 200) para centrar la población de microglía dentro del diagrama de puntos (Figura 5).

Fenotipado de células microgliales
El análisis de diagrama de puntos permitió la identificación de subpoblaciones de microglía basadas en la expresión diferencial de marcadores de superficie e intracelulares. Utilizando estrategias de activación específicas en el software FlowJo, se identificó un subconjunto de células microgliales que expresan CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) e iNOS (PE-eFluor 610) (Figura 6A). También se utilizó la doble compuerta para definir subconjuntos que expresan CD206 (APC) y Arg1 (PE-Cy7) (ver Figura 6B). Las poblaciones adicionales se caracterizaron por la coexpresión de CD86 (PE) y CD64 (PerCP-eFluor 710), así como CD163 (Super Bright 600) y CD206 (APC) (Figura 6C, D). Estos perfiles fenotípicos reflejan la heterogeneidad definida por marcadores dentro de la población de microglía y demuestran la capacidad de este protocolo para distinguir múltiples subconjuntos transcripcionales e inmunológicamente distintos sin inferir estados funcionales fijos.

Análisis unicelular de microglía
Se utilizó la aproximación y proyección de variedades uniformes (UMAP) para visualizar la heterogeneidad celular e identificar los grupos de células microgliales entre otros tipos de células cerebrales. Cada punto representa una sola célula y el grupo está codificado por colores según la similitud transcripcional (Figura 2).

Se realizó un análisis de expresión diferencial dentro del grupo de microglía para identificar genes modulados en condiciones experimentales. Los genes con un valor de p ajustado ≤ 0,05 se consideraron expresados diferencialmente.

Se generó un gráfico de volcán para visualizar estos genes expresados diferencialmente de las células microgliales, destacando aquellos con alto cambio de pliegue y significación estadística (Figura 4).

Para comparar el resultado de estas células individuales con los datos de citometría de flujo, se examinó la expresión de los marcadores de microglía CD45 y CD11b (Ptprc e Itgam). Un UMAP muestra su expresión dentro de diferentes poblaciones celulares (Figura 7).

Finalmente, se evaluó la expresión de marcadores relacionados con el sistema inmunitario seleccionados para caracterizar la heterogeneidad transcripcional entre las células microgliales. Un gráfico de violín muestra la expresión de genes como CD80 y NOS-, así como Mrc1, Arg1, Fcgr1 y CD163 a nivel de una sola célula (Figura 8). Estos patrones de expresión de marcadores permiten la comparación con perfiles basados en citometría de flujo y resaltan la diversidad molecular de los subconjuntos microgliales en condiciones experimentales.

Figura 1: Control de calidad de datos transcriptómicos unicelulares. (A) Distribución del contenido de ARN mitocondrial a través de las células. Se excluyeron las células con >30% de ARN mitocondrial para eliminar las células potencialmente estresadas o moribundas. (B) Las células con un log10GenesPerUMI > 0,75 se filtraron para garantizar una relación gen-UMI consistente y reducir el ruido de las bibliotecas de baja complejidad. (C) Las células con menos de 500 transcripciones detectadas (nUMI) o más de 300 genes detectados (nGENE) también se excluyeron para eliminar células múltiples o de mala calidad. (D) Gráfico de correlación de NUMI versus nGene que ilustra el impacto de los umbrales de filtrado. Se eliminaron los dobletes detectados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visualización UMAP de transcriptomas unicelulares. Gráfico UMAP que muestra la distribución de células individuales basadas en perfiles transcriptómicos obtenidos de dos animales individuales. Cada punto representa una celda, codificada por colores por identidad de clúster. El grupo de células microgliales se identifica entre otras poblaciones celulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Curva ROC del clasificador de Random Forest evaluado mediante validación cruzada. Curva de características operativas del receptor (ROC) que ilustra el rendimiento del modelo de bosque aleatorio utilizado para distinguir la microglía de otros tipos de células cerebrales en función de los perfiles de expresión génica. El modelo se entrenó en un conjunto de ~ 1000 celdas con etiquetas conocidas y se evaluó mediante validación cruzada de 10 veces. Entre los cinco modelos estadísticos probados (Random Forest, regresión logística, Bayes ingenuo, máquina de vectores de soporte y árbol de decisión), el modelo Random Forest logró el mayor rendimiento de clasificación. El área bajo la curva (AUC) refleja la precisión del modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis diferencial de expresión génica en células microgliales. Gráfico de volcán que representa el cambio log2 de pliegues frente al valor P ajustado para genes expresados diferencialmente en microglía entre los dos grupos experimentales (control frente a lesión cerebral cerebelosa). El gen regulado al alza se expresa más en el grupo de interés (ident.1), y los genes regulados a la baja muestran una expresión reducida en comparación con el grupo de referencia (ident.2). Los genes clave expresados significativamente diferencialmente están etiquetados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Estrategia de activación para la identificación de microglía mediante citometría de flujo. (A) Estrategia de activación aplicada a células cerebelosas de un ratón de control postnatal de día 3 (P3). (B) Se seleccionaron camisetas sin mangas para excluir dobletes. (C) Las células viables se identificaron utilizando un tinte de viabilidad; se excluyeron los eventos con bajo FSC-A para eliminar los desechos y garantizar el análisis de las células intactas. (D) La microglía se identificó como CD45⁺ y CD11b⁺ con dos poblaciones distintas: CD45 low-CD11b^int para microglía inactiva y CD45^int -CD11b^alto para microglía activada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Caracterización de perfiles de expresión de marcadores de microglía mediante citometría de flujo. (A) Activación secuencial de células CD45⁺ CD11b⁺ basada en la expresión de CD80, CD86 e iNOS. (B) Identificación de un subconjunto que expresa CD206, seguido de una activación basada en la expresión de Arg1. (C) Identificación de un subconjunto que expresa CD86, seguido de una activación basada en la expresión de CD64. (D) Identificación de un subconjunto que expresa CD163, seguido de una activación basada en la expresión de CD206. Estas estrategias de activación ilustran la heterogeneidad fenotípica de las poblaciones de microglía basadas en la expresión de marcadores de superficie e intracelulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Confirmación de la identidad de la microglía mediante la expresión de Itgam y Ptprc en datos de secuenciación de ARN unicelular. UMAP muestra el paisaje transcripcional de las células cerebelosas en P15, con la expresión génica de Itgam y Ptprc superpuesta a través de grupos. La coexpresión de estos marcadores mieloides canónicos apoya la identificación de poblaciones de microglía y se alinea con los marcadores utilizados en citometría de flujo, proporcionando una validación cruzada entre los análisis transcriptómicos y a nivel de proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Perfiles de expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario seleccionados en células microgliales identificadas mediante secuenciación de ARN unicelular. Los gráficos de violín muestran la distribución de la expresión génica para CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 y CD163 en células microgliales individuales. Estos marcadores se asocian comúnmente con procesos relacionados con el sistema inmunológico e ilustran la heterogeneidad transcripcional observada dentro de la población microglial. Se muestran datos para las condiciones de control y lesión cerebral cerebelosa (CBI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas para el aislamiento y la tinción de células neurales. Esta tabla proporciona una composición detallada de las soluciones necesarias para el aislamiento y la tinción celular, incluidas sus respectivas concentraciones y componentes. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Concentraciones de mezcla de anticuerpos para tinción extracelular. Esta tabla detalla las concentraciones de anticuerpos y la solución viva/muerta utilizada para la tinción extracelular, especificando los volúmenes y diluciones requeridos para cada anticuerpo en la mezcla de tinción para una muestra. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Concentraciones de mezcla de anticuerpos para tinción intracelular. Esta tabla detalla las concentraciones de anticuerpos utilizados para la tinción intracelular, especificando los volúmenes y diluciones requeridos para cada anticuerpo en la mezcla de tinción para una muestra. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

Este estudio presenta un protocolo detallado y optimizado que combina citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) para el aislamiento y caracterización de células microgliales durante el desarrollo cerebral postnatal temprano. Si bien la citometría de flujo sigue siendo una técnica rentable y accesible, su integración con la transcriptómica unicelular proporciona información complementaria al vincular la expresión de marcadores a nivel de proteína con perfiles transcripcionales a nivel de genes. El protocolo aborda los desafíos técnicos específicos del tejido cerebral inmaduro, incluida la disociación eficiente, la eliminación de desechos y mielina, y las estrategias optimizadas de inmunotinción, para garantizar la reproducibilidad y confiabilidad en el análisis de poblaciones microgliales en puntos clave de tiempo de desarrollo.

Se utilizó citometría de flujo para identificar subconjuntos microgliales basados en la expresión de marcadores intracelulares y de superficie seleccionados. En lugar de inferir estados funcionales, los subconjuntos se distinguieron por sus perfiles de expresión de marcadores, como CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ ; CD206⁺/Arg1⁺ ; Fenotipos CD86⁺/CD64⁺ o CD163⁺/CD206⁺ . Estas poblaciones definidas por marcadores reflejan la heterogeneidad molecular dentro del compartimento de la microglía y proporcionan un enfoque práctico para la caracterización de alto rendimiento. Si bien es posible que estas clasificaciones basadas en marcadores de superficie no capturen toda la complejidad de la diversidad de la microglía, siguen siendo informativas, especialmente en contextos donde es posible que no se disponga de herramientas moleculares de alta dimensión. Las clasificaciones binarias como el paradigma M1/M2 se han evitado deliberadamente, en reconocimiento de la naturaleza espectral y dependiente del contexto de los fenotipos microgliales, como se describe en la literatura reciente¹².

Estas observaciones son consistentes con estudios previos que destacan el papel de la microglía tanto en la maduración normal del cerebro como en la respuesta a estímulos ambientales o patológicos^13,14. La capacidad de diferenciar la heterogeneidad de la microglía ofrece información valiosa sobre cómo la polarización de las células microgliales puede contribuir a los trastornos del neurodesarrollo^15,16.

Aunque la secuenciación de ARN unicelular ofrece una mayor resolución y permite la identificación de subpoblaciones de células microgliales transcripcionalmente distintas, su costo y complejidad analítica limitan su accesibilidad. En el conjunto de datos actual recopilado en el día 15 postnatal después de la lesión perinatal, el pico de respuesta inflamatoria se resuelve en gran medida, lo que resulta en un bajo número de microglía activada. En consecuencia, las técnicas de reducción de dimensionalidad como UMAP no recuperaron subgrupos microgliales bien separados, y el análisis transcripcional a nivel de grupo no se incluyó en este manuscrito de protocolo.

Una innovación significativa de este protocolo es su optimización para aislar y caracterizar las células microgliales del cerebelo durante las primeras etapas postnatales (P3 a P30). Esta región y el contexto específico de la edad presentan distintos desafíos, incluido el bajo rendimiento celular, el contenido de mielina y el aumento de la fragilidad de los tejidos. Para abordar estas limitaciones, el protocolo integra un flujo de trabajo de disociación adaptado, eliminación eficiente de desechos y mielina, y condiciones de inmunotinción cuidadosamente ajustadas adecuadas para tejido cerebeloso de pequeño volumen. A pesar del creciente reconocimiento de la microglía cerebelosa como funcional y transcripcionalmente distinta de las de otras regiones del cerebro, los protocolos detallados para su aislamiento y análisis siguen siendo limitados. El método actual ofrece un flujo de trabajo confiable y accesible, especialmente diseñado para estudios de desarrollo de la microglía cerebelosa.

El objetivo principal de este manuscrito es proporcionar un marco metodológico reproducible y adaptable en lugar de informar sobre descubrimientos biológicos específicos. El flujo de trabajo es adecuado para la adaptación a otras etapas de desarrollo o modelos experimentales en los que los estados microgliales transcripcionalmente distintos pueden ser más prominentes. En tales contextos, la citometría de flujo sigue siendo una herramienta valiosa, especialmente cuando se integra con ensayos complementarios.

Una de las fortalezas clave de este protocolo es su adaptabilidad en varias etapas de desarrollo, que van desde el día postnatal 3 (P3) hasta el día postnatal 30 (P30). Esto permite el análisis longitudinal del fenotipo de la microglía a medida que avanza la maduración del cerebro. El uso combinado de citometría de flujo y scRNA-seq permite estudiar no solo marcadores de superficie, sino también vías de señalización intracelular y factores de transcripción involucrados en las células microgliales.

No obstante, la digestión enzimática puede afectar la expresión de algunos marcadores de superficie, lo que requiere una optimización cuidadosa de las condiciones de digestión para objetivos experimentales específicos^17,18. Además, ni la citometría de flujo ni la secuenciación unicelular proporcionan datos a nivel de población, que pueden no capturar completamente los matices espaciales y funcionales de las interacciones de las células microgliales dentro de su entorno nativo. La incorporación de técnicas espaciales unicelulares podría ayudar a abordar esta limitación al preservar el contexto espacial de las células microgliales. Los estudios futuros que combinen este protocolo con técnicas de imagen, como la inmunohistoquímica, las imágenes in vivo, el western blot o la transcriptómica espacial unicelular, podrían ofrecer información complementaria sobre la dinámica de las células microgliales.

Este método abre nuevas vías para investigar cómo las agresiones tempranas, como la inflamación, la hipoxia o los factores estresantes ambientales, influyen en los fenotipos de las células microgliales y contribuyen a los resultados del desarrollo neurológico a largo plazo. Al permitir una caracterización precisa y fiable de los estados de activación de las células microgliales, facilita la identificación de dianas terapéuticas para modular las respuestas microgliales en los primeros años de vida, con el objetivo de prevenir o mitigar los trastornos del neurodesarrollo.

En conclusión, este protocolo ofrece un marco sólido y accesible para estudiar la diversidad de células microgliales durante el desarrollo temprano del cerebro. La combinación de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular permite una aplicación flexible en varias etapas de desarrollo y modelos experimentales, lo que facilita una exploración más profunda de la biología de la microglía en contextos fisiológicos y patológicos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 µ M Filtro de malla metálica	Sigma-Aldrich	S3895
Tubo de 15 ml	Sarstedt	62.554.205
Tubo de 5 ml	Sarstedt	55.526.006
Placa de 96 pocillos con fondo cónico	Sarstedt	82.1583.001
Arginasa 1 - Conjugado Pecy7 - Clon: A1exF5	Thermo Fisher Scientific	25-3697-82
Reactivos fluorescentes estables en la mesa	Invitrogen	A49905
CD11b - Conjugado Fitc - Clon: M1/70	BD Pharmingen	553310
CD163 - Conjugado SB600 - Clon: TNKUPJ	Thermo Fisher Scientific	63-1631-82
CD206 - APC conjugado - Clon: C068C2	BioLeyenda	141708
CD45 - Conjugado A700 - Clon: 30-F11	BD Pharmingen	560510
CD64 - Conjugado PerCP-eF710 - Clonar : X54-5/7.1	Thermo Fisher Scientific	46-0641-82
CD80 - Conjugado SB436 - Clon: 16-10A1	Thermo Fisher Scientific	62-0801-82
CD86 - Conjugado Pe - Clon : GL-1	BioLeyenda	105008
Colagenasa D	Sigma– Aldrich	11088866001
ADNasa I	Sigma– Aldrich	10104159001
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma– Aldrich	F1051
HBSS (solución salina equilibrada de Hank) 10x	Wisent Bioproducts	311506CL
Hemocitómetro	vwr internacional	82030-470
HEPES	Wisent Bioproducts	330.050.EL
iNOS - Conjugado PE- eF610 - Clonar : CXNFT	Thermo Fisher Scientific	61-5920-82
Kcl	Thermo Fisher Scientific	BP366-500
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362-500
Amcyan vivo / muerto	Thermo Fisher Scientific	L34957
Medios de cultivo de células microgliales	Tecnologías de la vida	A12475-01
Na2HPO4	Thermo Fisher Scientific	BP332-500
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP358-212
Paraformaldehido	Sigma– Aldrich	P6148
Antirata antiratón CD16/CD32	BD Biosciences	553142
Saponina	Sigma– Aldrich	S7900
Bibliotecas scRNAseq	Genómica 10X	1000121
Medio coloidal a base de sílice	Thermo Fisher Scientific	45001747
Azida sódica	Thermo Fisher Scientific	BP922I-500
Azul de tripano	Gibco	1525006